332 检验医学 2012 年 5 月第 27 卷第 5 期 人体 TDP TMP 和 FT 的含量之和接近于人体总硫胺素含量 由于 TDP 在红细胞中的代谢与其他器官相似, 检测血液的 TDP 含量可用来估算人体总的硫胺素含量 [3] 但以往的硫胺素检测方 [4] 法不能将硫胺素各磷酸酯单独定量,

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1 331 文章编号 : (2012) 中图分类号 :Q563 文献标志码 :A 全血硫胺素及其衍生物的高效液相色谱检测方法的建立 费国强 1, 李晓鸽 2 1, 钟春玖 (1. 复旦大学附属中山医院, 上海 ;2. 中科院上海有机化学研究所, 上海 ) 摘要 : 目的建立一种稳定 快捷的全血硫胺素及其磷酸酯衍生物高效液相色谱 (HPLC) 荧光检测方法 方法全血样本经三氯乙酸 (TCA) 去蛋白处理 铁氰化钾衍生, 产生能被 HPLC 反向柱子经梯度洗脱分离的稳定荧光产物, 通过荧光检测并与硫胺素及其磷酸酯衍生物标准样本比对, 来确定人体全血硫胺素含量 方法通过线性方程 提取率 重复性等指标验证 结果经过检测, 焦磷酸硫胺素 (TDP) 单磷酸硫胺素 (TMP) 和硫胺素的检测限分别为 和 2.5nmol/L, 信噪比 (S/N)>10, 能够满足临床需要 线性趋势良好,r>0.99 硫胺素 TMP 及 TDP 的回收率分别为 103.7% 96.8% 101.7%, 重复性好, 变异系数 (CV)<10% 结论经 TCA 去蛋白 铁氰化钾衍生 梯度洗脱建立的荧光 HPLC 检测硫胺素及其磷酸酯衍生物衍生物的方法可靠, 可用于临床检测 关键词 : 硫胺素 ; 铁氰化钾 ; 高效液相色谱 HPLCdeterminationofthiamineanditsderivativesinhumanwholeblood FEIGuoqiang 1,LIXiaoge 2, ZHONGChunjiu 1. (1.ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2.ShanghaiInstituteof OrganicChemistry,ChineseAcademyofScience,Shanghai200032,China) Abstract:Objective Toestablishastableandrapidmethodfordeterminingthelevelsofhumanwholeblood thiamineanditsphosphateesterderivativesbyhighperformanceliquidchromatography(hplc).methods After bloodproteinswereprecipitatedbytrichloroaceticacid(tca),thiamineanditsphosphateesterswerederivatizedusing potasium fericyanideintothiochromes.thederivativesofthiamineanditphosphateesterswereseparatedbya reversed phasehplccolumnandmeasuredbyfluoroscope.themethodwasvalidatedbytheanalysisoflinearity, extractionratioandrepeatability.results Thelowerlimitsofquantificationofbloodthiaminediphosphate(TDP), thiaminmonophosphate(tmp)andthiaminedeterminationswere8.0,1.5and2.5nmol/lrespectively.thesignalto noiseratio(s/n)fordeterminingthiamineanditsderivativeswas>10.thelinearrelationshipwasstable(r>0.99). TherecoveryratesofTDP,TMPandthiaminewere103.7%,96.8% and101.7% respectively.therepeatabilities weregood.althecoeficientsofvariation(cv)were<10%.conclusions TheHPLCwiththiaminederivatization bypotasiumfericyanidefordeterminingthiamineanditsphosphateesterderivativesisreliableandcanbeusedfor clinicalanalysis. Keywords:Thiamine;Potasiumfericyanide;Highperformanceliquidchromatography 硫胺素即 VitB1, 在体内有以下多种形式存在, 游离硫胺素 (freethiamine,ft) 单磷酸硫胺素 (thiaminemonophosphate,tmp) 焦磷酸硫胺素 (thiaminediphosphate, TDP) 三磷酸硫胺素 (thiaminetriphosphate,ttp) 其中最重要的是 TDP, 约占了硫胺素总量的 90% 以上 TDP 在作为体内能量代谢 ( 碳水化合物 脂肪和酒精 ) 关键酶 α 酮戊二酸脱氢酶 (KGDH) 丙酮酸脱氢酶 (PDH) 和转酮醇酶 (TK) 的辅酶, 直接参与了机体 能量代谢和氧化应激反应 [1] 而 TTP 可能参与体内中枢神经系统离子通道的信号传导 [2] 因此, 硫胺素缺乏可直接导致体积能量代谢障碍和神经系统损害, 如认知功能下降 韦尼克脑病等 由此可见, 能够准确检测人体硫胺素及其磷酸酯衍生物含量, 判断人体是否存在硫胺素缺乏, 不单对临床工作, 而且对于研究硫胺素在人体内的功能及生理作用都具有重要意义 由于 TTP 在体内的含量很低, 在外周血中基本检测不到 所以, 基金项目 : 上海市科委基础重大攻关基金资助项目 (07DJ14005) 作者简介 : 费国强, 男,1974 年生, 硕士, 主要研究方向为硫胺素缺乏与神经变性疾病

2 332 检验医学 2012 年 5 月第 27 卷第 5 期 人体 TDP TMP 和 FT 的含量之和接近于人体总硫胺素含量 由于 TDP 在红细胞中的代谢与其他器官相似, 检测血液的 TDP 含量可用来估算人体总的硫胺素含量 [3] 但以往的硫胺素检测方 [4] 法不能将硫胺素各磷酸酯单独定量, 主要是通过将硫胺素磷酸酯去磷酸化以后, 采用荧光检测总 FT 含量 虽然这种方法目前也在用, 但由于去磷酸化过程需要时间过长, 往往要超过 24h, 且不能直接测定 TDP 含量, 故目前应用在逐渐减少 近年来, 随着免疫荧光技术发展, 发现硫胺素及其磷酸酯衍生物经铁氰化钾衍生, 可以得到稳定的荧光产物 [5], 为人体全血硫胺素及其磷酸酯衍生物的检测创造了条件 目前国内医疗机构均未在开展人体硫胺素的临床检测工作, 也未见相关检测方法的报道 材料和方法 一 主要仪器设备及试剂 1. 主要试剂硫胺素 TMP TDP 标准品 ( 美国 Sigma 公司 ), 铁氰化钾 Na 2 HPO 4 12H 2 O( 国药集团化学试剂有限公司 ), 三氯乙酸 (TCA)( 如皋市化学试剂厂 ), 甲基叔丁醚 ( 美国 Tedia 公司 ), 甲醇 ( 德国 Merck 公司 ) 2. 主要仪器设备 Agilent1100 液相色谱系统 ( 配有 1200 荧光检测器, 安捷伦科技有限公司 ),SC2 超微量电子天平 (Sartorious 公司 ),FA 1004 电子分析天平 ph 计 ( 上海上平仪器有限公司 ), 微型旋涡混合仪 ( 上海沪西分析仪器厂 ), 离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ) 二 检测方法的建立 1. 色谱条件色谱柱 :AgilentExtendC18 柱 (4.6mm 150mm,5μm);pH 值范围 :1~11; 检测温度 : 室温 ; 荧光激发波长 :375nm; 发射波长 : 435nm; 流动相 :A 为 CH 3 OH,B 为 25nmol/L Na 2 HPO 4 (ph 值 7.0) 2. 梯度洗脱见表 1 3. 进样量 10μL 4. 样本预处理 (1) 血样采集 : 采集志愿者外周静脉血 3mL, 肝素抗凝,-80 冻存, 备用 ;(2) 预处理 : 血样室温解冻后取 300μL, 加 300μL TCA, 旋转震荡 3min, 充分混合,10000 g 离心 15min, 取上清 用 0.2μm 膜过滤后, 加入甲基叔丁醚 0.5mL 洗涤 ( 共 3 次 ), 取下清液备用 取去蛋白处理后的上述样本 80 μl+ 甲醇 20μL+ 铁氰化钾 50μL 衍生后即刻进样 标准品的预处理过程同血样 5. 主要检测指标检出下限 线性方程 提取率 荧光物质的稳定性 重复性 结果一 保留时间与检测限的确立标准品经过 TCA 去蛋白处理, 甲基叔丁醚洗涤后, 经铁氰化钾衍生后进样 10μL, 色谱图见图 1; 健康志愿者血样经相同方法处理后进样, 色谱图见图 2 两者 TDP TMP 和硫胺素保留时间基本一致, 分别为 和 7.9min 左右, 单个样本的测试所需时间在 15min 左右 当信噪比 (S/N)>3 可以用作定性检测 S/N>10 可以定量检测 通过不同浓度标样探索,TDP TMP 和硫胺素的定量检出下限约为 nmol/L, 基本能够满足检测需要 图 1 TDP TMP 和硫胺素的标准溶液色谱图 表 1 梯度洗脱 时间 (min) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 图 2 健康人群的血液色谱图

3 333 二 线性配置不同浓度标准品溶液, 经前期处理后, 分 别进样 10μL 检测, 用以确定 TDP TMP 和硫胺素线性关系及方程式 见表 2 图 3~ 图 5 表 2 线性检测不同标准品浓度 溶液 TDP(nmol/L) 峰面积 TMP(nmol/L) 峰面积 硫胺素 (nmol/l) 峰面积 A B C D E 注 :A=2.364C,r=0.998,r 2 =0.996 图 3 硫胺素线性关系及线性方程式注 :A=2.291C,r=0.998,r 2 =0.997 图 4 TMP 线性关系及线性方程式 三 提取率配制标准品 S0(TDP TMP 和硫胺素的浓度分别为 μmol/L) 取 360μL 血样 注 :A=1.740C,r=0.998,r 2 =0.996 图 5 TDP 线性图及线性方程式 3 份, 分别添加 40μLS0 20μLS0+20μLH 2 O 40μLH 2 O, 充分混匀后去取 300μL, 相当于在血样中增加 TDP TMP 硫胺素的浓度分别为 和 nmol/L 如前述标准品预处理办法处理后进样 10μL, 见图 6, 保留时间一致 利用上述线性公式, 计算硫胺素 TMP TDP 的提取回收率分别为 103.7% 96.8% 101.7% 和 102.7% 103.4% 98.6% 提取回收率符合检测要求 四 荧光物质的稳定性正常血样加标准品, 反应后立即进样与室温不避光放置约 40min 后进样, 结果重复, 证明产物稳定 见图 7 图 6 TDP TMP 和硫胺素的提取回收率

4 334 检验医学 2012 年 5 月第 27 卷第 5 期 图 7 荧光物质的稳定性 五 重复性同一血样取 5 份, 按相同方法进行前期处理, 衍生后进样, 保留时间和峰面积基本一致 RSD 值均 <10%, 说明血样处理方法稳定, 对检测结果影响小, 重复性好 见表 3 同一志愿者血样, 间隔 1 周, 相同方法处理后进样 结果显示, 在同样检测条件下, 保留时间与峰高基本一致, 按线性方程计算浓度,CV<10%, 说明放置稳定性好, 血样冻存满足检测需要 见图 8 表 3 血样前期处理对检测结果的影响 ( 峰面积 ) 样本号 TDP TMP 硫胺素 平均值 标准偏差 变异系数 (%) 图 8 放置稳定性 讨论如前所述硫胺素在体内有多种形态存在, 其中 90% 以上是 TDP, 主要存在于红细胞内, 主要参与能量代谢 [6 12], 而 FT 和 TMP 主要存在于血浆中 由于 TTP 主要存在中枢神经系统, 且含量甚微, 无法在外周血中被检测出 因此, 检测 TDP TMP 及游离硫胺素含量基本能够反映人体硫胺素的总体水平 上述应用 TCA 去蛋白处理 铁氰化钾衍生后, 通过梯度洗脱进行硫胺素及其 磷酸酯衍生物检测的方法, 由于检出限足够低, 线性良好, 提取率和重复性良好, 可以基本满足临床检测需要 此方法不单可用于阿尔茨海默病 (AD) 患者硫胺素检测, 对硫胺素缺乏相关疾病 ( 如韦尼克脑病 酒精中毒 脚气病 ) 的诊断也有 [4] 很实用的临床价值 以往硫胺素的检测需要将硫胺素磷酸酯去磷酸化后, 通过检测 FT 来判断人体总的硫胺素含量, 去硫胺素过程需超过 24h, 结果也不能反映在体内起主要生理作用的 TDP 的直接含量 而本研究所述方法检测单个样

5 335 本的梯度洗脱时间 <15min, 即快捷又实用 如果要进一步缩短检测时间, 一方面可以通过改变流动相来实现, 另一方可以通过应用短柱 (50mm) 来分离使保留时间提前 在收集血样和检测过程还应注意 :(1) 低温冻存 : 血样采集后应及时低温 (-70~-80 ) 冻存,TDP 主要存在于红细胞内, 低温冻存一方面促使红细胞胞膜破碎更加完全, 有利于 TDP 释放 另一方面, 血样采集以后, 及时低温冻存, 可以保证红细胞内 KGDH 和 PDH 酶活性及时灭活, 减少了 TDP 的消耗 此外, 也可以致使硫胺素磷酸激酶快速灭活, 减少了 FT TMP 向 TDP 的转化, 使得检测结果更加接近于采样时人体外周血实际硫胺素含量 (2) 抗 [13] 凝剂 :Ihara 等报道, 血样抗凝剂选择无论是肝素还是 EDTA, 对于检测并无影响 (3) 去蛋白剂 : 在课题之初, 我们曾选择乙腈作为去蛋白剂, 离心后保留液体呈淡黄色, 样本虽经 0.2μL 膜过滤处理, 在进行荧光检测时, 硫胺素等保留时间尚比较稳定, 但杂峰较多, 基线不易稳定 经改用 TCA 后, 去蛋白更加彻底, 避免了上述问题 (4) 进样量 : 即使使用 ph 值范围较大的 HPLC 柱子, 其适应的 ph 值范围在 1~11 之间, 铁氰化钾与硫胺素及其磷酸酯衍生物进行衍生反应时, 需要在强碱 ( 氢氧化钠溶液 ) 条件下, 即使在使用预柱的情况下, 强碱对柱子的损伤仍比较大 因此, 在保证检测下限的前提下, 尽可能减少进样量, 以延长柱子的寿命 因此, 采用经 TCA 去蛋白处理 铁氰化钾衍生 梯度洗脱的 HPLC 检测全血硫胺素及其磷酸化衍生物方法, 方便 快捷 可靠 可重复性强, 可适用于临床检测及科学研究 参考文献 [1] BurtisCA,AshwoodER,BrunsDE.Tietztextbook ofclinicalchemistryandmoleculardiagnostics[m]. 4thed.St.Louis:ElsevierSaunders,2006: [2] SauberlichHE.Laboratorytestsfortheasesmentof nutritionalstatus[m].2nded.bocaraton:crc Pres,1999:486. [3] TalwarD,DavidsonH,CooneyJ,etal.VitaminB (1)statusasesedbydirectmeasurementofthiamin pyrophosphatein erythrocytes orwhole blood by HPLC: comparison with erythrocyte transketolase activationasay[j].clinchem,2000,46(5): [4] WeberW,KewitzH.Determinationofthiaminein humanplasmaanditspharmacokinetics[j].eurj ClinPharmacol,1985,28(2): [5] LuJ,FrankEL.RapidHPLCmeasurementofthiamine anditsphosphateestersinwholeblood[j].clin Chem,2008,54(5): [6] BubberP,HaroutunianV,FischG,etal.Mitochondrial abnormalities in Alzheimer brain: mechanistic implications[j].annneurol,2005,57(5): [7] GibsonGE,SheuKF,BlassJP,etal.Reduced activities ofthiamine dependentenzymes in the brains and peripheral tisues of patients with Alzheimer sdisease[j].archneurol,1988,45 (8): [8] ParkerWDJr,FileyCM,ParksJK.Cytochromeoxidase deficiencyinalzheimer sdisease[j].neurology, 1990,40(8): [9] SheuKF,ClarkeDD,Kim YT,etal.Studiesof transketolaseabnormalityinalzheimer sdisease[j]. ArchNeurol,1988,45(8): [10] TombacciniD,MocaliA,PaoletiF.Characteristic transketolase alterations in dermal fibroblasts of Alzheimer patients are modulated by culture conditions[j].expmolpathol,1994,60(2): [11] ZhaoN,ZhongCJ,WangY,etal.Impaired hippocampalneurogenesisisinvolved in cognitive dysfunctioninducedbythiaminedeficiencyatearly pre pathologicallesion stage[j]. NeurobiolDis, 2008,29(2): [12] CalingasanNY,GandySE,BakerH,etal.Accu mulationofamyloidprecursorprotein likeimmuno reactivity in ratbrain in response to thiamine deficiency[j].brainres,1995,677(1): [13] IharaH,MatsumotoT,ShinoY,etal.Asayvalues forthiamineorthiaminephosphateestersinwhole blooddonotdependontheanticoagulantused[j].j ClinLabAnal,2005,19(5): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 龚晓霖 )

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