环境暴露指个体在一生当中所有化学暴露的总和, 包括外源性 ( 食物 污染物 电离辐射 药物 生活方式和感染等 ) 和内源性 ( 人和微生物群的新陈代谢 氧化应激 脂质过氧化 传染病和已存在的疾病等 ) 两种来源 如此来看, 暴露组包括一切 非基因组, 即囊括所有的传统组学方法 [5] 图 1 说明了

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1 利用血液暴露组学研究来发现疾病起因 技术概述 作者 Stephen M. Rappaport 博士暴露生物学中心加州大学伯克利分校 Anthony Macherone 博士安捷伦科技有限公司访问学者, 约翰霍普金斯大学医学院 前言 2010 年全世界有 5280 万死亡病例, 其中约有三分之二是由慢性疾病引发, 主要包括心血管疾病 (> 1500 万 ) 和癌症 (> 700 万 )[1] 因此, 我们应该查明慢性疾病主要是由遗传因素 环境暴露所致, 还是基于两者的某种联合作用 由瑞典家庭癌症数据库汇编的数据显示,15 种常见癌症的遗传 (G) 风险为 10% 或更低 [2] 这就表明大约 90% 的致癌风险来自环境暴露 (E) 或 G E 相互作用 当然, 除了悬浮颗粒物 吸烟和一些营养物质以外, 主要的致癌环境暴露因素尚不明确 尽管癌症和其他慢性疾病的遗传风险都相对较小, 我们还是可以使用精妙的手段在人类疾病研究中探讨 G 因素的影响 事实上, 全基因组关联分析研究 (GWAS) 当前已测试出 个受试者 100 多万个单核苷酸多态性 相比之下, 个体环境暴露的影响推测还与一个世纪之前的做法相同, 来自于个人专访或自填问卷调查 [3] G 和 E 特性的表征差异使我们无法对 GxE 的综合作用进行彻底研究, 因此, 必须开发一种用于环境暴露研究的数据导向分析的技术和方法 [4]

2 环境暴露指个体在一生当中所有化学暴露的总和, 包括外源性 ( 食物 污染物 电离辐射 药物 生活方式和感染等 ) 和内源性 ( 人和微生物群的新陈代谢 氧化应激 脂质过氧化 传染病和已存在的疾病等 ) 两种来源 如此来看, 暴露组包括一切 非基因组, 即囊括所有的传统组学方法 [5] 图 1 说明了暴露组在人类健康和疾病状态连续图中的定位 图 1. 暴露对人类慢性疾病的影响 用于发现和定位暴露源的两阶段策略 通过重点关注人体中循环的所有化学物质, 血液暴露组促进了慢性疾病非遗传病因的研究, 与通过 GWAS 研究遗传原因的方式相同 [6,7,4] 为此, 加州大学伯克利分校暴露生物学中心主任 Stephen M. Rappaport 介绍了利用血液暴露组来研究病患及其对照组中重要暴露的两阶段方法, 然后从大量人群的后续研究中确定这些暴露 [7] 2

3 Rappaport 教授发现暴露组涉及人体血液中大概 20 万种循环化学物质, 包括金属 小分子化合物 蛋白质和外源性 DNA 通过比较患病和健康受试者非目标血液暴露组的分析结果, 他建议通过暴露组关联分析研究 (EWAS) 来查明具有特征性的化学物质 [7] 在独立的病例和对照样本中鉴定出这些关键化学物质, 并在验证了它们与疾病的相关性之后, 便可在大量人群血液的目标性分析中将这些化学物质用作暴露或疾病恶化的生物标记物 因此, 用于发现和减少有害暴露的一个成功策略就是要进行原始数据导向的分析研究 (EWAS), 发现有前景的生物标记物, 随后通过知识导向研究, 利用这些生物标记物来阐明暴露 - 响应的关系 ( 生化流行病学 ) 暴露和人体动力学的来源 ( 暴露生物学 ), 以及作用机制 ( 系统生物学 ) Rappaport 教授强调该两阶段策略将有利于减少有害暴露 改善公共健康 疾病早期诊断, 以及个体化医疗干预措施 图 2 说明了 EWAS 的两阶段策略, 随后是目标性研究 1 EWAS 图 2. 两阶段 EWAS 目标性分析策略可鉴定和减少有害暴露 3

4 测定暴露组 我们必须迎接巨大的技术挑战来实现 EWAS 和后续研究要求的极端复杂多成分 高灵敏度和高通量分析的必要结合 取数百名受试者每人 µl 血液 血清或血浆来进行非目标性 EWAS 研究, 再从数千受试者中取相同体积的血液或血清进行生物标记物的目标性分析 许多 EWAS 的相关分析平台使用了高分离度液相色谱 (LC) 或气相色谱 (GC), 联用具有优异检测灵敏度和质量准确度的飞行时间 (TOF) 质谱 (MS) 随后使用机器人和带有多反应监测的三重四极杆质谱对有前景的生物标记物进行研究 通过从前瞻性群组研究中严格选取生物样本, 能够使疾病恶化生物标记物与暴露相关的生物标记物区分开来 S. Rappaport, Biomarkers, 2012, 17(6), 48: 3-9 图 3. 血液 EWAS 可以区分暴露生物标记物 ( 因果途径 ) 和疾病生物标记物 ( 反应途径 ) 概念验证研究已经鉴定出结肠直肠癌和心血管疾病暴露的未知生物标记物, 以及糖尿病恶化的生物标记物 [7] 4

5 分析策略 很明显, 纳流型液相色谱 / 飞行时间质谱仪和液相色谱 / 三重四极杆质谱, 以及气相色谱 / 飞行时间质谱仪 气相色谱 / 三重四极杆质谱等专用平台, 对于保证数据导向的 EWAS 和目标性 高通量的后续研究的高灵敏度和精度是必不可少的 为此,Ivanisevic 和 Zhu 等人 (2013) [8] 报告了非目标性分析中从单一 100 µl 血清或血浆样品中测定超过 个独特特征的能力, 方法采用反相液相色谱和亲水作用色谱 (HILIC), 质谱采用正离子和负离子电喷雾模式 分析方法采用 Agilent 1200 系列液相色谱系统和 Agilent 6538 UHD 精确质量四极杆 - 飞行时间液质联用系统, 该方法也可用于小分子的 EWAS 研究 图 4. Agilent 1200 系列液相色谱系统和 Agilent 6500 系列精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统 另一个相关的分析方法涉及改进 Agilent-Fiehn 气质联用方法 [9], 包括 Agilent 7890B 气相色谱和 Agilent 7200 四极杆 - 飞行时间系统, 用于研究甲氧胺盐酸盐和 MSTFA 衍生的血清提取物 在后采集加工过程中, 可使用已收录了超过 1000 个化学条目的安捷伦保留时间锁定谱库对未知特征进行标注 这些数据可以独立使用, 或者正交印证液质联用仪数据 5

6 图 5. Agilent 7890A 气相色谱联用 Agilent 7200 四极杆 - 飞行时间系统 一旦对生物相关的生物标记物进行了标注和验证, 我们就需要采用目标性高通量分析来测定相关暴露的生物标记物和疾病恶化的生物标记物 这种目标分析的一个相关实例涉及内分泌干扰物的测定, 方法采用 Agilent 7890B 气相色谱和 Agilent 7000C 系列三重四极杆质谱系统 [10] 安捷伦气质联用系统类似的应用已在临床实验室开展, 可在极低浓度水平下, 测定乳腺癌研究中的雌激素生物标记物 ( 例如,17b- 雌二醇可在 0.12 pg/ml (4.4E -7 µm) 的浓度下被检测 )[11] 数据一旦收集完毕, 我们就需要采用复杂的生物信息学软件来比较整个人群的生物标记物水平, 并研究其协变量 Agilent Mass Profiler Professional (MPP) 软件拥有先进的统计分析和可视化工具, 用于气质联用仪 液质联用仪 毛细管电泳仪 / 质谱 电感耦合等离子体质谱仪的数据分析, 可用来鉴定关键特征并进行全球分析 分析人员可进一步采用 Pathway Architect 工具将这些特征定位到相关生物学途径 活性亲电试剂 活性亲电试剂代表了一类重要的毒性化学物质, 它们产生于异型生物质和内源性前体分子的新陈代谢 氧化应激和脂质过氧化 [12] 虽然这些亲电试剂的活性过强, 不能在血液中直接被检测, 但是可以通过测定它们与血液中大量蛋白质如人血清白蛋白 (HSA) 反应得到的加合物来推测其浓度 Rappaport 教授的实验室已经推荐了非目标性质谱方法, 作为 EWAS [13] 的一部分, 用于在亲核位点 Cys34 分析 HAS 加合物, 还可用于采用高分辨质谱鉴定突出特征 [14] 6

7 Y X Z 图 6. 采用 ANOVA 结果的 PCA 分析,Mass Profiler Professional 根据气相色谱 / 飞行时间质谱数据说明了不同化学型的分离 结论 暴露组学是一个在开放环境下的协作范例, 它将流行病学 环境毒理学 分析化学 营养学和微生物学结合在一起 由于暴露组学应用多种分析技术 ( 色谱 光谱测定法 光谱和传感器阵列技术 ) 和生物信息学来表征个体的暴露组, 它需要开发创新技术来满足高分辨率 高灵敏度和高通量 EWAS 和后续研究的要求 暴露组研究的现状与上世纪九十年代初的基因组学研究类似 通过遵循一定目标整合某些组学技术 ( 金属组学 代谢组学 蛋白组学和宏基因组学 ), 暴露组学这一新兴领域的研究能很好地揭示疾病发生的缺失环节, 并开展个体化医疗 7

8 参考文献 1. R. Lozano, et al. (2012) "Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010" The Lancet 380(9859): K. Czene, P. Lichtenstein, K. Hemminki (2002) Environmental and heritable causes of cancer among 9.6 million individuals in the Swedish Family-Cancer Database Int. J. Cancer 99(2): B.K. Armstrong, et al. (1992) "Principles of Exposure Measurement in Epidemiology" Oxford Med. Pubs 4. National Institutes of Health (2012) The individual exposome project Retrieved October 7, 2013 from: 5. J. Pleil (2012) Categorizing biomarkers of the human exposome and developing metrics for assessing environmental sustainability J. Toxicology and Environmental Health, Part B 15: S.M. Rappaport, and M. T. Smith (2010) "Environment and disease risks" Science 330(6003): S.M. Rappaport, (2012) "Biomarkers intersect with the exposome" Biomarkers 17(6): J. Ivanisevic, et al. (2013) "Toward Omic Scale Metabolite Profiling: A Dual Separation Mass Spectrometry Approach for Coverage of Lipid and Central Carbon Metabolism" Anal. Chem. 85: M. Palazoglu, O. Fiehn (2009) "Metabolite Identification in Blood Plasma Using GC/MS and the Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library"( 采用气质联用和 Agilent Fiehn 气质联用代谢组学 RTL 库进行血浆代谢物鉴定 ), 安捷伦科技有限公司应用简报 EN. 安捷伦科技有限公司, 圣克拉拉, 加利福尼亚州 10. A. Macherone, M. Churley, (2013) "Monitoring steroidal analogues in clinical and environmental chemistry: one model for exposomics" The 61st Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June Minneapolis Convention Center, Minneapolis, Minnesota 11. C. Williard (2013) "Application of GC/MS/MS in Monitoring Steroids as a Pharmacokinetic and Pharmacological Biomarker" Retrieved April 1, 2013 from, S.M. Rappaport, et al. (2012) "Adductomics: Characterizing exposures to reactive electrophiles" Toxicology Letters 213(1): H. Li, et al. (2011) Profiling Cys34 adducts of human serum albumin by fixedstep selected reaction monitoring Mol. Cell Proteomics 10:(3):M H. Grigoryan, et al. (2012) Cys34 adducts of reactive oxygen species in human serum albumin Chem. Res. Toxicol. 25(8): S.M. Rappaport, (2011) "Implications of the exposome for exposure science" J. Exposure Science and Environmental Epidemiology 21: 安捷伦对本材料可能存在的错误, 或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本文中的信息 说明及指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 11 月 11 日, 中国印刷 CHCN

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