便携扫描式荧光仪的研发 赵忠龙 1, 杨志伟 1, 王海 1, 张晶 2, 闵小平 1,2, 葛胜祥 (1 厦门大学信息科学与技术学院计算机科学系, 福建厦门 ; 2 厦门大学国家传染病疫苗与诊断试剂研究工程中心, 福建厦门 ) 2 摘要 : 为了能够实现对血液中特定抗原浓度

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1 便携扫描式荧光仪的研发 赵忠龙 1, 杨志伟 1, 王海 1, 张晶 2, 闵小平 1,2, 葛胜祥 (1 厦门大学信息科学与技术学院计算机科学系, 福建厦门 ; 2 厦门大学国家传染病疫苗与诊断试剂研究工程中心, 福建厦门 ) 2 摘要 : 为了能够实现对血液中特定抗原浓度的即时检测 (POCT), 研制了基于时间分辨荧光免疫分析技术的便携式荧光仪 荧光仪以波长为 365nm 的紫外 LED 作为激发光源, 经光学结构产生线光斑进行扫描以及激发荧光信号 ( 波长为 580nm), 最后对光电二极管收集的光信号数据进行平滑 求斜率处理 使用该仪器对我们研发的纸条进行检测, 并分析其灵敏度, 结果表明稀释倍数和检测线面积 / 控制线面积 (AT/AC) 之间乘幂关系较好, 相关系数为 仪器灵敏度 稳定性好, 同时成本很低 关键词 :POCT; 时间分辨荧光 ; 扫描式荧光仪中图分类号 :TH776 文献标识码 :A 目前, 体外诊断行业的一个突出特点是它的两极化发展趋势, 一极是大型自动化医学检验仪器, 另一极是小型 POCT 仪器 其中,POCT 仪器检测过程方便 快速且高效, 获得了市场越来越高的认可度, 在临床应用中的影响不断加强 [1,2,3] POCT 型侧向流纸条检测技术结合定量免疫检测技术在医疗保健 疾病诊断与防治等方面一直发挥着巨大的作用 [4,5] 类似的定量免疫检测方法已经有相关的报道 例如 Li 等人, 为量化上转换发光 (UCP) 粒子并做出其图像, 研制出了二维光学扫描系统, 并将此系统应用于上转换发光颗粒标记免疫检测 在功率为 1.2W, 发光波长为 980nm 的光纤耦合激光二极管上覆盖一个透明的微流控芯片就可以激发 UCP 粒子发光, 这种激发光可用光电倍增器 (PMT) 检测 使用此扫描仪, 从 X 和 Y 两个方向扫描二维纸条只需要八分钟 [6] 本文介绍了一种以时间分辨荧光免疫分析为生物依据的扫描式荧光仪 [7,8,9] 它采用光纤作收发光的通道, 光学扫描采用线扫描的方式, 避免了点扫描的局部性和不稳定性 采用 16 位的 AD 转换器将高灵敏度光电二极管捕捉到的光信号转换成数字信号, 并对收集到的数字信号进行分析, 建立相关的数学模型, 为后面的定量分析做基础 仪器相对其它设备而言, 在保证检测灵敏度的同时, 成本低, 稳定性好 1 实现方法及原理 1.1 时间分辨荧光免疫分析 荧光免疫分析是荧光检测技术和免疫学反应相互结合起来的一种免疫分析方法 其基本实现方法如下 : 使用某种特异性抗体, 在其上标记荧光基团使之成为特异性试剂, 与对应抗原结合形成复合物 [10,11] 使用时间分辨荧光免疫技术进行检测时, 激发光激发标记物后适当延迟一段时间再对标记物荧光进行检测, 可以提升检测灵敏性, 降低本底荧光干扰, 增强稳定性和特异性 而且还具有线性范围更宽, 试剂寿命更长的优点 [12,13]

2 1.2 荧光仪纸条检测原理 荧光仪纸条检测原理如图 1 所示 : 在检测纸条上面贴有一层硝酸纤维素膜, 用于固定抗 原抗体结构 荧光微球 单克隆抗体 抗原 T C 图 1. 荧光纸条检测原理 Fig. 1 Strip detection principle of fluorometer. 纸条前端是质控线 (Control), 质控线由包被羊抗鼠抗体和单克隆抗体 ( 含荧光微球 ) 组成, 包被羊抗鼠抗体可以自动识别单克隆抗体, 并形成稳定结构 所以质控线的荧光强度基本固定, 用于判断纸条是否合格 纸条后端是检测线 (Test), 它由包被单克隆抗体和单克隆抗体组成, 这两者不会结合, 但是分别都可以和抗原结合, 从而形成一个包被单克隆抗体 + 抗原 + 单克隆抗体的夹心结构, 抗原越多, 与之稳定结合固定在硝酸纤维素膜上的荧光微球越多, 从而可以判断荧光强度 将上述纸条放入荧光仪 ( 紫外 LED 灯位置固定 ) 中, 在步进电机的带动下, 纸条以一定的速度移动, 经波长为 365nm 的紫外光照射后,C 线和 T 线处的荧光微球就会被激发出荧光信号 由自主设计的光路结构, 将激发出的荧光信号传递给光电二极管, 光电二极管将荧光信号转换为电压值 最后 AD7707( 模数转换器 ) 将对应的电压值 ( 模拟信号 ) 转化为具体的数值, 交由 ARM 处理器进行下一步的处理 扫描式荧光仪使用的纸条结构如图 2 所示 : 吸附滤纸 玻璃纤维 硝酸纤维素膜 T C 聚氯乙烯 (PVC) 图 2. 纸条结构平面图 Fig. 2 Structure of the test strip 2 光学设计 光学模块是扫描式荧光仪的核心模块, 它控制 着仪器信号源, 对光信号进行传播和接收, 决定着仪器最终检测结果 [14] 所以在光学模块设计过程中, 需要提高激发光光源工作稳定性, 降低激发光传输衰减度 为此, 选择高灵敏度光电二极管 (ODA-6WB-500M) 和石英光纤, 具体图 3 如下 :

3 图 3. 光学模块设计图 (1)LED 光源 (2) 光电二极管 (3 4) 滤光片 (5) 处理器 (6) 光纤 (7) 荧光纸条 (8) 可移动卡仓 Fig. 3 Design of the optical module 从图 3 可知, 发射光源 1 产生的紫外光, 经带通紫外滤光片 3( 透光范围为 nm, 能有效过滤掉其他波长的光 ) 过滤后将波长为 365nm 的光传递到光纤 A 端, 经光纤从 B 端照射到荧光纸条 7 上, 激发出荧光, 荧光信号经光纤传递到 C 端 镀膜有色玻璃滤光片 4 将波长在 580nm 以上的光线过滤掉, 光电二极管 2 接收最终的荧光信号 其中光纤 ( 呈 Y 型 ) 负责对光形状转换传递等, 具体如下 : 图 4. 光纤刨面图 Fig. 4 Cross-section of the optical fiber 从图 4 可知, 左端通光 2 连接 LED 灯接口, 用于传播 LED 灯发射的紫外光 在最右端将柱形 2 光转成切面为条形的光 ( 长度等于纸条上检测线宽度 ), 由右端通光 2 照射到纸条上 在紫外光的照射下, 纸条上的荧光颗粒就会被激发出荧光, 右端通光 1 将此荧光传递给左端通光 1 供光电二极管接收 光电二极管将接收到的荧光经过处理, 传递给模数转换芯片进行下一步的处理 3 数据处理 3.1 读值检测原理 对纸条进行一次扫描, 可以检测到两个荧光波峰, 记录下两个波形面积之比, 然后利用浓度已知的标准纸条进行大批量生物实验, 建立如下数学模型 : AT/AC~ 检测物试剂浓度 最后利用建立起来的数学模型去判断未知的检测试剂浓度 3.2 算法过程

4 在数学中, 针对连续的数学模型, 我们使用求导并对导函数分析来获得某曲线的波峰信息 根据此思想, 一次检测完成, 获得模数转换以后的 1200 个荧光数据点 (Data[1200]) 如图 5, 我们做如下处理 : 平滑 图 5. 原始数据示意图 Fig. 5 Origin data 对于得到的原始数据, 会有锯齿数据存在, 对此我们要先进行平滑 : 设置窗口大小为 11, 即取当前点前后各五个 ( 共 11 个 ) 点的平均值作为当前点的值 其中窗口滑动范围为 5~ 求斜率 Data[i], i 5 或 i 1195 Smooth[i] = { Data[i 5] + + Data[i + 5], 其他 11 过滤掉锯齿数据之后, 就可以求 Smooth[1200] 的斜率 由于操作点是离散点, 所以我 们借用求导的原理 : 其中 :(x 1, y 1 ), (x 2, y 2 ) 为相邻的点 图 6. 求导原理 Fig. 6 Principle of derivation x = 1, y = y 2 y 1, d = y/ x 这里我们使用了一个长度为 2 的窗口进行滑动 当前点的斜率可表示为 : Smooth[i + 1] Smooth[i 1] Slope[i] = 2 其中,i 的取值范围 5~1195 Slope[1200] 如下图所示 :

5 3.2.3 求面积 图 7. 斜率示意图 Fig. 7 Slope data 图 8. 面积示意图 Fig. 8 Area 在求面积之前, 我们首先要找到波峰的起始点 在求起始点的时候, 为了精确, 对 Slope 数据进行大量实验确定滑动窗口为 10, 即从 Data[i] 到 Data[i+9] 共十个点的平均值作为当前点的斜率 起点 :Begin[j] = i, Slope[i]+ +Slope[i+9] 10 > 0.4 要得到终点, 就需要先找出开始下降的点 : 下降点 :De[j] = i, Slope[i]+ +Slope[i+9] 10 终点 :End[j] = i, Slope[i]+ +Slope[i+9] 10 其中,j 的范围为 :10~ < 0.5 > 0.5 最后一步求面积, 假设 : 基线值 波峰宽度 毛面积 ( 荧光面积与基线面积之和, 图 8 中 Area1+Area1.1) 净面积 ( 荧光面积, 图 8 中 Area1) 依次如下 :

6 Data[Begin[j]] + Data[End[j]] basevalue = 2 Width = End[j] Begin[j] Gross8Area = Data[Begin[j]] + + Data[End[j]] NetArea = GrossArea basevalue Width 通过以上分析, 即可得到图 5 中波峰的信息, 具体如下 : 表 1 波峰检测结果 Tab.1 Result of peak recognition 峰 1 峰 2 峰起点 峰终点 峰面积 性能分析 为了测试荧光仪的灵敏度, 用其来检测血液中丙型肝炎病毒抗原 (HCV) 的浓度 控制线 (C 线 ) 为羊抗鼠多抗, 检测线 (T 线 ) 为 12F12 抗体 ( 起包被作用 ), 样品垫中为 W4G3 抗体 ( 含荧光颗粒, 起标记作用 ) 在吸收垫的作用下, 血液中的 HCV 抗原 12F12 抗体 W4G3 抗体三者在 T 线处结合形成稳定结构,W4G3 和羊抗鼠多抗在 C 线处结合成稳定结构 使用标准纸条 ( 波形平滑规则, 波形完整且居中的优质纸条 ) 进行测试 使用扫描式荧光仪对已知固定浓度样本按不同比例进行稀释, 检测得到 AT/AC 的值如下 : 表 5-1 AT/AC 与稀释倍数 Tab.2 AT/AC and dilution ratio 编号 1 编号 2 编号 3 编号 4 编号 5 编号 6 稀释倍数 AT/AC 由 AT/AC 与稀释倍数得到乘幂趋势线如下 : AT/AC y = x R² = 稀释倍数 图 9 AT/AC 与稀释倍数线性关系 Fig. 9 Dilution ratio AT/AC linear relationship 由图 9 可知, 随着稀释倍数成倍的增大,AT/AC 值也呈现出规律性变化, 在稀释倍数足够大的时候, 仪器检测出的值逐渐趋于一致, 这与我们预计的一致 试验中, 可检测出丙型

7 肝炎病毒抗原 (HCV) 的浓度最小可达固定浓度的 1/640, 这与酶联免疫吸附实验 (ELISA) 的灵敏度相当 通过添加乘幂趋势线可得到 :y = x , 相关系数 R²=0.9943, 由相关系数可以说明, 荧光仪检测出的 HCV 浓度线性关系良好, 也进一步说明了荧光仪的检测灵敏度高, 具备较佳临床应用价值 6 总结 本文主要讲述以时间分辨荧光免疫分析技术为生物检测原理实现扫描式荧光仪的研发 扫描式荧光仪工作时, 紫外 LED 灯发出的光经过光学结构后, 以条形光束照射在荧光颗粒标记的纸条上, 模数转换器将高灵敏度光电二极管检测到的荧光信号转换成数字信号, 交由处理器, 至此完成一个条形区域 ( 长 4mm, 宽 0.8mm) 荧光强度的采集 并设计算法对检测到的离散数据进行处理, 构建并根据 AT/AC~ 检测物浓度 数学模型计算出待检测物质的浓度 通过大量生物实验表明, 扫描式荧光仪具有检测速度快 高可重复性 数据线性关系好等优点 此外, 根据抗原 抗体结合的特异性, 设计出对应的荧光纸条, 就能很好的对血液中不同物质进行快速检测, 而且仪器采用紫外 LED 作为激发光源以及光电二极管进行光电转换, 使仪器的成本很低 参考文献 [1] Luppa P B, Müller C, Schlichtiger A, et al. (2011) Point-of-care testing (POCT): Current techniques and future perspectives. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 30(6): [2] 董作亮. POCT 的研究进展 [J]. 国外医学. 临床生物化学与检验学分册,2003,03: [3] 张明明, 郑佐娅. POCT 的研究进展及应用 [J]. 国际检验医学杂志,2006,11: [4] 李怀明, 赖卫华, 许恒毅, 等. 基于荧光硅球的克伦特罗快速定量免疫层析试纸条的研制 [J]. 分析化学,2011,11: [5] Qiu X, Liu C, Mauk M G, et al. (2011) A portable reader for pouch-actuated, immunoassay cassettes, Sensors and Actuators B: Chemica, 160(1): [6] 杜海燕, 杨志萍, 孙家跃. 上转换发光材料及发光效率研究及展望 [J]. 化工新型材料,2009,09: [7] 田振, 郭周义. 时间分辨荧光免疫分析仪的临床实验方法和评价方案 [J]. 激光生物学报,2005,04: [8] 杭建峰, 吴英松, 李明. 时间分辨荧光免疫分析的研究进展及应用 [J]. 热带医学杂志,2004,03: [9] 解肖鹏, 张雷. 时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展 [J]. 食品与药品,2012,05: [10] 张振亚, 梅兴国. 现代荧光免疫分析技术应用及其新发展 [J]. 生物技术通

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