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耳庞
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1 采用 GC/MSD DRS 对残留农药进行全面筛查应用食品安全作者 Philip L. Wylie, Michael J. Szelewski, and Chin-Kai Meng Agilent Technologies, Inc Centerville Road Wilmington, DE USA Christopher P. Sandy Agilent Technologies, Inc. Block A, CSC Eskdale Road Winnersh Triangle Estate Wokingham, Berk RG41 5DZ United Kingdom 前言根据农药手册, 目前世界上正在使用的农药有 700 多种 [1] 大约 600 种农药是过去使用的, 但现在已经禁用或不再销售有一些农药早已不再使用, 但它们仍然存在于环境中, 还可能在植物和动物体内生物富集在食品和饮料在土壤水和大气在水生和陆生的动植物在人类血液脂肪组织和乳汁中, 都能检测到痕量的农药或它们的代谢物世界卫生组织根据农药对人的急性毒性将农药分成五类 [2] 所分成的类别从有急性毒性到那些正常使用时没有急性毒性的种类一些农药被归类为持久性有机污染物 (POP), 致癌致畸或内分泌干扰物现在分析食品和环境样品中的农药, 跟踪它们在环境中的分布以保证食品安全, 是一项日常工作目前很多分析方法仅仅针对一部分可能存在的化合物无论是食品还是环境样品, 由于其中一些天然产物能够被一起提取出来, 分析工作变得较为复杂食品或组织提取物是非常复杂的样品基质, 在分析之前需要进行若干样品净化步骤 [3] 即便如此, 在残余基质存在的情况下检测痕量的污染物也很困难为了提高效率, 必须采用多残留方法 (MRM) 分析更多的农药通常这些方法都采用带有元素选择性检测器的气相色谱仪 (GC) 来确定不同基质中的农药 [4,5, 6] 气质联用(GC/MS) 已广泛地用于命中峰的确证液相色谱 (LC) 常用于分析那些不能采用 GC 分析的化合物 [2] 现在, 越来越多的农药实验室利用液质联用 (LC/MS) 和气质联用 (GC/MS) 作为基本的分析工具 [7,8] 许多多残留方法(MRM) 仍然是针对部分目标农药而建立的方法但采用这种多残留方法, 任何不在目标化合物列表中的农药都可能会被漏掉本文采用保留时间锁定 (RTL)[9,10,11] 和谱图 Deconvolution 技术 [12], 建立了一种能够筛查 567 种农药和可疑内分泌干扰物的简单的 GC/MS 分析方法

2 谱图 Deconvolution 能够帮助识别农药化合物, 即使农药被共流出的基质化合物所包埋, 同样也可以被识别保留时间锁定能够消除假阳性, 使结果更可靠需要时, 使用者很容易在该方法中加入新的化合物实验部分表 1 列出了安捷伦公司在农药分析中采用的仪器软件和分析参数根据进样量的需要, 可以采用 PTV 进样或分流 / 不分流进样样品蔬菜提取物由美国加州食品农业局 (CDFA;Sacramento,CA USA) 的 Mark Lee 和 Stephen Siegel 博士和新西兰 TNO 营养和食品研究所 ( Zeist, The Netherlands) 的 J.G.J.Mol 博士提供 17 个地表水的 GC/MS 分析数据文件也由 CDFA 提供, 并在本实验室采用 DRS 进行了处理 17 个作物提取物的 GC/MS 数据文件 ( 锁定在安捷伦农药分析方法中 ) 由英国 NRM 实验室 (Berkshire,UK) 提供表 1. 分析仪器及条件气相色谱仪 Agilent 6890N 自动进样器 Agilent 7683 进样口色谱柱载气保留时间锁定柱箱温度程序程序升温汽化 (PTV) 进样口参数 Agilent PTV, 溶剂放空模式进样量 : 15 µl( 使用 50-µL 注射器 ) 质量选择检测器 (MSD) 扫描范围 Agilent 30 m 0.25 mm 0.25 µm HP-5MS( 部件号 19091S-433) 氦气, 恒压模式甲基毒死蜱锁定为 min( 额定柱前压 =17.1 psi) 70 C(2 min),25 C/min 到 150 C(0 min),3 C/min 到 200 C(0 min), 8 C/min 升至 280 C(10-15 min) 温度程序 :40 C(0.25 min),1600 C/min 到 250 C(2 min); 放空时间 :0.2 min; 放空流速 :200 ml/min; 放空压力 :0.0 psi;purge 吹扫流速 :60.0 ml/min; 吹扫时间 :2.00 min Agilent 5973 inert amu 离子源, 四极杆, 传输管线温度分别是 230,150 和 280 C 溶剂延迟倍增器电压软件 GC/MSD 化学工作站 DRS 4.00 min 电压自动调谐 Agilent p/n G1701DA (Version D01.00 sp1) Agilent p/n G1716AA 谱库检索软件 NIST MS 检索 (2.0 版 )( 包括 NIST'02 质谱谱库, Agilent 部件号 G1033A) Deconvolution 软件自动质谱 Deconvolution 和识别软件 (AMDIS) ( 包括 NIST'02 质谱谱库, MS 谱库 Agilent 部件号 G1033A) NIST '02 质谱谱库 (Agilent p/n G1033A);Agilent RTL 农药库 ( 部件号 G1049A) 2

3 结果与讨论保留时间锁定 (RTL) 和 RTL 数据库保留时间锁定 (RTL) 是由安捷伦公司开发的一种技术, 采用这种技术使用者可以在世界上任何一个实验室的任何一台 Agilent 6890 GC 上使分析物的保留时间相匹配, 前提是采用相同的常规 GC 方法和毛细管柱 [13] 采用 RTL 技术, 安捷伦公司开发了几个用于 GC 和 GC/MS 的保留时间锁定数据库, 包括每一次进样的锁定保留时间化合物名称 CAS 号分子式分子量和质谱图 ( 只在 GC/MS 数据库中提供 )[14] 安捷伦 RTL 农药库包含了几乎所有可用于 GC 分析的农药和一些内分泌干扰物的信息, 共 567 个化合物要采用以下讨论的 DRS, 这个信息库需要转换成 NIST 格式 [15] AMDIS 所使用的包含有保留时间和化合物信息的谱库是由原来的 RTL 农药库生成得来的使用者可以很容易在这些库中加入新的农药或其它感兴趣的化合物 [15] Deconvolution 的基本知识在 GC/MS 中,Deconvolution 是一种数学技术, 它可以将重叠的质谱图分开成为清晰的单个组分的谱图图 1 是这个过程的简单示意图这里分别是总离子流色谱图 (TIC) 和质谱图与常见的情况一样, 这个色谱峰包含了多个重叠在一起的组分, 而最高点质谱图实际上也是这些组分的组合图质谱谱库检索只可能给出一个较差的匹配, 而且不能识别所有构成这种组合谱图的单个化合物组分 Deconvolution 过程是在寻找那些单个丰度在谱图中上下一起波动的离子它首先校正了四极杆质谱固有的谱图偏斜, 为每一个色谱峰得到了一个更准确的顶点保留时间如图 1 所示,Deconvolution 为每个重叠的组分提供了清晰的谱图在用谱库检索时这些单个谱图就可能得到良好匹配这种包括在安捷伦 DRS 软件中的 AMDIS 软件由国家科学技术研究所 (NIST) 提供 [12] 图 1. 质谱图 Deconvolution 过程示意图 3

DRS 安捷伦公司的 DRS 是由三个不同的 GC/MS 软件包组合而成的 :1) 安捷伦 GC/MS 化学工作站,2) 带有 NIST 02 质谱谱库的 NIST 质谱检索程序,3)AMDIS 软件, 也来自 NIST 在 DRS 软件中包含有 567 种农药和可疑内分泌干扰物的质谱图和锁定保留时间信息库 DRS 包括三个独立但互补的数据分析步骤首先, GC/MS

4 DRS 安捷伦公司的 DRS 是由三个不同的 GC/MS 软件包组合而成的 :1) 安捷伦 GC/MS 化学工作站,2) 带有 NIST 02 质谱谱库的 NIST 质谱检索程序,3)AMDIS 软件, 也来自 NIST 在 DRS 软件中包含有 567 种农药和可疑内分泌干扰物的质谱图和锁定保留时间信息库 DRS 包括三个独立但互补的数据分析步骤首先, GC/MS 化学工作站软件采用一个目标离子和 3 个以上的定性离子对目标农药进行常规的定量分析, 并报告所检测的校正化合物的含量对于数据库中的其它化合物, 可以采用 DRS 软件提供的平均农药响应系数 (RF) 估算它们的含量值并报告结果然后,DRS 将数据文件发送到 AMDIS 软件, 进行谱图的 Deconvolute 并采用 Deconvoluted 全谱图在安捷伦锁定保留时间 RTL 农药库中进行检索 ( 以 AMDIS 格式 ) 在 AMDIS 中可设置一个过滤器, 要求分析物的保留时间必须落在由使用者规定的时间窗口由于 RTL 是用来给出高精度的 RTL 数据库保留时间的, 这个窗口可以设得很小, 通常为 20 秒或更短最后, 由 AMDIS 找到的所有目标化合物的 Deconvoluted 谱图在 147,000 个化合物的 MIST 质谱谱库中进行检索确证在这一步骤中, 不需要保留时间一旦建立合适的方法, 只需要简单的点击鼠标,DRS 报告就可以生成, 如图 2 所示这个软件可以在每次分析完成时或在分析之后对一个单独的文件或一批文件自动运行图 2. 化学工作站下拉菜单, 示意 DRS 运行单个或多个文件时的选项 4

中草药混合物中的农药图 3 是一个中草药混合物的提取液的总离子流色谱图图 4 是该样品的 MSD Deconvolution 报告, 该报告是以 HTML 格式形成的, 以便于通过电子邮件发送或拷贝到电子表格中选择这个样品是因为草药属于最难分析的植物样品它们的提取液中含有大量的天然产物会影响农药的分析 450000 400000 TIC:

5 中草药混合物中的农药图 3 是一个中草药混合物的提取液的总离子流色谱图图 4 是该样品的 MSD Deconvolution 报告, 该报告是以 HTML 格式形成的, 以便于通过电子邮件发送或拷贝到电子表格中选择这个样品是因为草药属于最难分析的植物样品它们的提取液中含有大量的天然产物会影响农药的分析 TIC: MOL_4A.D Abundance Time 图 3. 一个中草药混合物的总离子流色谱图图 4. 图 3 所示中草药提取物的质谱 Deconvolution 报告 5

6 图 4 中的 DRS 报告列出了每个命中峰的保留时间 CAS 序号和化合物名称报告下端列出的菲 -d 10 是内标物 (ISTD), 化学工作站利用它来估算所检出的每个化合物的含量由于所有的 567 种目标化合物都采用了一个平均农药响应因子, 因此第 4 列列出的含量值仅仅是估算值实验表明, 报告中大多数采用平均农药响应因子得到的含量估算值都落在它们真实值的 10 倍范围内准确的定量要求采用常规的农药标准品进行校正, 但对于数据库中所有的农药进行逐一校正是很难实现的在实验室通常可以对一部分目标农药制备校正曲线, 对数据库中的其它化合物则采用它们的平均响应因子来进行计算采用这种方法, 当一种新的化合物被检出, 实验室很快可以得到其含量的估算值并决定是否需要将它加入校正列表报告的第 5 列列出了利用 AMDIS 进行去卷积并采用 Deconvoluted 全谱图在保留时间锁定 (RTL) 农药库中进行检索得到的匹配系数在本例中,AMDIS 比化学工作站软件识别出了更多的目标化合物 ( 如扑灭通和 p,p'-dde), 这是一个典型的复杂样品当得到锁定的保留时间后, 在 AMDIS 软件中可设置一个保留时间范围是一个重要的优点此时, 那些落在数据库保留时间 RT±10s 范围之外的峰被去掉第 6 列列出了化合物的信息库 RT 值和它们在色谱图上的真实保留时间值之间的差别 ( 单位是秒 ) 图 4 说明除农药以外, 该软件还识别了两个邻苯二甲酸酯类 ( 可疑的内分泌干扰物 ) 邻苯二甲酸酯类在环境中普遍存在, 极难从背景中除去在这种情况下, 没有采取措施去确定这些邻苯二甲酸酯类是从样品中提取出来的还是在实验中引入的 DRS 报告中的最后两列列出了所有的 AMDIS 峰在 NIST 147,000 个化合物质谱谱库中进行检索的结果当 NIST 谱库检索发现一个化合物属于匹配的前 100 个 ( 可由使用者设定 ), 与 AMDIS 的结果一致, 它的匹配系数就被列在第 7 列命中峰的序号列在最后一列, 在 NIST 中 1 表示是最好的匹配 ( 匹配系数最高值 ) 有时 NIST 谱库检索找不到谱图匹配前 100 名的 AMDIS 命中峰这时, 报告中的下一行列出了该谱图的最佳谱库匹配氟胺氰菊酯 ( 图 4) 就是一个例子, 该化合物在 min 流出下一行列出了氟胺氰菊酯, 它是那个谱图的最佳 NIST 谱库匹配此时, 在 NIST 质谱谱库中没有化合物与氟胺氰菊酯有相同的 CAS 序号事实上, 氟胺氰菊酯 -tau-i 是一个 D 型异构体, 而氟胺氰菊酯是 DL 异构体混合物 DRS 和传统数据处理进行盲样的比较比较表明, 从复杂样品例如食品和环境基质中识别目标化合物方面 DRS 比传统方法优越得多下面是两个相关的研究第一例情况, 英国 Berkshire 的 NRM 实验室采用安捷伦保留时间锁定农药方法分析了 17 个未添加农药的作物样品将得到的数据文件 ( 不是他们所列出的农药命中峰 ) 发送到安捷伦采用新的 DRS 进行分析表 2 比较了两个实验室的分析结果采用手动数据处理,NRM 从 17 个样品中检出了 28 种农药, 其中 4 种低于它们的最低校正水平采用同样的数据文件,DRS 检出了 33 种农药安捷伦的自动方法没有识别春季洋葱样品中的嘧菌酯, 因为它不包括在 RTL 农药库中但是它能够被 NIST 谱库找到, 它在 403 amu 处有分子离子, 而 NRM 采用的方法只扫描到 400 amu DRS 方法确证了所有四种低于 NRM 校正范围的农药, 并找到了在它们的方法中没有包括的另外五种化合物 ( 特草定嘧霉胺甲硫威哒螨灵和霜霉威 ) 手动和自动方法的一致性很好但是,DRS 能找到更多的农药, 它能够找到那些被手动方法漏掉的化合物此外, 采用手动数据处理分析 17 个样品需要花费一个化学家大约 7 小时, 而 DRS 只需要计算机花 50 分钟即可完成 6

7 表 2 在 17 个空白作物样本中采用传统数据处理和安捷伦 DRS 软件检出的农药对比只有一种方法检出的农药加有下划线样品 Agilent DRS 结果 * NRM 手动分析 ** 芫荽炔苯酰草胺炔苯酰草胺氯酞酸甲酯氯酞酸甲酯 p,p'-dde p,p'-dde 迷迭香特草定未检出 *** 抗蚜威抗蚜威氯酞酸甲酯氯酞酸甲酯春季洋葱炔苯酰草胺炔苯酰草胺嘧霉胺未检出 *** 抗蚜威抗蚜威甲霜灵甲霜灵不在 DRS 谱库嘧菌酯细香葱甲硫威未检出 *** 樱桃番茄腐霉利腐霉利哒螨灵未检出 *** 小胡瓜霜霉威未检出 *** 茄子腐霉利腐霉利噻嗪酮噻嗪酮硫丹硫酸盐硫丹硫酸盐平叶欧芹氯酞酸甲酯氯酞酸甲酯生菜生菜乐果乐果甲霜灵甲霜灵腐霉利腐霉利戊唑醇戊唑醇氧乐果氧乐果细菊苣腐霉利腐霉利高效氯氟氰菊酯高效氯氟氰菊酯红马铃薯氯苯胺灵氯苯胺灵抗蚜威抗蚜威细菊苣抗蚜威抗蚜威 * 采用安捷伦 DRS 软件重新分析 NRM 数据文件找到的农药 ** NRM 采用目标农药分析和手动确认找到的农药 *** 不在 NRM 目标化合物列表中的化合物不包括在安捷伦 RTL 农药库或 DRS 软件中的化合物安捷伦化学工作站找到的化合物, 但在去卷积之后的 AMDIS 或 NIST 谱库检索中未被找到经过仔细研究, 判断样品中不含氧乐果检出但低于校正范围的化合物 7

8 地表水样品的分析 : 在另一个研究中,CDFA 分析了 17 个地表水提取物中的农药图 5 是两个典型样品的 TIC 总离子流色谱图 CDFA 采用保留时间锁定 (RTL) 和 RTL 数据库检索, 但没有使用谱图 Deconvolution 同样的数据文件采用 DRS 进行对比分析表 3 列出了对 17 个 CDFA 样品的手动分析和 DRS 分析的对比结果 CDFA 在 17 个样品中检出 38 种农药命中峰, 一些命中峰是在不同样品中的相同农药一个熟练分析人员花费了大约 8 小时进行结果分析, 包括去掉假阳性并确证所有的命中峰 DRS 找到了 CDFA 检出的 37 种化合物并识别了 CDFA 的一个假阳性的命中峰此外, 还检出了另外 34 种农药,17 个样品中一共识别了 71 个命中峰这个过程完全自动化, 仅仅是计算机花费了大约 20 分钟时间处理所有的数据文件表 3. 采用 GC/MS 分析 17 个地表水样品的结果比较 CDFA 采用 RTL 和 RTL 数据库检索, 但没有去卷积相同的数据文件也采用安捷伦 DRS 软件进行了分析 CDFA DRS 农药命中峰的个数 37 个相同的 37 个 + 另外 34 个假阳性个数 1 0 分析所需时间 ~8 小时 20 分钟图 5. 典型的地表水提取物的 TIC 谱图 (CDFA 提供 ) 8

9 结论安捷伦公司新的农药分析 DRS 给实验室带来了一些真正的便利容易使用 : 该软件使用十分简单, 不会比使用 6890N/5973 inert GC/MS 系统需要更多的技术使用者不需要学习有关复杂的 Deconvolution 知识或掌握一个新的软件包自动化 :Deconvolution 报告能够在每运行一次后自动生成, 也可以将一批样品一起处理节约时间 : 数据处理的时间从几小时缩短为几分钟质量 : 它给出的报告假阳性和假阴性最少重现性 : 分析结果不取决于操作者的技术或经验准确度 : 本文讨论中进行的比较说明 DRS 在识别农药方面比手动数据分析具有更高的准确度它对于相对复杂一些的样品尤其适用, 因为这些样品的共提物基质组分可能会掩盖痕量的目标农药全面 : 该方法采用一次简单的 GC/MS 运行即可筛查几乎所有可采用 GC 分析的农药和一些可疑的内分泌干扰物该方法共包括 567 种化合物, 是现有的最全面的农药筛查工具在需要时使用者还可以在方法中加入更多的化合物提供定量半定量和定性结果 : 所有校正化合物都可以定量检测其它任何一种化合物的含量都可以采用由软件提供的平均农药响应因子进行估算 DRS 的使用并不仅仅局限于农药分析中其它目标化合物质谱谱库也可以转成 AMDIS 格式来使用这个软件例如, 可以利用已有的毒物香精香料有机污染物等的谱库使用者甚至可以利用 DRS 建立自己的谱库虽然并不是必需要求, 但对每一次进样都建立一个包含有锁定保留时间的 RTL 信息库是很有好处的, 因为这样将给出最少的假阳性结果致谢作者非常感谢加州食品和农业局的 Mark Lee 和 Stephen Siegel 博士 Netherlands TNO 研究所的 J.G.J. Mol 博士和英国 NRM 实验室的管理和工作人员, 感谢他们提供了样品和数据参考文献 1. C.D.S Tomlin, 编著. 农药手册, 第 13 版, 英国作物保护署,Surry, 英国 (2003) 2. Classif_Pestic_ pdf 3. J. Cook,M.P. Beckett,B. Reliford,W. Hammock, and M.Engel(1999)J. AOAC Int.,82(6), M.A. Luke,J.E. Froberg,and H.T. Masumoto, (1975) J. Assoc. Off. Anal. Chem. 58, M. Luke,J. Froberg,G. Doose,and H. Masumoto, (1981) J. Assoc. Off. Anal. Chem. 64, B. McMahon,N.Hardin(1994) 农药分析手册, 第 1 卷, 第 3 版, 美国食品药品管理局 (FDA)Washington,DC 7. J. Fillion,R. Hindle,M. Lacroux,and J. Selwyn(1995)J. AOAC Int. 78, J. Fillion,F. Sauvé,and J. Selwyn(2000) J AOAC Int.,83, P. Wylie and B. Quimby, 一种筛查 567 种农药和可疑内分泌干扰物的方法, 安捷伦科技,publication E H. Prest,P. Wylie,K. Weiner,and D. Agnew, 采用 6890/5973 GC/MSD 系统有效筛查农药和内分泌干扰物安捷伦科技,publication E K. Weiner and H. Prest, 保留时间锁定 : 创建用户保留时间锁定筛查信息库, 安捷伦科技,publication E 国家标准和技术研究所 (NIST),AMDIS 文化和下载网站 : AMDIS_Literature_and_Downloads/ amdis_literature_and_downloads.html. 9

10 13. V. Giarocco,B. Quimby and M. Klee, 保留时间锁定 : 概念和应用, 安捷伦科技,publication E usersoft/main.html#rtl. 15. M. Szelewski and C.K. Meng, 创建和编辑保留时间锁定筛查数据库和信息库, 安捷伦科技,publication EN 如需详细信息有关我们的产品和服务的更多信息, 欢迎访问我们的网站 : 安捷伦公司对本文存在的纰漏以及与本文有关的设备操作或使用的材料造成的损害不承担任何责任本文中相关的信息说明或规格若有变动, 恕不另行通知安捷伦科技,2004 中国印刷 2004 年 5 月 19 日 CHCN

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CHCN0607.qxd 建立各种应用的安捷伦 GC/MSD Deconvolution 报告资料库技术概论作者 Xiaofei Ping Agilent Technologies (Shanghai) Co Ltd 412 Yinglun Road, Shanghai, 200131 P.R. China Chin-Kai Meng and Michael Szelewski Agilent Technologies,