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1 J South Med Univ, 206, 36(5): doi /j.issn 基础研究 4. 门颖丽, 康巧珍, 丁聪, 刘诗梦, 江慧, 王晓东, 汲振余 2, 刘鑫, 王婷郑州大学生命科学学院, 2 河南省医药科学研究院, 河南郑州摘要 : 目的筛选小鼠黑色素瘤细胞中蛋白 4. 家族的表达, 探讨蛋白 4. 对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响方法以 MEF 6 6-F0 细胞基因组 RN 和总蛋白为模板, 经 PCR 法和 Western blot 筛选蛋白 4. 在小鼠黑色素瘤细胞中的表达 ; 通过分子克隆构建真核表达载体 pegfp-n-ep4l3 并转染黑色素瘤细胞 ; 检测表达蛋白 4. 后 6 6-F0 细胞增殖的变化结果蛋白 4. 在黑色素瘤细胞中表达缺失 ; 通过转染成功构建的真核表达载体 pegfp-n-ep4l3 发现, 表达蛋白 4. 的黑色素瘤细胞的增殖作用被显著性抑制结论通过真核表达载体 pegfp-n-ep4l3 转染表达蛋白 4. 可显著抑制 6 和 6-F0 黑色素瘤细胞的增殖关键词 : 黑色素瘤细胞 ; 蛋白 4.; 真核表达 ; 抑制增殖 Expression of protein 4. family in melanoma cell lines and its effect on cell proliferation MEN Yingli, KNG Qiaozhen, DING Cong, LIU Shimeng, JING Hui, WNG Xiaodong, JI Zhenyu 2, LIU Xin, WNG Ting School of Life Sciences, Zhengzhou University, 2 Institute of Medicine of Henan Province, Zhengzhou , China bstract: Objective To detect the expression of protein 4. family members in mouse melanoma cell lines and evaluate their effect on cell proliferation. Methods PCR and Western blot were used to detected to the expression of protein 4. family members (4.R, 4., 4.G, and 4.N) at the mrn and protein levels in 6 and 6-F0 cell lines. The expression plasmid vector pegfp-n-ep4l3 carrying 4. gene sequence amplified from genomic RN of mouse embryo fibroblasts was constructed and transiently transfected into mouse melanoma cells. The change in cell proliferation was assessed using MTT assay. Results The mrn and protein expressions of all the protein 4. family members, with the exception of 4., were detected in both 6 and 6-F0 cells. Transfection of cells with the eukaryotic expression vector pegfp-n-ep4l3 markedly inhibited cell proliferation as compared with the non-transfected cells. Conclusion The eukaryotic expression vector carrying EP4L3 sequence is capable of inhibiting the proliferation of mouse melanoma 6 and 6-F0 cells. Key words: mouse melanoma cells; protein 4.; eukaryotic expression vector; inhibiting proliferation 近年来, 大量研究证实在许多恶性肿瘤中蛋白 4. 的表达呈不同程度的下降或缺失, 它的异常表达会导致 [-3] 肿瘤发生及肿瘤的恶化蛋白 4. 是 4. 家族 ( 包括 [4-5] 4.R 4. 4.N 和 4.G) 的重要成员, 由 EP4L3 基因编码蛋白 4. 定位在细胞与细胞之间的接触位点, 作为衔接蛋白连接细胞质膜与细胞骨架或者胞质效应分子, 介导细胞骨架相关的细胞运动和粘附 ; 调节细胞 [6] 生长分化上皮样结构的建立 4. 发挥了细胞骨架连接蛋白对肌动蛋白应力纤维的调节作用, 从而抑 [7] 制细胞的运动性发挥抑癌作用 ; 在多种肿瘤细胞中, 蛋收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 (83739,857526) Supported by National Natural Science Foundation of China (83739, ). 作者简介 : 门颖丽, 在读硕士研究生, menyingli@26.com 通信作者 : 王婷, 讲师, 博士, tingwang@zzu.edu.cn 白 4. 的表达对于细胞增殖调控细胞黏附及信号转导 [8-9] 均有重要意义蛋白 4. 可能是人类癌症的一个重要的预后指标, 也可能是一个潜在的抗肿瘤治疗的靶点恶性黑色素瘤 (malignant melanoma, MM) 又称为恶黑, 发病率占皮肤恶性肿瘤的第 3 位, 也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一, 年增长率为 3%~5%, 其恶性度 [0-] 高转移早, 预后差, 死亡率高在本研究中, 以 MEF 细胞为阳性对照, 利用 PCR 技术扩增蛋白 4. 家族, 经过筛选得出 : 在核酸及蛋白水平,4. 在小鼠黑色素瘤细胞系 6 6-F0 细胞均呈现缺失表达研究结果表明 EP4L3 可能是肿瘤抑制基因, 但其在肿 [2-3] 瘤发生发展过程中的功能仍不完全清楚本研究中通过构建真核表达载体 pegfp-n-ep4l3, 将 EP4L3 基因导入 6 6-F0 细胞, 并成功使其表达蛋白 4., 进一步验证了蛋白 4. 在小鼠黑色素瘤细胞系中的肿瘤抑制作用

2 650 J South Med Univ, 206, 36(5): 材料和方法. 细胞株野生型 C57L/6 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF 细胞 ) 以及 4. 敲除的 MEF 细胞 (MEF 4.-/-) 由美国纽约血液中心安秀丽教授惠赠, 小鼠黑色素瘤细胞系 6 和 6-F0 购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 MEF 6 6-F0 细胞均用含 0% 胎牛血清的 DMEM 培养基, 分别于 37,5% CO 2 的培养箱中培养, 根据细胞生长情况, 每 2~3 d 用含 EDT 的胰酶消化 MEF 6 细胞并传代, 用不含 EDT 的胰酶消化 6-F0 细胞并传代, 传代至对数生长期做相关细胞实验.2 主要材料及试剂兔抗鼠 4.R 4.G 4.N 4. 多克隆抗体由美国纽约血液中心安秀丽教授惠赠 ;HRP- 羊抗兔 IgG 购买于武汉博士德生物工程有限公司 ; 胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司 ; 兔抗鼠 EGFP 单克隆抗体由美国血液中心安秀丽教授惠赠 ;DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 购于美国 Gibco 公司 ;Trizol 试剂 PrimeSTR TM HS(Premix) DN Maker XhoⅠ amh Ⅰ 内切酶和 T 4 连接酶购于 TaKaRa 公司 ; UltraSYR Mixture 购于北京康为世纪生物科技有限公司 ;Revertaid first strand cdn synthesis kit 购于 Fermentas 公司 ; 转染试剂 Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司基因测序由金唯智公司完成.3 引物设计根据 Geneank 上所提供的小鼠 EP4 EP4L3 EP4L EP4L2 及内参 β-actin 的 mrn 序列, 采用 Primer Premier 5 软件设计 EP4 EP4L3 EP4L EP4L2 及内参 β-actin 各自的特异性 PCR 引物 ( 表 ) pegfp-n-ep4l3 真核表达载体引物设计后应用 LST 软件进行在线筛查对比, 以消除潜在的同源干扰, 上游引物 ( 引入 Xho I 位点 ): 5'-CTCGGTGCGCCGTCGGTCG CTCGTCGGC-3'; 下游引物 ( 引入 amh I 位点 ):5'-GGTCCCGTCCTCTCCGTCCTCTGG TGTGTT-3'( 划线部分为酶切位点, 前面为保护碱基 ) 以 EP4L3 基因序列为模板, 根据荧光定量 PCR 引物设计原则, 设计 EP4L3 特异性的引物序列 ( 表 2).4 PCR 扩增蛋白 4. 家族基因待细胞生长至状态良好,TRIzol 法提取 MEF MEF 4.-/- 6 6-F0 细胞基因组 RN,Nanodrop 2000 测得 RN 浓度及纯度, 以不大于 μg 的 RN 利用反转录试剂盒合成 cdn 以反转录产物为模板进行 PCR 反应, 反应体系 50 μl:cdn 2 μl, 上下游引物各 2 μl, 高保真酶 Premix 25 μl,ddh 2O 9 ul PCR 反应条件 :94 5 min;94 30 s,60 30 s,72 3 min, 共表 4. 蛋白家族 PCR 引物序列 Tab. Primer sequences for amplification of the 4. protein family members Gene EP4 EP4L2 EP4L EP4L3 β-actin 30 个循环 ;72 0 min 扩增后取 PCR 产物 5 ul 于 % 琼脂糖凝胶中电泳, 于凝胶图像分析系统下观察并拍照 Sequence of primers (5'-3') Forward: TGCCGGGGTTTGTGGCTGGC Reverse: CTCCTCGGTCTCTGTCTCCTGGTGG Forward: TGCTCTGGTTGGCTCTGCTCTGGTG Reverse: TTTTCTTCTCCTTCCTCCGCCCTCTG Forward: TGCCGGCGGTCCCGTTCTG Reverse: TCGGTTCCTGTGGCTTCTTGTCTC Forward: TGCGCCGTCGGTCGCTCG Reverse: TCTCCTCTCCGTCCTCTGGTGTGTT Forward: GCCTCCTGCGTCTGGCCTGGCTG Reverse: CGGCTCTCGTCTCCTGCTTGCTGTCC 表 2 EP4L3 的 qpcr 引物序列 Tab.2 Gene-specific primers used for quantitative real-time PCR of EP4L3 Gene Sequence of primers (5'-3') EP4L3 GPDH Forward: TGCGCTCTGCCTGCT Reverse: CCTTGCGGGTCCCCG Forward: GCTTGTCTCCGGGG Reverse: TTTGTGTTGTGGGGTCTCG.5 Western blot 检测蛋白 4. 的表达培养 MEF 6 6-F0 细胞, 当细胞铺满瓶底时, 胰酶消化收集细胞,000 r/min,5 min 离心收集细胞, 并用 PS 清洗 3 遍加入 200 μl 裂解液和 2 μl PMSF, 冰上裂解 30 min,4,2 000 r/min,5 min, 取上清用 C 法酶标仪 570 nm 测蛋白浓度, 调整蛋白浓度使其一致, 加入 2 Loading buffer, 水浴煮沸 5 min 细胞总蛋白经 0% SDS-PGE 分离后, 湿转法转膜到 NC 膜用含 50 g/l 脱脂奶粉的 TST 封闭 2 h,tst 冲洗 3 次,0 min/ 次分别加入兔抗鼠 4.R 4.N 4.G 和 4. 多克隆抗体 ( 00),4 孵育过夜,TST 冲洗 3 次,0 min/ 次加入 HRP- 羊抗兔 lgg( 4000),37 水平摇床孵育 h,tst 冲洗 3 次,0 min/ 次 ECL 试剂盒显色发光,zure c600- 多功能分子成像系统采集图像.6 Real time PCR 法检测 4. mrn 相对表达量以 GPDH 为内参, 使用荧光定量 PCR Mix 进行 real time PCR, 反应体系 20 μl:pcr Mix 0 μl,ddh 2O 6.4 μl, 正反向引物各 0.8 μl,cdn 模板为 2 μl 反应条件为 :95,0 min;95 5 s,60 min, 共 40 个循

http://www.j-smu.com J South Med Univ, 206, 36(5): 649-654 65 环 ; 溶解曲线,60 到 95 梯度升温溶解实验数据采用 Ct 法统计分析.

3 J South Med Univ, 206, 36(5): 环 ; 溶解曲线,60 到 95 梯度升温溶解实验数据采用 Ct 法统计分析.7 构建 pegfp-n-ep4l3 真核表达载体将真核表达载体 pegfp-n 与 EP4L3 基因纯化产物分别经 XhoⅠ amhⅠ 双酶切和胶回收, 利用 T4 连接酶进行连接, 将 EP4L3 基因导入 pegfp-n 表达载体中, 经转化到 DH5α 宿主菌后涂布于 L 平板, 挑取单菌落并提取质粒进行酶切鉴定, 再经过 DN 测序进一步确认验证正确后再进行大量扩增, 保存重组质粒, 命名为 pegfp-n-ep4l3.8 pegfp-n-ep4l3 重组质粒转染黑色素瘤细胞系 6 6-F0 当黑色素瘤细胞系 6 6-F0 细胞成长状态良好时, 消化处理细胞并用血球计数板计数, 将个细胞重悬于 ml DMEM 培养液中, 转移至 6 孔细胞培养板, 培养 24 h 左右, 待单层细胞生长融合度达到 70% ~90% 时可进行转染细胞实验分组 : 转染试剂空白对照组 (Control) pegfp-n 组以及 pegfp-n-ep4l3 实验组, 瞬时转染 24 h 后, 荧光显微镜观察 Western blot 检测 4. 的表达,EGFP( 2000), 二抗 ( 6000).9 MTT 法检测蛋白 4. 对黑色素瘤细胞系 6 6-F0 细胞增殖的影响收集上述各实验组细胞,6-F0 细胞以 / 孔,6 细胞以 / 孔接种于 96 孔板, 每孔培养液总量为 200 μl, 于 37 5% CO 2 培养箱中培养, 分别在 h 换成无血清培养基, 每孔加入 20 μl 5 mg/ml 的 MTT 孵育 4 h 后终止培养, 弃上清, 每孔加入 50 μl DMSO, 将培养板置于酶标板, 振荡 0 min, 然后 570 nm 处检测各孔吸光度增殖率 =( 实验组 - 对照组 )/ 对照组.0 统计学处理计数数据以均数 ± 标准差表示, 采用 GraphPad Prism 5.0 软件进行分析, 两组间采用 student's T test 比较, 以 P<0.05 表示差异具有统计学意义 2 结果 2. 蛋白 4. 家族成员在小鼠黑色素瘤细胞中的表达筛选以 MEF 细胞的 cdn 为模板进行 PCR,EP4 EP4L3 EP4L EP4L2 基因均有目的条带, 说明在 MEF 细胞中, 蛋白 4. 家族核酸水平均正常表达, 这与文献报道相符, 因此 MEF 作为阳性对照是可信的以黑色素瘤细胞系 6 和 6-F0 的 cdn 为模板进行 PCR, 核酸水平验证蛋白 4. 家族的表达 ( 图 ); 以总蛋白为模板采用 Western blot 的方法验证蛋白 4. 家族在蛋白水平的表达情况 ( 图 ) 结果提示 : 在核酸和蛋白水平, 蛋白 4. 在 6 和 6-F0 中均表达缺失 2.2 重组质粒 pegfp-n-ep4l3 的鉴定提取 MEF 细胞总 RN, 逆转录为 cdn,pcr 扩增小鼠 EP4L3 基因利用 T 4 连接酶将经 XhoⅠ amhⅠ 双酶切的 EP4L3 片段和 pegfp-n 载体进行连接, 随后连接产物转化到 DH5α 感受态细胞中, 挑取经 Kana 筛选的菌落进行培养, 提取质粒, 质粒产物经 XhoⅠ 单酶切,XhoⅠ amhⅠ 双酶切, 并进行 % 琼脂糖凝胶电泳后可见约 7.3kb 线性化 pegfp-n- EP4L3 重组质粒 4.7 kb 线性化 pegfp-n 载体和 2.6 kb 的 EP4L3 条带 ( 图 2), 测序结果与 Genebank 中的 EP4L3 序列完全一致结果表明, 重组载体 pegfp-n-ep4l3 构建成功 bp M Normalized EP4L MEF MEF 4.-/- 6 6-F0 4.R G N GPDH GPDH GPDH GPDH 图蛋白 4. 家族成员在小鼠黑色素瘤细胞中的表达筛选 Fig. Expression of protein 4. family members in melanoma cells. : mrn expression of 4. family members in MEF, 6, and 6-F0 cells detected by real-time PCR. M: DN marker (DL5000); Lanes, 4, 7, 0: Expression of EP4, EP4L2, EP4L, and EP4L3 mrn in MEF cells, respectively; Lanes 2, 5, 8, : Expressions of EP4, EP4L2, EP4L, and EP4L3 mrn in 6 cells, respectively; Lanes 3, 6, 9, 2: Expression of EP4, EP4L2, EP4L, and EP4L3 mrn in 6-F0 cells. P<0.00; : Expressions of 4. protein family members detected by Western blotting. : MEF cells; 2: 6 cells; 3: 6-F0 cells.

652 J South Med Univ, 206, 36(5): 649-654 http://www.j-smu.com 4.

250 7328 4700 2628 图 2 MEF 细胞中 EP4L3 外显子图谱 () 及 pegfp-n-ep4l3 重组质粒 XhoⅠ 和 amhⅠ 酶切鉴定结果 () Fig.

digestion (). 2.3 pegfp-n-ep4l3 转染上调蛋白 4.

荧光显微镜分析结果说明,pEGFP-N-EP4L3 载体在黑色素瘤 6 6-F0 细胞中表达了 EGFP-4.

融合蛋白 ( 图 4);Western blot 检测结果显示, 与 control 和 pegfp-n 细胞相比, pegfp-n- EP4L3 转染的 6 6-F0 细胞表达了蛋白 4.

4 652 J South Med Univ, 206, 36(5): , 5, 6 U (HP) FERM F U2 S U3 CTD 2' C TG bp M 2 bp 图 2 MEF 细胞中 EP4L3 外显子图谱 () 及 pegfp-n-ep4l3 重组质粒 XhoⅠ 和 amhⅠ 酶切鉴定结果 () Fig.2 Exon composition of EP4L3 isoforms in MEF cells () and identification of pegfp-n-ep4l3 plasmid by Xho I and amh I digestion (). 2.3 pegfp-n-ep4l3 转染上调蛋白 4. 核酸及蛋白水平的表达将 pegfp-n-ep4l3 瞬时转染小鼠黑色素瘤细胞 6 6-F0 细胞 24 h 后, 在荧光显微镜下观察到 6 和 6-F0 细胞发出清晰的绿色荧光信号 ( 图 3), 荧光显微镜分析结果说明,pEGFP-N-EP4L3 载体在黑色素瘤 6 6-F0 细胞中表达了 EGFP-4. 融合蛋白 pegfp-n-ep4l3 载体转染导入 6 和 6-F0 细胞 24 h 后,Real-time PCR 分析结果进一步说明,pEGFP-N- EP4L3 载体在 6 6-F0 细胞中表达了 EGFP-4. 融合蛋白 ( 图 4);Western blot 检测结果显示, 与 control 和 pegfp-n 细胞相比, pegfp-n- EP4L3 转染的 6 6-F0 细胞表达了蛋白 4.( 图 5) pegfp-n pegfp-n-ep4l3 6-F0 cell 6 cell C D 图 3 pegfp-n-ep4l3 重组质粒在 6-F0 6 细胞中表达 EGFP-4. 融合蛋白 Fig.3 Expression of EGFP-4. fusion protein in 6 and 6-F0 cells transfected with pegfp-n-ep4l3 recombinant plasmid. 2.4 重组质粒 pegfp-n-ep4l3 转染黑色素瘤细胞抑制 6 6-F0 细胞体外增殖 MTT 实验结果显示, 蛋白 4. 的表达对黑色素瘤细胞 6 6-F0 的增殖均有抑制作用在第 2,3 天, 外源蛋白 4. 的表达对 6-F0 细胞增殖有显著性抑制作用 ;6 细胞的 MTT 结果显示从第天起蛋白 4. 的表达就对 6 细胞增殖起抑制作用 ( 图 6)

5 J South Med Univ, 206, 36(5): Normalized EP4L F0 pegfp-n 6-F0 pegfp-n-ep4l3 6 pegfp-n 6 pegfp-n-ep4l3 图 4 Real-time PCR 分析重组质粒 pegfp-n-ep4l3 转染后 6-F0 6 细胞 EP4L3 基因 mrn 水平的表达 Fig.4 EP4L3 mrn expression level analyzed by real-time PCR in 6 and 6-F0 cells transfected with pegfp-n-ep4l3 recombinant plasmid. P<0.00 pegfp-n-ep4l3 vs pegfp-n EGFP-4. EGFP EGFP-4. EGFP 图 5 Western lot 分析重组质粒 pegfp-n-ep4l3 转染后 6-F0 6 细胞 4. 蛋白水平的表达 Fig.5 Expressions of 4. protein detected by Western blotting in 6-F0 cells () and 6 cells () transfected with pegfp-n-ep4l3 recombinant plasmid. : Nontransfected cells; 2: Cells transfected with pegfp-n; 3: Cells transfected with pegfp-n-ep4l3. 3 讨论蛋白 4. 超家族不仅在维持细胞形态连接细胞表面糖蛋白和细胞骨架方面起重要作用 [4], 在肿瘤发生发展转移中也起到重要的调控作用蛋白 4. 与血影蛋白 - 肌动蛋白 [5] 蛋白家族 [6] 整合素 [7-8] 肺癌肿瘤抑制因子 (tumor suppressor in lung cancer-, TSLC-) [3, 9] 等分子相互作用发挥肿瘤抑制因子的作用近年研究表明在多种肿瘤细胞中, 蛋白 4. 的表达对于细胞增殖 [6] 运动性 [20] 黏附 [9] 信号转导 [6] 上皮间质转化 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT) [2-22] 等都具有重要意义蛋白 4. 在多种组织中都有表达, 相关研究证实蛋白 4. 在多种恶性肿瘤或良性肿瘤如非小细胞肺癌 [2] 前列腺癌 [23] 肾细胞癌 [24] 卵巢 [25] 癌等中出现表达缺失或下调本课题组选取小鼠黑色素瘤细胞 6 黑色素瘤高转移细胞 6-F0 作为研究对象, 以 MEF 细胞为阳性对照, 首次发现, 蛋白 4. 在小鼠黑色素瘤细胞系 6 6-F0 细胞中显著性表达缺失推测蛋白 4. 可能在黑色素瘤细胞的恶化过程中具有一定作用我们选择了 pegfp-n 真核表达系统, 成功构建了 pegfp-n-ep4l3 重组质粒, 瞬时转染小鼠黑色素细胞 6 6-F0, 成功获得了表达蛋白 4. 的细胞系 MTT 法检测细胞增殖显示外源蛋白 4. 抑制黑色素瘤细胞的增殖, 依据相关文献推测蛋白 4. 可能通过以下两种通路抑制细胞生长 : 蛋白 4. 的非保守区 (U2) 定位在细胞质膜, 通过依次激活 Src Rac MLK3 和 JNK, 从而减少细胞周期蛋白 (cyclin ) 的表达, 降低 Rb 蛋白过磷酸化 [26] ; 蛋白 4. 与它的结合配偶体 PRMT5 相互作用, 通过甲基化组蛋白 H4 抑制细胞周期蛋白 E 启动子活化间接抑制细胞生长 [27] 前期实验结 Proliferation rate (%) Control pegfp-n pegfp-n-ep4l Incubation time (day) Proliferation rate (%) Control pegfp-n pegfp-n-ep4l Incubation time (day) 图 6 EGFP-4. 蛋白抑制 6-F0() 6() 细胞的体外增殖 Fig.6 Proliferation of 6-F0 (, cells) and 6 cells (, cells) transiently transfected with EGFP-4. recombinant plasmid. The data are presented as absorbance at 570 nm. P<0.00 pegfp-n-ep4l3 vs pegfp-n or Control. 果显示 6 6-F0 细胞表达外源蛋白 4. 后, 在显微镜下可观察到细胞形态逐渐变圆, 随着培养时间延长, 细胞逐渐脱离, 表现出细胞凋亡特征有研究证实蛋白 4. 可通过 TLR4 或 gab- 激活 JNK, 启动凋亡蛋 [28] 白酶介导的凋亡或依赖凋亡蛋白酶 8 介导细胞凋 [29] 亡推测蛋白 4. 在抑制黑色素细胞增殖和促进其

6 654 J South Med Univ, 206, 36(5): 凋亡过程中发挥着重要作用, 蛋白 4. 的缺失表达可能是导致黑色素瘤恶性度高易发生转移的原因之一在多种肿瘤进展的早期阶段, 蛋白 4. 表达量的不同程度下降会启动肿瘤生成本研究结果表明,4. 蛋白表达缺失的黑色素瘤细胞 6 和 6-F0 重新表达 4. 蛋白后, 其细胞增殖作用被显著性抑制, 这进一步证实 EP4L3 基因编码的蛋白 4. 可能是肿瘤进展中的负调控分子因此, 通过使肿瘤细胞表达 4. 蛋白可能成为新的肿瘤治疗方式, 通过 DN 甲基转移酶抑制剂抑制 EP4L3 基因启动子去甲基化, 通过腺病毒慢病毒质粒使缺失 EP4L3 基因的肿瘤细胞重新表达蛋白 4. 有望成为新的肿瘤治疗策略参考文献 : [] Xi C, Ren CX, Hu J, et al. Defective expression of Protein 4.N is correlated to tumor progression, aggressive behaviors and chemotherapy resistance in epithelial ovarian cancer[j]. Gynecol Oncol, 203, 3(3): [2] Zhang YJ, Xu R, Li GQ, et al. Loss of expression of the differentially expressed in adenocarcinoma of the lung (DL-) protein is associated with metastasis of non-small cell lung carcinoma cells[j]. Tumor iol, 202, 33(6): [3] Takahashi Y, Iwai M, Kawai T, et al. berrant expression of tumor suppressors CDM and 4. in invasive lesions of primary breast cancer[j]. reast Cancer, 202, 9(3): [4] aines J, Lu HC, ennett PM. 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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽