CHCN-p qxp:5989_5672.qxd

Size: px

Start display at page:

Download "CHCN-p qxp:5989_5672.qxd"

胞安
5 years ago
Views:

1 3.2.2 气质联用篇应用 GC/MS 及安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库鉴定血浆中的代谢物应用通讯作者 Mine Palazoglu 和 Oliver Fiehn 加州大学戴维斯分校基因研究中心 Davis, CA 摘要气相色谱 / 质谱 (GC/MS) 联用技术可为代谢组学研究提供高分离能力和高灵敏度代谢组学筛选的效用很大程度上取决于被鉴定代谢物的数目并与其生物学解释有关通常, 最难的步骤是对这些代谢物进行鉴定最新的安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL( 保留时间锁定 ) 数据库正是专为简化代谢物鉴定而开发的一款数据库本文以人血浆样品为例阐释了复杂生物基体中代谢物的鉴定通过质谱解卷积和快捷灵活高通量的安捷伦 Fiehn 谱库检索匹配, 对常规的鉴定流程进行补充判断鉴定结果是否准确的一个最重要指标就是样品保留时间, 即通过与内标物 d27- 肉豆蔻酸的绝对保留时间进行锁定判断保留时间的一致性安捷伦 Fiehn 谱库特有的保留时间锁定技术增加了鉴定结果的可信度平均保留时间偏差小于 0.15 min, 更是增加了代谢物鉴定结果的可靠性和可信度正如 NIH/NIDDK 和代谢组学学会近期所建议的那样, 采取类似措施对化合物鉴定程序进行补充, 在代谢物鉴定报告的规范化过程中发挥着越来越重要的作用 1

2 引言即使使用现代仪器, 对复杂生物基体中小分子代谢物 ( Da) 的全面定性与定量, 即代谢组学, 依然是分析化学中极具挑战性的课题单一的方法无法完成此项任务例如, 萜烯类等强挥发性物质不能使用以液相色谱进行分析, 而必须使用气相色谱同样, 液相色谱比毛细管电泳 (CE) 技术更适于分离多酚类物质, 而二磷酸肌醇和三磷酸肌醇 ( 如糖酵解和卡尔文循环途径中 ) 最适合毛细管电泳分离然而, 这三种主要分离技术的任意一种都能对一系列不同种类化合物进行并行检测及定量, 特别是当采用质谱进行准确灵敏的检测时, 更是如此 GC/MS 可为代谢组学研究提供高分离能力和高灵敏度尽管分离机制有很大不同, 但各主要分离方法所能鉴定的化合物种类有很大重叠而高重叠度 ( 即使与核磁共振技术相比 ) 的内在原因在于这些丰富的代谢中间产物所具有的固有特性复杂生物基体中各种代谢物的浓度差异很大, 在提取时必须保证各物质结构的完整性和相对丰度的一致性然而, 不同物种 ( 比如小白鼠大白鼠和人, 甚至亲缘关系更远的哺乳动物鸟类和酵母菌之类的简单的真核生物 ) 之间的核心代谢途径在设计上是高度相似的这些固有的代谢途径有助于满足生物体共同的代谢需求, 比如氧化碳源以获取能量, 或者相反地, 利用碳水化合物氨基酸和脂肪酸合成蛋白质复合脂类和能量存储的生物高分子如糖原和脂肪, 用于细胞生长随后可根据生物体内分解代谢和生物合成途径的活性来解释各固有中间代谢产物的相对丰度因此, 代谢组学筛选的效用很大程度上取决于被鉴定代谢物的数量以及其相关的生物学解释本文使用一种溶剂混合物实现蛋白质的沉淀和提取, 随后进行化学衍生化 GC/MS 分析谱图解卷积数据处理, 再通过对一系列代谢产物列表进行验证, 鉴定了人血浆中的代谢物, 并演示了外部化学及生物学数据库的相关应用实验于中午 12:00 至下午 3:00 采集志愿者血液, 并在 15 min 内离心去除血小板整个过程样品均用冰冷却, 随后冻于 -80 C 样品初次解冻后分为若干等份待 GC/MS 分析量取 30 µl 血浆, 加入 1 ml 单一相混合提取液 ( 异丙醇 : 乙腈 : 水 3:3:2, v/v), 于 20 C 提取 5 min 离心后, 量取 0.5 ml 上清液于试管中, 置于 SpeedVac 浓缩器中充分浓缩至干之后, 通过以下两个步骤进行样品的衍生化反应首先, 向试管中加入 10 µl 浓度为 40 mg/ml 的甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液, 于 30 C 放置 90 min 进行甲基肟化反应, 以保护羰基然后, 为增强化合物的挥发性, 加入 90 µl 含有 1 % 三甲基氯硅烷的 N- 甲基三甲基硅三氟乙酰胺溶液 (MSTFA + 1% TMCS, Pierce) 于 37 C 环境中静置 30 min 进行衍生化衍生化步骤使得醛类和酮类化合物在检测结果中出现两个色谱峰 : 即顺式和反式异构体, 例如葡萄糖 1 和葡萄糖 2 GC/MS 条件如下 :6890 GC 柱温箱从 60 C 以 10 C/min 速率升至 325 C( 含启动时间 1 min 和最终平衡时间 10 min), 整个过程共 37.5 min, 再冷却至 60 C 用 10 µl 进样针, 采用分流 / 不分流进样口, 进样体积为 1 µl, 进样口温度为 250 C, 每次进样泵取 4 次, 进样前后都用溶剂 A 和溶剂 B 洗针, 洗针次数分别为 1 次和 2 次使用高柱塞速度, 无粘度延迟和驻留时间样品采用不分流和分流进样不分流进样 : 氦气吹扫流速 10.5 ml/min, 吹扫时间 1 min(8.2 psi) 气体节省装置打开, 气体流速 20 ml/min, 保持 3 min 所用色谱柱为长 29 m 配有 10 m Duragard 预柱的 DB5-MS 色谱柱, 内径 0.25 mm, 膜厚 0.25 µm 载气为氦气, 恒定流速 1 ml/min 质量选择检测器 (MSD) 的信号数据速率设为 20 Hz, 管线温度 290 C 5.90 min 的溶剂延迟时间过后, 打开四极杆质谱, 扫描范围为 u 离子源温度设为 230 C, 四极杆温度设为 150 C 数据采集前, 先根据仪器操作手册用 FC43 对 MSD 进行自动调谐分流进样时, 除将分流比设为 1:10, 分流速率设为 10.3 ml/min 外, 其他参数设置与上述相同利用安捷伦化学工作站的 RTL 系统锁定内标物 d27- 肉豆蔻酸绝对保留时间保留时间的锁定减少了各次运行之间的保留时间变异采用安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库 (2008 年 6 月版 ) 进行代谢物的鉴定该数据库是目前市场上最全面的代谢物 GC/MS 谱库, 包含了约 700 种常见代谢物的可检索 GC/MS EI 谱图及保留时间数据 2

结果本实验对一位正在参与药物遗传学实验项目的 22 岁女性志愿者的两份血浆样品进行了代谢物检测, 两份样品抽取时间间隔为 4 周该项目旨在通过评估个体患者的代谢状态以预测治疗措施的效果分别利用不分流和分流方式进样后, 对血浆样品进行 GC/MS 分析血浆的主要成分为葡萄糖, 有时候也称作血糖, 人体内的血糖浓度保持在 5mM 左右, 为人体各器官特别是大脑提供所需能量

3 结果本实验对一位正在参与药物遗传学实验项目的 22 岁女性志愿者的两份血浆样品进行了代谢物检测, 两份样品抽取时间间隔为 4 周该项目旨在通过评估个体患者的代谢状态以预测治疗措施的效果分别利用不分流和分流方式进样后, 对血浆样品进行 GC/MS 分析血浆的主要成分为葡萄糖, 有时候也称作血糖, 人体内的血糖浓度保持在 5mM 左右, 为人体各器官特别是大脑提供所需能量其他预期的含量较高的代谢物包括游离胆固醇, 饱和游离脂肪酸和一系列氨基酸, 特别是作为骨骼肌与肝脏之间三碳载体的丙氨酸不同临床实验室之间血浆提取方法的不统一可能导致分析结果的偏差一些倾向于用 EDTA 抗凝, 而另一些则喜欢用肝素或柠檬酸盐为得到准确的分析结果, 必须控制抗凝剂的使用美国国家卫生研究院正致力于制订最佳方法标准文件以规范和协调众多方法然而, 目前还没有相关文件发布样品经 1:10 分流进样后, 利用安捷伦化学工作站软件可检测到许多丰度峰扣除本底后利用 NIST MS 检索或化学工作站 PBM 查询将质谱结果与安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库进行相似度比对, 结果在保留时间和 min 轻松鉴定出丙氨酸柠檬酸葡萄糖和胆固醇 ( 图 1) 即使未进一步净化, 这些化合物质谱图通过 PBM 和 NIST MS 搜索, 其质谱匹配因子分别能达到 90 和 900 以上质谱图中柠檬酸盐的丰度很高而缺少 EDTA 峰, 表明临床采血后加入了柠檬酸盐进行抗凝, 这使得内源性柠檬酸盐的测定变得不可能安捷伦 Fiehn 谱库中包含由美国标准与技术研究院研发的用于 GC/MS 鉴定的自动质谱解卷积 (AMDIS) 程序, 可对低丰度化合物进行分析质谱解卷积程序可以自动寻找色谱峰, 并使用最能描述特征峰的典型示踪离子从共提物中解卷积谱图, 之后在用户定义的质谱库中进行相似度匹配, 使搜索变得快速简便图 1. 甲基肟化及三甲基硅醚化处理后进行 GC/MS 分析和安捷伦 Fiehn 数据库匹配的人血浆代谢物鉴定结果中图 : 总离子流图, 分流比 1:10 上图 l: 使用安捷伦化学工作站中的 PBM 快速检索得到的胆固醇鉴定结果下图 : 使用 NIST MS 检索及保留时间信息得到的葡萄糖 2 鉴定结果 3

显然, 质谱峰数量与解卷积谱图质量取决于样品色谱图的复杂性及 AMDIS 的设置系统中并没有优化好的 AMDIS 设置用户必须先将分辨率灵敏度和峰形设置为中等, 利用两个相邻峰进行本底扣除 ( 图 2), 之后根据检测到的假阳性和假阴性峰来评估结果的优劣图 2. 质谱解卷积的 AMDIS 设置图 3.

然后通过比对二者保留时间的差异缩小了命中范围, 最后对匹配的质谱峰进行人工验证, 鉴定出血浆样本中的 102 个峰 ( 表 1) 在约 90 % 的情况下,AMDIS 峰列表中匹配度最高的峰是正确的色谱峰在图 3 中, 以两种有机酸 ( 衣康酸和柠康酸, 检测信噪比分别为 319 和 172) 为例说明了这种自动匹配程序当对比离子 m/z 73, 147, 215 的丰度时,

利用安捷伦 Fiehn 数据库中候选代谢物和测定代谢物的保留时间差异可轻易将错误的鉴定结果区分出来 ( 图 4) 然而, 不分流进样时, 必须考虑到一种情况 : 由于气流条件的改变, 9 min 之前洗脱的代谢物会比预期中出峰时间晚 0.4 min, 这是由于 1:10 的分流条件所造成的 ( 图 4) 在几乎所有情况下, 鉴定出的质谱峰其保留时间差异都在 0.

4 显然, 质谱峰数量与解卷积谱图质量取决于样品色谱图的复杂性及 AMDIS 的设置系统中并没有优化好的 AMDIS 设置用户必须先将分辨率灵敏度和峰形设置为中等, 利用两个相邻峰进行本底扣除 ( 图 2), 之后根据检测到的假阳性和假阴性峰来评估结果的优劣图 2. 质谱解卷积的 AMDIS 设置图 3. 人血浆中衣康酸和柠康酸尽管谱图相似 ( 下图 ), 保留时间相近, 但仍可得到鉴定 ( 上图中的红色标记峰 ) 在分流进样和不分流进样时, 通过改变中等高特高设置时发现, 不同设置对检测的峰数量有影响, 但对样品中检测到的代谢物数量影响不大综合各方法之后, 采用不分流方式进样, 首先将解卷积后的谱图与安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库谱图进行匹配, 然后通过比对二者保留时间的差异缩小了命中范围, 最后对匹配的质谱峰进行人工验证, 鉴定出血浆样本中的 102 个峰 ( 表 1) 在约 90 % 的情况下,AMDIS 峰列表中匹配度最高的峰是正确的色谱峰在图 3 中, 以两种有机酸 ( 衣康酸和柠康酸, 检测信噪比分别为 319 和 172) 为例说明了这种自动匹配程序当对比离子 m/z 73, 147, 215 的丰度时, 这两种酸的质谱图非常相似并且其洗脱时间极为相近 ( 相差约 5 s) 尽管相似度很高, 应用低丰度离子和保留时间差异仍可准确鉴别这些不常见的酸在另外一些情况下 ( 约 10% 质谱峰 ), 当正确代谢物的谱图的匹配度仅比它其中一个异构体略低时, 代谢物的鉴定就必须依赖于保留时间的微小差异了这种情况在糖类和糖醇类化合物中时有发生, 比如葡萄糖果糖核糖及核糖醇不过绝大多数情况下, 利用安捷伦 Fiehn 数据库中候选代谢物和测定代谢物的保留时间差异可轻易将错误的鉴定结果区分出来 ( 图 4) 然而, 不分流进样时, 必须考虑到一种情况 : 由于气流条件的改变, 9 min 之前洗脱的代谢物会比预期中出峰时间晚 0.4 min, 这是由于 1:10 的分流条件所造成的 ( 图 4) 在几乎所有情况下, 鉴定出的质谱峰其保留时间差异都在 0.15 min 以内当保留时间的差异大于 0.15 min 时, 尽管谱图有很高的相似度, 鉴定结果很有可能是错误的, 如苏丁醇苏丁醇的异构体赤藓醇并没有被收录到 2008 版的安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库中图 4. 测得的保留时间与 Fiehn 库中保留时间的偏差左图 :1:10 分流比进样 ( 用于生成数据库谱图 ) 右图 : 不分流进样蓝色棱形 : 保留时间锁定化合物 d27- 肉豆蔻酸空棱形 : 苏丁醇, 可能被错误鉴定, 因保留时间漂移 > 0.15 min 洗脱时间 < 9 min 的代谢物保留时间漂移 ( 右图 ) 的原因是分流进样和不分流进样时载气流速的改变 4

5 名称 CAS PubChem MSnet RT RT (lib) RT-RT(lib) 纯度 m/z S/N m/z 4- 羟脯酸 % 丙氨酸 % β- 氰基 - L - 丙氨酸 % 肌酸酐 % 胱氨酸 % ε- 己内酰胺 % 谷氨酸 % 谷氨酸 % 谷氨酸 3 ( 氧代脯氨酸 ) % 谷氨酰胺 % 甘氨酸 % 异亮氨酸 % 亮氨酸 % 亮氨酸 % L- 甲硫氨酸 % 赖氨酸 % 鸟氨酸 % 苯丙氨酸 % 脯氨酸 % 脯氨酸 % 丝氨酸 % 丝氨酸 % 苏氨酸 % 色氨酸 % 酪氨酸 % 尿素 % 缬氨酸 % 缬氨酸 % 羟基吡啶 % 吲哚乙酸 % 吲哚乙酸 % 羟基苯甲酸 % 羟基烟酸 % 苯 -1,2,4- 三醇 % 苯甲酸 % 咖啡酸 % 烟酸 % 对甲酚 % 吡啶甲酸 % 邻苯三酚 % 尿酸 % 阿拉伯糖醇 % 果糖 % 果糖 % 岩藻糖 % 葡萄糖 % 葡萄糖 % 甘油 % 甘油 1- 磷酸 % 乙醇酸 % 异麦芽糖 % 来苏糖 % 麦芽糖 % 表 1. 应用保留时间锁定和不分流进样四极杆 GC/MS, 结合 AMDIS- 安捷伦 Fiehnlib 查询对血浆中 102 种化合物的鉴定结果未完全衍生的化合物会产生多种衍生物类型, 由化合物名称后加等数字表示该表由 AMDIS 中的生成报告选项生成 5

6 名称 CAS PubChem MSnet RT RT (lib) RT-RT(lib) 纯度 m/z S/N m/z 麦芽糖 % 肌醇 % 糖 ( 二 ) 酸 % 蔗糖 % 苏糖醇 % 癸酸甲酯 C % 甘二烷甲酸甲酯 C % 二十烷酸甲酯 C % 二十六烷酸甲酯 C % 月桂酸甲酯 C % methyl linocerate C % 肉豆蔻酸甲酯 C % 二十八酯甲酯 C % 棕榈酸甲酯 C % 壬酸甲酯 C % 硬脂酸甲酯 C % 肉豆蔻酸 d C14 RTL % 花生酸 % 山嵛酸 % 癸酸 % 辛酸 % 十七烷酸 % 月桂酸 % 亚油酸 % 肉豆蔻酸 % 油酸 % 棕榈酸 % 棕榈油酸 % 庚二酸 % 硬脂酸 % 羟基癸酸 % 十六醇 % 糠酸 % 羟基丁酸 % 酮己酸 % 己二酸 % α 酮戊二酸 % 柠康酸 % 柠檬酸 % 甘油酸 % 衣康酸 % 乳酸 % 磷酸 % 丙酮酸 % 琥珀酸 % 反式乌头酸 % 乙二酸 % 维生素 E % 胆固醇 % 接表 1 6

进一步研究鉴定结果发现, 信噪比和峰纯度共氨基化合物羟基酸碳水化合物同决定了血浆代谢物质谱峰的最终数据库匹配和脂肪酸和脂肪醇中每一类别都含有度 ( 图 5) 当信噪比超过 100 时, 所有峰与安 15 种或 15 种以上的特征峰 ( 图 6), 在氨基捷伦 Fiehn 数据库中谱图的匹配值都可达到酸和其他含氨基的化合物中所具有的特征峰数 80 以上对于峰纯度,

7 进一步研究鉴定结果发现, 信噪比和峰纯度共氨基化合物羟基酸碳水化合物同决定了血浆代谢物质谱峰的最终数据库匹配和脂肪酸和脂肪醇中每一类别都含有度 ( 图 5) 当信噪比超过 100 时, 所有峰与安 15 种或 15 种以上的特征峰 ( 图 6), 在氨基捷伦 Fiehn 数据库中谱图的匹配值都可达到酸和其他含氨基的化合物中所具有的特征峰数 80 以上对于峰纯度, 总趋势为质谱峰纯度越目会更多 ( 比如尿素 ) 该特征峰的数目表明高, 匹配度越好然而, 这种峰纯度的相关性 GC/MS 可以分析和鉴定血浆中几乎所有主要类趋势并没有像信噪比那样明确清晰的关联和阈别的主要代谢物值范围随后根据主要化学基团将鉴定出的 102 种代谢物归类到甾醇类和芳香族化合物图 5. 鉴定代谢物的质谱匹配度相关性左图 :AMDIS 解卷积后质谱的纯度右图 : 定量离子的信噪比安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库的搜索结果不仅能够用于鉴别代谢物, 而且能够提供化合物的识别码, 即 PubChem 号码利用该识别码可进行代谢物相关的生理学和生物化学信息检索这对于一些非常见化合物非常有用, 如衣康酸当用户用 PubChem 号码 ( 安捷伦 Fiehn 数据库中每种化合物名称前面括号中的编码 ) 进行查询时,PubChem 网站会提供关于其生物化学代谢途径数据库 KEGG 的链接 ( 图 7) 打开相关链接,KEGG 会提供化合物涉及的酶及代谢途径的信息例如衣康酸酯的 C5- 支路二元酸代谢机制, 该机制同时包含柠康酸和衣康酸 ( 图 3 中的鉴定结果 ), 根据鉴定结果推导出柠康酸和衣康酸丰度受柠苹酸调控的假设当利用 KEGG 途径进行人血浆代谢物的查询时, 不应将查询范围局限在人类的代谢途径, 这一点非常重要, 因为多种微生物会将其代谢物分泌到人类血管系统, 并且会有许多外源性化合物随人类的饮食而被摄入 ( 比如, 植物源性化合物 ) 因此, 化合物的高度多样性和血浆代谢物鉴定结果的复杂性是可以预期的这就是血浆代谢物谱图中仍有很多质谱峰有待鉴定的原因图 6. 鉴定出的血浆代谢物的类别组成 7

结论本文在人血浆代谢物的分析过程中应用了最新的安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库例行鉴定程序结束后, 通过 AMDIS 质谱解卷积和样品谱图在安捷伦 Fiehn 谱库中进行快捷灵敏高通量检索匹配, 对鉴定结果进行确证判断鉴定结果是否准确的一个最重要的标准就是保留时间的一致性该保留时间与内标物 d27- 肉豆蔻酸的绝对保留时间锁定安捷伦 Fiehn

8 结论本文在人血浆代谢物的分析过程中应用了最新的安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库例行鉴定程序结束后, 通过 AMDIS 质谱解卷积和样品谱图在安捷伦 Fiehn 谱库中进行快捷灵敏高通量检索匹配, 对鉴定结果进行确证判断鉴定结果是否准确的一个最重要的标准就是保留时间的一致性该保留时间与内标物 d27- 肉豆蔻酸的绝对保留时间锁定安捷伦 Fiehn 数据库特有的保留时间锁定功能增加了鉴定结果的可靠性保留时间偏差小于 0.15 min, 更增加了代谢物鉴定结果的可靠性和可信度正如 NIH/NIDDK 和代谢组学学会所建议的那样, 采取类似措施对化合物鉴定程序进行补充, 在代谢物鉴定报告的规范化过程中发挥着越来越重要的作用参考文献 : Sumner LW, Amberg A, Barrett D, Beger R, Beale MH, Daykin C, Fan TWM, Fiehn O, Goodacre R, Griffin JL, Hankemeier T, Hardy N, Higashi R, Kopka J, Lindon JC, Lane AN, Marriott P, Nicholls AW, Reilly MD, Viant M (2007) Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics 3, 图 7. 根据 PubChem 号码查询被鉴定代谢物的相关生物学信息 Castle LA, Fiehn O, Kaddurah-Daouk R, Lindon JC (2006) Metabolomics standards workshop and the development of international standards for reporting metabolomics experimental results. Brief. Bioinformatics 7, Halket JM, Przyborowska A, Stein SE, Mallard WG, Down S, Chalmers RA (1999) Deconvolution gas chromatography mass spectrometry of urinary organic acids - Potential for pattern recognition and automated identification of metabolic disorders. Rapid Comm. Mass Spectrom. 13, 安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库产品说明书 2008 年 5 月, 安捷伦文献 : EN G1676AA 安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库 : 化合物清单 2008 年 6 月安捷伦文献 : EN 安捷伦 G1676AA 安捷伦 Fiehn GC/MS 代谢组学 RTL 数据库使用指南 2008 年 6 月, 安捷伦出版号 :G 本文仅限研究使用, 不可用于诊断目的文中涉及的信息说明和指标, 如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技公司对本资料中出现的错误, 以及由于提供使用本资料所造成的意外或间接损害不承担责任安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 4 月 1 日, 中国印制 CHCN 8

结果与讨论

结果与讨论金青哲谢峰丁志华施峰华王兴国利用碳同位素比值法进行花生油和玉米油掺合物的检测研究用气相色谱仪获得转化途径的玉米油和转化途径的花生油的脂肪酸组成再用气相色谱燃烧同位素比值质谱仪确定三种主要脂肪酸的值利用所测得的数据构建了玉米油与花生油混合油中主要脂肪酸的值混合比例的标准曲线结果表明玉米油与花生油的值差异很大应用试验中将花生油与一种未知的其他植物油进行掺和