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1 乌贼墨肽聚糖对前列腺癌 PC-3 DU145 细胞作用机制研究 郑玉寅, 杨最素, 闫海强, 黄芳芳, 李荣, 丁国芳 * ( 浙江海洋学院食品与药学学院, 浙江舟山 ) 摘 要 : 目的研究乌贼墨肽聚糖对前列腺癌 PC-3 和 DU-145 细胞凋亡的影响, 以及细胞凋亡的机制 方 法用 HE 染色观察肽聚糖作用后细胞形态变化, 流式细胞术检测细胞早期凋亡率, 免疫组化检测肽聚糖作用前后细胞中 COX-2 和 VEGF 蛋白阳性表达情况, 原位杂交检测肽聚糖作用前后细胞中 Bcl-2mRNA 和 Caspase-3mRNA 表达的变化 免疫印迹检测肽聚糖作用前后细胞中 COX-2 VEGF Bcl-2 和 Casepase-3 的蛋白表达情况 结果肽聚糖作用后的细胞出现凋亡的形态学改变, 流式细胞术检测后发现, 早期凋亡细胞随着作用时间和药物浓度的增加而增加, 两种细胞中的 COX-2 和 VEGF 蛋白表达量下降,Bcl-2mRNA 的表达量减少, 而 Caspase-3mRNA 表达量增加 免疫印迹结果显示,COX-2 VEGF 和 Bcl-2 蛋白表达量下降,Caspase-3 蛋白表达量增加 结论乌贼墨肽聚糖可以诱导前列腺癌 PC-3 和 DU-145 细胞的凋亡, 机制可能是下调 COX-2 VEGF 蛋白和 Bcl-2mRNA 的表达 ; 上调 Caspase-3mRNA 的表达 关键词 : 乌贼墨肽聚糖 ;PC-3 细胞株 ;DU-145 细胞株 ; 细胞凋亡 The research of peptidoglycan from Cuttlefish ink for Prostate Cancer PC-3 DU145 cell mechanism Zheng Yuyin, Yang Zuisu, YAN Hai-qiang, Huang Fangfang, Li Rong, Ding Guofang*, (School of Food Science and Pharmacology of Zhejiang Ocean University, Zhoushan Zhejiang ,China) Corresponding author:ding Guo-fang, dinggf2007@163.com ABSTRACT:Objective To study the antitumor effect of Cuttlefish ink peptidoglycan on PC-3 and DU-145 cells and its mechanism in vitro. Methods The PC-3 and DU-145 cells after treated by sepia ink PGN, we used HE staining to observe growth condition and morphology, FCM for observation of apoptosis, immunocytochemical staining (SABC) was used for analyzing the expression of COX-2 and VEGF proteins and In-situ hybridization was used for analyzing the expression of Bcl-2 mrna and Caspase-3 mrna. The expression of COX-2 VEGF Bcl-2 and Caspase-3 of two human prostate cancer cell lines were examined using western blot.results The result showed numbers of Cell apoptosis morphological feature, and the early stage of apoptosis of cells was observed,and the apoptotic cells with early drug concentration effect increased, then sepia ink PGN down-regulated COX-2 VEGF proteins and Bcl-2 mrna expression, induce the expression of Caspase-3 mrna. Cuttlefish ink peptidoglycan exposure for 24 h decreased the expression of the COX-2 VEGF Bcl-2 and 1

2 increased the expression of Caspase-3.Conclusion The Cuttlefish ink peptidoglycan can induce PC-3 and DI-145 cells apoptosis. KEY WORDS: Cuttlefish ink peptidoglycan; PC-3 cell line; DU-145 cell line; apoptosis 海洋环境的独特性 海洋生物多样性和海洋生物活性物质结构的新颖性是海洋生物活性物质研究与开 发的重要基础 近年来, 随着对海洋活性物质的深入研究, 发现很多海洋活性物质可以显著的抑制肿瘤生 长 乌贼墨的主要化学成分是黑色素和蛋白多糖复合体 近几年来, 乌贼墨的研究机制主要体现在 : 诱导 NK 细胞和 LAK 细胞的杀伤活性, 巨噬细胞的激活作用, 对多种细胞因子的诱生作用, 蛋白激酶活性的影响, 细胞免疫黏附肿瘤细胞能力的影响和细胞内 Ca 2+ 浓度的影响等 [1] [2] 黄枚等给皮下移植 HHC15 的小鼠灌胃乌 贼墨进行抑瘤实验, 病理检查和检测血清中甲胎蛋白 (AFP) 含量, 结果表明, 乌贼墨对荷人肝癌 HHC 15 裸小 [3] 鼠具有显著的抑瘤作用, 并能提高小鼠的免疫功能 黄芳芳等从乌贼墨中提取出寡肽, 经过分离纯化后 检测其抗肿瘤活性, 发现乌贼墨寡肽对 DU-145 细胞具有细胞增殖抑制效果, 而镜下观察发现后, 细胞出现 凋亡形态 本实验从乌贼墨中提取出肽聚糖 (peptidoglycan,pgn), 研究其对 PC-3 和 DU-145 细胞的作用 机制 1 材料和仪器 1.1 实验材料 乌贼墨肽聚糖由自己实验室提取纯化,-20 保存, 实验时培养液溶解 1.2 细胞株 人前列腺癌细胞 DU-145 和 PC-3 购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库 1.3 试剂 HamF12 培养基,Gibco 公司 ; 胎牛血清 ( FBS), 杭州四季青生物制品有限公司 ; COX-2 VEGF BCL-2 和 Casepase-3 抗体,BCL-2mRNA 和 Casepase-3mRNA 原位杂交试剂盒,DAB 显色 剂, 武汉博士德生物制品有限公司 ;Annexin V- FITC /PI 双染试剂盒, 晶美生物工程有限公司 1.4 主要仪器 SSW 型微电脑电热恒温槽, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ;ZHJH-C1209C 型超净工作台, 上海智诚分析仪器制造有限公司 ;Forma 3111 型 CO2 培养箱, 美国 Thermo 公司 ; 酶标仪 ( 美国 BIO-RAD), 杭州宝城生物科技有限公司 ;FACS Calbur 流式细胞仪,BD 公司 ; 倒置显微镜,OLYMPUS 显微镜,500 万像素 Pro-MicroScan CCD, 日本 OLYMPUS 公司 2

3 2 方法 2.1 细胞培养 人前列腺癌 DU-145 和 PC-3 细胞接种于含 10%( 体积分数 )FBS 双抗溶液( 青霉素 G100IU/mL 链霉素 100IU/mL) 的 HamF12 培养基中, 置于 37 5%CO2 95% 饱和湿度条件下的孵箱中常规培养, 细胞贴壁生长, 每 2 3 天换液 1 次, 当细胞生长约 90% 时, 传代培养 用 0.25% 胰蛋白酶 /0.02%EDTA 混合消化液消化, 收集对数生长期细胞进行实验 2.2 HE 染色方法观察细胞形态 将已经过细胞爬片的 DU-145 和 PC-3 细胞, 分别加入浓度为 0mg/ml,5mg/mL,10mg/ml,15mg/ml 的肽聚糖, 培养 24h 后, 将盖玻片取出,95% 酒精固定 15min PBS 洗 2 次各 1min, 苏木素进行染色, 自来水充分水洗, 伊红复染, 自来水浸洗,50% 75% 95% 和无水乙醇进行梯度脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封片, 光学显微镜下观察并摄片 2.3 流式细胞仪分析细胞凋亡 将每个 25mL 的培养瓶中接种 个左右的肿瘤细胞,24h 后加入浓度分别为 0mg/ml 5mg/ml 10mg/ml 和 15mg/ml 的样品溶液培养 24h, 同时设立空白对照组 细胞凋亡检测方法参照试剂盒中的操作方法进行 首先将培养结束的细胞用 0.25% 的胰蛋白酶液进行消化, 然后用 PBS 将其从瓶壁吹打下来 将所得到的细胞悬液移入离心管,1200r/min 离心 5min 吸去上清液, 加试剂盒专用缓冲液 400µL, 吹打成细胞悬液 向细胞悬液中加入 5µLAnnexin V-FITC 混匀后再加入 5µL 的 PI, 室温下放入暗室静置 5min 后上机分析 2.4 免疫组化法检测乌贼墨肽聚糖对前列腺癌 PC-3 和 DU-145 细胞 COX-2 和 VEGF 蛋白阳性表达影响 将细胞培养于 6 孔培养板, 待细胞爬满玻片 90% 左右, 加入浓度分别为 0mg/ml(4 孔 ) 和 15mg/ml(2 孔 ) 培养 24h, 实验中设立阴性对照组, 取出丙酮固定 30min, 按照试剂盒说明书操作 2.5 原位杂交法检测乌贼墨肽聚糖对前列腺癌 PC-3 和 DU-145 细胞中 BCL-2mRNA 和 Casepase-3mRNA 表达影 响 将细胞培养于 6 孔培养板, 待细胞爬满玻片 90% 左右, 加入浓度分别为 0mg/ml(4 孔 ) 和 15mg/ml(2 孔 ) 培养 24h, 实验中设立阴性对照组 实验结束弃培养液, 用 PBS 洗 2 次, 每次 3min 以 4% 多聚甲醛 /0.1MPBS(PH ), 含有 1/1000DEPC 进行固定 室温固定 分钟, 蒸馏水充分洗涤 按照试剂盒说明书操作, 最后拍照 3

4 2.6 免疫印迹检测检测乌贼墨肽聚糖对前列腺癌 PC-3 和 DU-145 细胞中 COX-2 VEGF BCL-2 和 Casepase-3 的蛋白表达影响 分组作用完毕的细胞用预冷的 PBS 冲洗 3 遍, 冰上加入 RIPA (500μl/75mm2)+PMSF(10μl/ml) 反复吹打细胞, 收集上清于 4 孵育 30min, r/min 离心 10~15min, 取上清 按测定的蛋白含量取等体积的蛋白提取液, 与 5 上样缓冲液混合, 与蛋白质分子标准品共同进行 SDS-PAGE 电泳, 在转膜溶液中将蛋白应用电半干方法转印至 PVDF 膜上, 至封闭液中 4 过夜, 加入用封闭缓冲液稀释的一抗 (1 400), 室温缓慢震荡 2h, 用含 0.5%Tween-20 的 TBS 缓冲液洗膜 3 次后, 加入以缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗 ( ), 室温缓慢震荡 1h 后 ECL 显影, 应用 UVI 凝胶成像分析系统进行扫描并记录光密度强度 以 β-actin 作为内对照校正并做相对量分析, 数值以两者的吸光度积分比值表示 3 结果 3.1 细胞形态学观察 HE 染色如图 1, 图 2 正常组的 DU-145 和 PC-3 细胞细胞质染色均一, 细胞核大小不一, 核仁数目多, 且细胞排列紧密, 形态饱满, 如图 A 加入乌贼墨肽聚糖作用 24h 后, 两种细胞出现细胞质浓缩, 形态变的不规则, 细胞有较多突起, 轮廓模糊, 细胞质出现空泡, 核仁数目减少, 染色质凝聚, 核固缩, 细胞间隙增大等细胞凋亡的形态学变化, 如图 B C D 4

5 A DU-145 细胞对照组 B 5mg/ml PGN 作用后 C 10 mg/ml PGN 作用后 D 15 mg/ml PGN 作用后图 1 乌贼墨肽聚糖对 DU-145 细胞形态的影响,24h HE 染色 400 Fig.1 Morphologic changes in DU-145 cells treated with Sepia ink PGN, 24h HEstaining 400 A PC-3 细胞对照组 B 5mg/ml PGN 作用后 C 10 mg/ml PGN 作用后 D 15 mg/ml PGN 作用后图 2 乌贼墨肽聚糖对 PC-3 细胞形态的影响,24h HE 染色 400 Fig.2 Morphologic changes in PC-3 cells treated with Sepia ink PGN,24h HEstaining 流式细胞术检测结果 5

6 本实验用 Annexin V-FITC/PI 双标记流式细胞术将实验样本中正常 坏死和凋亡细胞等分开 如图 3 和图 4 所示, 细胞分成 4 个区 : 左下象限 Annexin V-FITC - /PI -, 代表正常细胞 ; 左上象限 Annexin V-FITC - PI +, 代表机械损伤细胞 ; 右下象限 Annexin V-FITC + /PI -, 为早期凋亡细胞 ; 右上象限 Annexin V-FITC + /PI + 凋亡晚期或坏死细胞 用不同浓度的肽聚糖作用 24h 后, 对照组的细胞基本分布在左下区, 而作用组的细胞, 随样品浓度的增加, 右下区的细胞增多, 即是早期凋亡的细胞增多, 凋亡率见表 1 A DU-145 细胞对照组 B 5mg/ml PGN 作用后 C 10 mg/ml PGN 作用后 D 15 mg/ml PGN 作用后 图 3 DU-145 细胞经不同浓度肽聚糖作用 24h 后的流式细胞术 Annexin V-FITC/PI 染色图 Fig.3 Annexin V-FITC/PT staining of flow cytometry for DU-145 cells which was incubated with PGN in different concentration 24h 6

7 A PC-3 细胞对照组 B 5mg/ml PGN 作用后 C 10 mg/ml PGN 作用后 D 15 mg/ml PGN 作用后图 4 PC-3 细胞经不同浓度肽聚糖作用 24h 后的流式细胞术 Annexin V-FITC/PI 染色图 Fig.4 Annexin V-FITC/PT staining of flow cytometry forpc-3 cells which was incubated with PGN in different concentration 24h 表 1 乌贼墨肽聚糖对 DU-145 和 PC-3 细胞的早期凋亡作用的百分比 (x±s, n=3) Table 4-1 Effects of Sepia ink PGN on apoptosis in DU-145 and PC-3 cells(x±s, n=3) 细胞凋亡率 (%) PGN 浓度 (mg/ml) DU-145 凋亡率 (%) PC-3 凋亡率 (%) 0(control) 3.68± ± ± ±0.32* ±0.21* 24.42±0.25* ±0.35* 38.50±0.45* 与同种细胞对照组比较 :* 表示 P<0.05 * P<0.05 vs control group of the same cell 3.3 免疫组化结果 肽聚糖作用前后 DU-145 和 PC-3 细胞中 COX-2 和 VEGF 表达情况见图 5 图 6 图 7 和图 8 图中 A 表 示一抗为 PBS 的阴性对照组, 均无 COX-2 和 VEGF 蛋白的表达,B 是肽聚糖作用前细胞中 COX-2 和 VEGF 的 7

8 表达量, 有 COX-2 和 VEGF 蛋白的表达, 呈现阳性,C 为是肽聚糖作用后细胞中 COX-2 和 VEGF 的表达量,COX-2 和 VEGF 蛋白的表达量减少, 阳性表达减弱 COX-2 和 VEGF 蛋白阳性反应产物主要位于细胞浆, 图中显示, 乌贼墨肽聚糖作用后, 颜色变浅, 显示弱阳性, 说明两种蛋白阳性减弱, 表达减少 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 5 PGN 作用前后 VEGF 在 PC-3 细胞中的表达,24h 免疫组化 400 Fig.5 The expression level of VEGF in PC-3 cells after treated by PGN, 24h IHC 400 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 6 PGN 作用前后 VEGF 在 DU-145 细胞中的表达,24h 免疫组化 400 Fig.6 The expression level of VEGF in DU-145 cells after treated by PGN, 24h IHC 400 8

9 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后 图 7 PGN 作用前后 COX-2 在 PC-3 细胞中的表达,24h 免疫组化 400 Fig.7 The expression level of COX-2 in PC-3 cells after treated by PGN, 24h IHC 400 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 8 PGN 作用前后 COX-2 在 DU-145 细胞中的表达,24h 免疫组化 400 Fig.8 The expression level of COX-2 in DU-145 cells after treated by PGN, 24h IHC 原位杂交结果 原位杂交结果如图 9 图 10 图 11 和图 12 显示 图中 A 均表示一抗为 PBS 的阴性对照组, 无 Bcl-2mRNA 和 Casepase-3mRNA 的表达,B 是肽聚糖作用前细胞中 Bcl-2mRNA 和 Casepase-3mRNA 阳性表达,C 是肽聚糖作用后细胞中 Bcl-2mRNA 和 Casepase-3mRNA 阳性表达 由图 9 和图 10 显示, 肽聚糖作用前, 细胞中有 Bcl-2mRNA 表达, 呈阳性, 肽聚糖作用后, 两种细胞中 Bcl-2mRNA 表达减少, 阳性减弱, 而图 11 和图 12 显示, 肽聚糖作用前两种细胞中 Casepase-3mRNA 呈弱阳性, 肽聚糖作用后, 两种细胞中 Casepase-3mRNA 表达增多, 阳性增强 9

10 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后 图 9 乌贼墨肽聚糖对 PC-3 细胞 Bcl-2mRNA 阳性表达的影响,24h 原位杂交 400 Fig.9 Express of Bcl-2mRNA in PC-3 cells treated with Sepia ink peptidoglycan, 24h In-situ hybridization 400 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 10 乌贼墨肽聚糖对 DU-145 细胞 Bcl-2mRNA 阳性表达的影响,24h 原位杂交 400 Fig.10 Express of Bcl-2mRNA in DU-145 cells treated with Sepia ink peptidoglycan, 24h In-situ hybridization 400 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 11 乌贼墨肽聚糖对 PC-3 细胞 Caspase-3 mrna 阳性表达的影响,24h 原位杂交 400 Fig.11 Express of Caspase-3mRNA in PC-3 cells treated with Sepia ink peptidoglycan, 24h In-situ hybridization

11 A: 阴性对照组 B: 肽聚糖作用前 C: 肽聚糖作用后图 12 乌贼墨肽聚糖对 DU-145 细胞 Casepase-3 mrna 阳性表达的影响,24h 原位杂交 400 Fig.12 Express of Caspase-3mRNA in DU-145 cells treated with Sepia ink peptidoglycan,24h In-situ hybridization 免疫印迹结果 : 采用免疫印迹技术, 检测乌贼墨肽聚糖作用后 PC-3 和 DU-145 细胞中 COX-2 VEGF Bcl-2 和 Caspase-3 的表达水平 结果见图 13 乌贼墨肽聚糖 5mg/mL 和 10 ml 作用 24 小时后, 其中 COX-2 VEGF Bcl-2 表达量降低,Caspase-3 表达量增加 ( 图 13 B) A PC-3 DU-145 COX-2 VEGF Bcl-2 Caspase-3 B β-actin Control 5mg/mL 10mg/mL Control 5mg/mL 10mg/mL 不同剂量乌贼墨肽聚糖作用于 PC-3 细胞, COX-2,VEGF,Bcl-2 蛋白表达量降低,Caspase-3 蛋白表达量增加 不同剂量乌贼墨肽聚糖作用于 DU-145 细胞, 其中 COX-2,VEGF,Bcl-2 蛋白表达量降低,Caspase-3 蛋白表达量增加 11

12 图 13 不同剂量乌贼墨肽聚糖作用后 COX-2 VEGF BCL-2 和 Casepase-3 的蛋白表达情况 Fig.13 Expression of COX-2 VEGF BCL-2 和 Casepase-3 proteins in prostate cancer cells treated with Sepia ink peptidoglycan for 24h. 4 讨论 本实验用 HE 染色方法和生化特征检测方法中的流式细胞术, 检测了前列腺癌细胞 PC-3 和 DU-145 细胞在乌贼墨肽聚糖作用后形态学的变化和凋亡情况 试验结果发现,PC-3 和 DU-145 细胞在肽聚糖作用后, 细胞形态均发生变化, 主要体现在两种细胞均出现了空泡, 细胞核固缩, 细胞体积缩小等特征 实验中采用的流式细胞术方法为 Annexin V-FITC/PI 双标记染色法, 实验结果表明, 两种细胞的凋亡细胞和坏死细胞随着肽聚糖浓度的增加而增多, 呈现量效关系, 且在同浓度与时间作用下,PC-3 细胞的早期凋亡率明显高于 DU-145 细胞, 由此推测, 乌贼墨肽聚糖诱导 PC-3 细胞的凋亡的效果比 DU-145 细胞的好 从上述实验我们证实了乌贼墨肽聚糖可以诱导前列腺癌细胞 PC-3 和 DU-145 的凋亡, 所以试验进一步探索了肽聚糖诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机制 细胞凋亡途径有线粒体凋亡途径和死亡受体介导凋亡途径 [4-6], 在细胞凋亡的过程中很多基因发挥了重要的调节作用 COX-2 是一种诱导型的表达蛋白, 参与肿瘤及炎症的发展 发生等生理过程 [7] 近年来大量研究表明,COX-2 的过量表达与前列腺癌的发生和发展密切相关 VEGF 在肿瘤血管生成中有着重要的作用 肿瘤生长依赖于肿瘤组织内血管形成 [8] 研究表明, 前列腺癌中 COX-2 的表达水平与 VEGF 的表达水平呈正相关, 说明 COX-2 可能诱导 VEGF 的表达而促进前列腺癌肿瘤血管的生成和侵袭转移 Bcl-2 原癌基因的特点是通过抑制细胞的程序性死亡, 其过度表达可以抑制细胞程序性死亡而阻碍或延迟正常细胞分化, 从而延长细胞的寿命, 使细胞的数量增多, 基因变异的可能性增加, 有助于肿瘤的发生 [9-10] Caspase-3 是细胞凋亡过程中的主要效应因子, 绝大多数的触发细胞凋亡因素, 最终都需要通过 Caspase-3 介导的信号传递途径导致细胞凋亡 [11] 实验采用的免疫组化以及免疫印迹结果显示, 肽聚糖作用前,PC-3 和 DU-145 细胞中的 COX-2 和 VEGF 表达呈强阳性, 而当肽聚糖作用后,COX-2 和 VEGF 的阳性表达急剧下降 所以作者认为, 乌贼墨肽聚糖诱导细胞凋亡可能是通过下调 COX-2 和 VEGF 蛋白的表达, 抑制新生血管的生成来阻断或减少肿瘤生长需要的营养和供血来实现的 通过原位杂交法和免疫印迹技术, 结果是随着药物作用后,Bcl-2mRNA 的阳性表达减少, 而 Caspase-3mRNA 的阳性表达增加, 所以, 作者认为乌贼墨肽聚糖是通过原癌基因来调节 PC-3 和 DU145 细胞凋亡 而除此途径外, 是否还通过其他途径凋亡尚不清楚, 所以, 待进一步的研究, 特别是裸鼠模型的体内研究 乌贼墨是水产品加工过程中的废弃物, 利用基因作为靶标, 来研究乌贼墨肽聚糖的抗前列腺癌活性, 对海洋生物活性物质的开发利用和抗肿瘤研究治疗具有重要的意义 12

13 参考文献 [1] 李孝东, 袁建华. 乌贼墨抗肿瘤机制研究进展 [J]. China Pharmacist 2003,6(10): [2] 黄枚. 乌贼墨抗癌活性的实验研究 [J]. 福建中医学院学报,2004,14(1): [3] Ding G F, Huang F F, Yang Z S, Yu D, Yang Y F. Anticancer Activity of an Oligopeptide Isolated from Hydrolysates of Sepia Ink[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2011, 9(2): [4] Cho S D, Li G, Hu H, et a1. Involvement of c-jun N-terminal kinase in G2/M arrest and caspase-mediated apoptosis induced by sulforaphane in DU145 prostate cancer cells[j]. Nut r.cancer, 2005, 52(2): [5] Chio S, Lew KL, Xiao H, et a1. L-Sulforaphane-induced cell death inhuman prostate cancer cells is regulated by inhibitor of apoptosis family proteins and Apaf21[J].Carcinogenesis, 2007, 28(1): [6] Wolf B.B, Green D.R. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by casepase family proteinases[j]. Biol. Chem, 1999, 274: [7] Vane J R,Bottiong R M.Mechanism of action of nonsteroidal antiinflammatory drugs.[j].am J Med,1998,104(3A):2S-8S. [8] Folkman J.what is the evidence that tumors are angiogenesis dependent[j].natl Cancer Inst,1990,82(1):4-6. [9] 翁秀华, 翁绳美, 林菁. 常见的前列腺癌基因和抑癌基因研究进展 [J]. 医学综述, 2006, 12(10): [10] Catz SD,Johnson JL.BCL-2 in prostate cancer:aminireview[j].apoptosis, 2003, 8(1): [11] Michael O, Hengartner. The biochemistry of apoptosis[j]. Nature, 2000, 12(10):

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