Microsoft Word 陈妍7.0.DOC

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word 陈妍7.0.DOC"

径江
5 years ago
Views:

1 中国组织工程研究第 17 卷第 36 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2013 Vol.17, No.36 doi: /j.issn [ 陈妍, 潘丽杰, 袁杰, 李天侠. 冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化 [J]. 中国组织工程研究,2013,17(36): 冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化 * 陈妍 1, 潘丽杰 1, 袁杰 1, 李天侠 2 ( 哈尔滨医科大学附属口腔医学院, 1 口腔预防保健科, 2 口腔修复科, 黑龙江省哈尔滨市 ) 文章亮点 : 1 很多报道证实, 脐带组织是间充质干细胞的一个丰富的来源, 而脐带是人出生时的产物, 如何保存, 保存后能否还拥有向成骨细胞分化的特性至今少见专门的报道 2 实验进一步证明脐带组织中细胞的干细胞特性, 并系统的研究了这些干细胞在低温冻存和复苏后的增殖及向成骨细胞的分化能力, 结果证明了复苏后的人脐带间充质细胞不仅保持了干细胞的生物学特性, 还具备较强的增殖能力和向成骨细胞分化能力 3 实验结果显示, 低温冻存可作为长期保存人脐带间充质干细胞一种有效方法, 并且复苏后的人脐带间充质干细胞可作为骨组织工程研究和应用的种子细胞 ; 复苏后传至 12 代的细胞仍可进行成骨诱导, 为骨组织工程大量快速构建提供了前期的实验基础关键词 : 干细胞 ; 脐带脐血干细胞 ; 脐带间充质干细胞 ; 成骨分化 ; 成骨细胞 ; 免疫表型 ; 组织块贴壁法 ; 骨钙蛋白 ; 骨涎蛋白 ; 省级基金 ; 干细胞图片文章主题词 : 干细胞 ; 细胞分化 ; 成骨细胞 ; 骨钙素基金资助 : 黑龙江省教育厅科学技术项目 ( )* 摘要背景 : 在骨组织工程中, 脐带间充质干细胞是的一种新兴的种子细胞目前认为低温冻存是长期保存细胞的有效方法目的 : 探究冻存的脐带间充质干细胞能否被诱导分化成成骨细胞方法 : 采用组织块贴壁法从脐带的华尔通氏胶组织中分离出间充质干细胞然后, 用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期用流式细胞仪检测在冻存 6 个月后, 复苏第 2 代脐带间充质干细胞进行冻存复苏, 并传代培养至 12 代对第 12 代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导, 它的成骨能力分别通过碱性磷酸酶活性检测, 骨钙素和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定结果与结论 : 原代脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维细胞样形态流式细胞仪显示培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志 CD73 CD105 和 CD90, 但是不表达造血细胞的表面标志 CD34 和 CD45 复苏后细胞的存活率是 90% 细胞周期显示 P8 的细胞有 75% 处于 G 0/G 1 期,25% 处于 S+G 2M 期经成骨诱导液处理的第 12 代细胞显示出比对照组更高的碱性磷酸酶活性 (P < 0.01) 此外, 在成骨诱导液中诱导的细胞对骨钙素和骨涎蛋白的染色呈阳性, 并形成矿化了结节冻存后的脐带间充质干细胞仍保持了它们的生物学特性, 并且在成骨诱导液中能被诱导分化成成骨细胞 Differentiation of cryopreserved umbilical cord mesenchymal stem cells into osteoblasts Chen Yan1, Pan Li-jie 1, Yuan Jie 1, Li Tian-xia 2 ( 1 Department of Oral Health Sciences, College of Stomatology, Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China; 2 Department of Prosthodontics, College of Stomatology, Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China) 陈妍, 女,1987 年生, 黑龙江省哈尔滨市人, 汉族,2013 年哈尔滨医科大学毕业, 硕士, 医师, 主要从事干细胞相关基础研究 @qq.com 通讯作者 : 袁杰, 博士, 哈尔滨医科大学附属口腔医学院口腔预防保健科, 黑龙江省哈尔滨市 dryuanjie@126.com 通讯作者 : 李天侠, 博士, 哈尔滨医科大学附属口腔医学院口腔修复科, 黑龙江省哈尔滨市 drlitianxia@126.com 中图分类号 :R394.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) 收稿日期 : 修回日期 : ( /D Q) Chen Yan, Master, Physician, Department of Oral Health Sciences, College of Stomatology, Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China @qq.com Corresponding author: Yuan Jie, M.D., Department of Oral Health Sciences, College of Stomatology, Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China drlitianxia@126.com Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells are considered as novel seed cells in bone tissue engineering. Cryopreservation is an effective method for storing cells for a long time. OBJECTIVE: To explore whether umbilical cord mesenchymal stem cells of cryopreservation could be induced to differentiated into osteoblasts. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from the Wharton s jelly of human umbilical cord tissue by the tissue explant adherent method. Morphology of primitive cells was observed by inverted microscopy. Immunophenotypes and cell cycle of umbilical cord mesenchymal stem cells were measured using flow cytometry. After frozen storage for 6 months, the second passage of umbilical cord mesenchymal stem cells Corresponding author: Li Tian-xia, M.D., Department of Prosthodontics, College of Stomatology, Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China drlitianxia@126.com Received: Accepted: P.O. Box 1200, Shenyang

2 was thawed and subcultured to passage 12. Upon induction with osteogenic inductive medium, the osteogenic ability of passage 12 of umbilical cord mesenchymal stem cell was evaluated by alkaline phosphatase activity, the immunofluorescent analysis of osteocalcin and bone sialoprotein and the assay of alizarin red staining separately. RESULTS AND CONCLUSION: Primary umbilical cord mesenchymal stem cells displayed a typical fibroblast-like morphology. Flow cytometry showed that the cultured cells expressed high levels of the mesenchymal stem cells surface markers CD73, CD105 and CD90, but did not express hematopoietic cells surface markers CD34 and CD45. The survival rate of umbilical cord mesenchymal stem cells after resuscitation was 90%. The cell cycle analysis indicated that 75% of the cells of passage 8 were in G 0/G 1 phase and 25% in S+G 2M phase. Passage 12 cells treated with osteogenic inductive medium displayed a higher alkaline phosphatase activity compared with control cells (P < 0.01). Moreover, the cells, induced in osteogenic inductive medium, were positive for osteocalcin and bone sialoprotein staining and formed the mineralized nodules. Umbilical cord mesenchymal stem cells still maintain their biological characteristics after cryopreservation, and can be induced into osteoblasts with osteogenic inductive medium. Subject headings: stem cells; cell differentiation; osteoblasts; osteocalcin Funding: the Science and Technology Project of Heilongjiang Province Education Department, No * Chen Y, Pan LJ, Yuan J, Li TX. Differentiation of cryopreserved umbilical cord mesenchymal stem cells into osteoblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(36): 引言 Introduction 1 材料和方法 Materials and methods 骨组织工程是利用细胞生物学和工程学原理, 研究开发修复和改善损伤骨组织形态和功能的生物替代物的一门科学间充质干细胞有着显著的自我更新和多向分化能力, 是骨组织工程和再生医药的重要的种子细胞目前应用最广泛的骨组织工程种子细胞来自于骨髓, 已有研究证明骨髓间充质干细胞在冻存复苏并连续传代后仍具有成骨分化潜能, 但是骨髓间充质干细胞的数量和分化能力随着年龄的增长而减少和减弱, 并且获取骨髓是一项侵袭性操作, 容易引发感染等并发症 [1-4] 已经有很多报道证实, 人脐带组织是间充质干细胞的一个备选来源在怀孕期间, 脐带连接母亲和胎儿, 它由脐血管和一种特殊的黏液样的结缔组织组成, 这种黏液样的组织被称为华通胶, 羊膜上皮包裹在这些华通胶组织外面 [5-7] 现在已经证实脐带间充质干细胞除了具备和骨髓间充质干细胞相似的生物学特性外, 还拥有比骨髓间充质干细胞更高的增殖能力和分化能力, 而且在一定条件诱导下可分化为脂肪细胞成骨细胞软骨细胞神经细胞心肌细胞和骨骼肌细胞等多种细胞类型 [8-11] 虽然人脐带间充质干细胞有很强的扩增和分化能力, 但是长期培养也会产生细胞衰老和细胞过剩等问题, 或由于外在培养条件异常产生细胞污染的问题, 这些都造成了细胞和耗材的浪费 [12-15] 目前认为低温冻存是长期保存细胞的有效方法因此, 实验旨在了解人脐带间充质干细胞的生物学特性, 并探究经冻存复苏并多次传代后的人脐带间充质干细胞是否具备向成骨细胞分化的潜能设计 : 分子水平细胞水平体外观察时间及地点 : 于 2011 年 9 月至 2012 年 7 月在哈尔滨医科大学附属第一医院细胞移植实验室完成材料 : 标本采集 : 采集足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带, 来源于哈医科大学附属第一医院妇产科, 经产妇及家属知情同意, 实验过程符合医学伦理学标准冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞分化实验的主要试剂及仪器 : 试剂及仪器来源酶标仪 Bio-Tek,USA 流式细胞仪 Beckman Coulter Inc.,USA DMEM/F12, 胰蛋白酶 Hyclone,USA 胎牛血清 Gibco,USA 二甲基亚砜, 碘化丙啶 Sigma,USA PE 标记的 CD45 CD73,FITC 标记 Biolegend,USA 的 CD105 CD90(Thy1),APC 标记的 CD34 抗体及其相应同型对照 R nase A TakaRa,USA 碱性磷酸酶检测, 茜苏红染色试剂南京建成兔抗人的骨钙素 (OCN), 兔抗人的骨唾液 Santa,USA 蛋白,FITC 标记的山羊抗兔二抗 DAPI 碧云天生物技术研究所碱性成纤维细胞生长因子 PEPRO TECH,England 实验方法 : 人脐带间充质干细胞的分离传代培养 : 将脐带在无菌条件下放入含有 100 U/mL 青霉素和 100 g/l 的链霉素的 DMEM/F12 培养液中,4 h 内处理用组织块贴壁法分离人脐带间充质干细胞取脐带纵向剪开, 剔除动静脉血管,PBS 冲净, 取华尔通氏胶 (Wharton s Jell), 剪碎 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6437

3 至 1.0 mm 3 大小的组织块, 将组织块置于 25 cm 2 培养瓶中培养, 加入适量的 DMEM/F12 培养基 ( 含体积分数为 10% 胎牛血清 20 μg/l 碱性成纤维细胞生长因子 100 U/mL 青霉素和 100 g/l 的链霉素 ), 每日在倒置显微镜下观察, 当原代细胞融合达 80%- 90% 时, 采用 0.25% 胰蛋白酶消化,PBS 冲洗, 离心, 按 1 2 传代培养人脐带间充质干细胞免疫表型的流式细胞仪分析 : 取第 2 代的贴壁细胞, 常规消化, 制成细胞浓度为 L -1 的悬液, 在 100 μl/ 管悬液中分别加入 CD90(Thy1)- FITC CD73-PE CD105-FITC CD45-PE 和 CD34-APC 抗体 20 μl 及其相应同型对照, 流式细胞仪检测细胞表型人脐带间充质干细胞的冻存复苏及复苏率的检测 : 取经形态学和表面抗原鉴定的第 2 代细胞, 常规消化, 去除上清后缓慢加入含 10%DMSO+ 体积分数 20% 胎牛血清 +70%DMEM/F12 冻存保护剂然后进行梯度冻存, 置 min,-20 1 h, 再置 -80 过夜, 次日投入 -196 液氮保存,6 个月后取出冻存管,37 水浴箱中快速解冻, 并加入含体积分数 10%FBS 的 DMEM/F12 基础培养液混悬, 离心去除 DMSO, 接种至培养瓶内培养, 待细胞达到 80%-90% 融合后, 常规消化, 以 1 2 传代进一步扩增同时将 1 滴细胞悬液与 2 滴锥虫蓝液混合后, 滴入细胞计数板,2 min 后, 在显微镜下计数至少 200 个细胞复苏率 =( 活细胞总数 / 计算的细胞 ) 100% 细胞周期的测定 : 取冻存 6 个月复苏后传至 8 代的人脐带间充质干细胞, 常规消化, 体积分数 70% 冷乙醇 4 固定并透膜 24 h,10 mg/l 的 Rnase A 37 孵育 30 min, 加入 50 mg/l 碘化丙啶 4 避光孵育 5 min, 以流式细胞仪检测分析细胞周期成骨细胞的诱导 : 取冻存 6 个月复苏后传至 12 代的人脐带间充质干细胞, 消化制成单细胞悬液, 以细胞浓度 L -1 接种于 25 cm 2 培养瓶中, 常规培养 24 h 后, 诱导组换成成骨诱导培养基 0.1 μmol/l 地塞米松 10 mmol/l β- 甘油磷酸钠 50 μmol/l 抗坏血酸含体积分数 10 % FBS 的 DMEM/F12, 诱导 21 d, 对照组细胞始终采用 DMEM/F12 完全培养基培养, 每隔三四天换液 1 次碱性磷酸酶活性测定 : 取第 12 代的人脐带间充质干细胞, 以 / 孔的细胞密度接种 96 孔板, 分别成骨诱导 3,6,9,12,15,18,21 d, 用 PBS 洗 3 次, 室温加 0.2% Triton X-100 裂解液 30 min, 倒置显微镜下观察到细胞裂解后, 再用碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞的碱性磷酸酶活性, 空白管调零,520 nm 处酶标仪测各孔吸光度 (A) 值, 每次实验组和对照组各取 4 孔进行碱性磷酸酶活性检测按下列公式换算为金氏单位 /g( 每克组织蛋白在 37 与基质作用 15 min 产生 1 mg 酚为一个金氏单位 ) [16-17] 免疫细胞化学检测 : 取成骨诱导 14 d 的人脐带间充质干细胞,40 g/l 多聚甲醛液室温固定 2 h,pbs 洗 3 次, 用 SABC 法 (streptavidin-biotin complex) 检测骨钙素和骨涎蛋白蛋白的表达应用的抗体有 : 骨钙素 ( 兔抗人,1 200) 和骨涎蛋白 ( 兔抗人,1 500) 应用的二抗 : 用 FITC 标记的山羊抗兔二抗 (1 200), 细胞核用 DAPI 染色未诱导的人脐带间充质干细胞作为对照组茜素红染色 : 取成骨诱导 21 d 细胞,PBS 冲洗 2 次, 体积分数 95% 乙醇固定 30 min, 双蒸水冲洗 3 次 0.1% 茜素红 -Tris-HCl(pH 8.3) 于 37 下染色 30 min 倒置显微镜下观察, 拍照主要观察指标 :1 细胞流式技术检测细胞表型 2 细胞复苏后的存活率 3 流式细胞仪检测分析细胞周期 4 检测碱性磷酸酶活性的变化 5 荧光免疫细胞化学染色检测与骨细胞相关标志分子基因和蛋白的表达 6 检测矿化结节形成统计学分析 : 碱性磷酸酶活性测定所得数据以 x _ ±s 表示组间均数比较采用配对 t 检验当 P < 0.05 认为差异有显著性意义 2 结果 Results 2.1 人脐带间充质干细胞的形态学观察用组织块贴壁法培养细胞,5 d 后可以看到有少量且分散的细胞从组织块中爬出, 见图 1, 贴壁细胞呈纺锤形或多角型培养 14 d 左右, 细胞形成更规则的成纤维细胞样形态且平行排列, 此时细胞可达 80%-90% 融合, 见图 2, 细胞增殖迅速, 三四天可传代, 传代后细胞形态未见明显的改变注 : 可以看到有少量且分散的细胞从组织块中爬出图 1 人脐带间充质干细胞原代培养第 5 天形态观察 ( 倒置显微镜, 50) Figure 1 Morphological appearance of human umbilical cord mesenchymal stem cells at 5 d of primary culture (Inverted microscope, 50) 6438 P.O. Box 1200, Shenyang

4 态良好增殖速度较快注 : 细胞形成更规则的成纤维细胞样形态且平行排列, 细胞可达 80%-90% 融合图 2 人脐带间充质干细胞原代培养第 14 天的形态观察 ( 倒置显微镜, 100) Figure 2 Morphological appearance of human umbilical cord mesenchymal stem cells at 14 d of primary culture (Inverted microscope, 100) 2.2 人脐带间充质干细胞免疫表型的分析从脐带的华尔通氏胶组织 (Wharton s Jell) 中分离出来的细胞, 传至第 2 代, 经流式细胞仪检测, 高表达 CD90 CD105 和 CD73, 不表达 CD34 和 CD45, 见图 3 注 : 细胞 24 h 内贴壁, 少许悬浮, 贴壁细胞呈梭形或多角型, 生长状态良好,3-5 d 达到 80%-90% 融合图 4 人脐带间充质干细胞复苏培养 5 d 后的细胞形态 ( 倒置显微镜, 50) Figure 4 Appearance of human umbilical cord mesenchymal stem cells at 5 d of resuscitation (Inverted microscope, 50) 2.4 细胞周期检测用流式细胞仪进行细胞周期分析显示, 约有 75% 的第 8 代人脐带间充质干细胞处于 G 0 /G 1 期,25% 处于 S+G 2 M 期, 见图 5 注 : 纵坐标代表计数的有效细胞数 ( 个 ); 横坐标代表 DNA 含量, 无单位可见约有 75% 的第 8 代人脐带间充质干细胞处于 G 0/G 1 期,25% 处于 S+G 2M 期图 5 流式细胞仪测定经冻存复苏后传至第 8 代的人脐带间充质干细胞细胞周期注 : 从脐带分离出来的细胞, 经流式细胞仪检测, 高表达 CD90 CD105 和 CD73, 符合间充质干细胞的表型图 3 流式细胞仪检测第 2 代人脐带间充质干细胞的免疫表型 Figure 3 Immunophenotyping of the second passage of human umbilical cord mesenchymal stem cells detected using flow cytometry 2.3 人脐带间充质干细胞冻存复苏培养观察第 2 代的人脐带间充质干细胞冻存 6 个月复苏后, 锥虫蓝染色后细胞存活率可达 90% 复苏的细胞 24 h 内贴壁, 少许悬浮, 贴壁细胞呈梭形或多角型, 生长状态良好,3-5 d 达到 80%-90% 融合, 见图 4, 传代后细胞形态均一状 Figure 5 Cell cycle of the eighth passage of human umbilical cord mesenchymal stem cells after resuscitation detected using flow cytometry 2.5 碱性磷酸酶活性检测结果成骨诱导的人脐带间充质干细胞在 6 d 时碱性磷酸酶值开始增高呈持续上升趋势, 诱导 15 d 时达到峰值, 之后缓慢下降, 对照组细胞的碱性磷酸酶值始终低于诱导组 (P < 0.01), 见图 6 表明成骨诱导后 15 d, 人脐带间充质干细胞的碱性磷酸酶活性最强 2.6 免疫荧光染色结果成骨诱导 14 d 的第 12 代人脐带间充质干细胞进行免疫细胞化学检测, 可观察到诱导组细胞中骨钙素和骨涎蛋白染色阳性, 而在对照组细胞中未观察到阳性染色细胞, 见图 7-10 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6439

碱性磷酸酶活性 (U/g) 80 60 40 20 对照组实验组 0 3 6 9 12 15 18 21 注 : 细胞中未观察到阳性染色细胞时间 (d) 注 : 成骨诱导的细胞在 6 d 时碱性磷酸酶值开始增高呈持续上升趋势, 诱导 15 d 时达到峰值, 之后缓慢下降, 对照组细胞碱性磷酸酶值始终低于诱导组 (P < 0.

culture without osteogenic inducer (Immunofluorescence, 400) Figure 6 Alkaline phosphatase activity of the twelfth passage of human umbilical cord mesenchymal stem cells after osteogenic induction

in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 14-d culture without osteogenic inducer (Immunofluorescence staining, 400) Figure 10 Expression of bone sialoprotein in human umbilical cord

5 碱性磷酸酶活性 (U/g) 对照组实验组注 : 细胞中未观察到阳性染色细胞时间 (d) 注 : 成骨诱导的细胞在 6 d 时碱性磷酸酶值开始增高呈持续上升趋势, 诱导 15 d 时达到峰值, 之后缓慢下降, 对照组细胞碱性磷酸酶值始终低于诱导组 (P < 0.01) 图 6 成骨诱导冻存复苏后传至第 12 代人脐带间充质干细胞的碱性磷酸酶活性图 9 未添加成骨诱导液培养的人脐带间充质干细胞 14 d 的骨涎蛋白表达 ( 免疫荧光, 400) Figure 9 Expression of bone sialoprotein in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 14-d culture without osteogenic inducer (Immunofluorescence, 400) Figure 6 Alkaline phosphatase activity of the twelfth passage of human umbilical cord mesenchymal stem cells after osteogenic induction cryopreservation and resuscitation 注 : 可观察到细胞中骨涎蛋白染色阳性图 10 成骨诱导人脐带间充质干细胞 14 d 的骨涎蛋白表达 ( 免疫荧光, 400) 注 : 未观察到阳性染色细胞图 7 未添加成骨诱导液培养的脐带间充质干细胞 14 d 的骨钙素表达 ( 免疫荧光, 400) Figure 7 Expression of osteocalcin in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 14-d culture without osteogenic inducer (Immunofluorescence staining, 400) Figure 10 Expression of bone sialoprotein in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 14-d osteogenic induction (Immunofluorescence, 400) 2.7 茜素红染色结果成骨诱导第 12 代人脐带间充质干细胞 21 d, 进行茜素红染色, 可见红色的钙化基质沉积, 见图 11,12 注 : 可观察到细胞中骨钙素染色阳性图 8 成骨诱导 14 d 的第 12 代人脐带间充质干细胞骨钙素的免疫细胞化学检测 ( 免疫荧光, 400) Figure 8 Immunocytochemistry of osteocalcin in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 14-d osteogenic induction (Immunofluorescence staining, 400) 注 : 未见红色的钙化基质沉积图 11 未添加成骨诱导液培养的人脐带间充质干细胞 21 d 细胞形态观察 ( 茜素红染色, 100) Figure 11 Cell morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells after 21-d culture without osteogenic inducer (Alizarin red S staining, 100) 6440 P.O. Box 1200, Shenyang

注 : 成骨诱导后可见红色的钙化基质沉积图 12 成骨诱导人脐带间充质干细胞 21 d 细胞形态观察 ( 茜素红染色, 100) Figure 12 Cell morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells after 21-d osteogenic induction (Alizarin red S staining,

6 注 : 成骨诱导后可见红色的钙化基质沉积图 12 成骨诱导人脐带间充质干细胞 21 d 细胞形态观察 ( 茜素红染色, 100) Figure 12 Cell morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells after 21-d osteogenic induction (Alizarin red S staining, 100) 细胞分化的晚期标志, 在硬组织再生方面扮演重要的角色 [27-29] 实验针对以上指标进行验证, 结果显示 : 成骨诱导的人脐带间充质干细胞碱性磷酸酶活性明显升高 (P < 0.01), 骨钙素和骨涎蛋白免疫化学荧光染色及茜素红染色的结果呈阳性, 这些证据均表明冻存复苏多次传代后的人脐带间充质干细胞具有成骨分化潜能总之, 该实验验证了低温冻存可作为长期保存人脐带间充质干细胞一种有效方法, 节约了成本, 避免因长时间培养引起的细胞衰老, 减少了细胞浪费重要的是, 复苏后的人脐带间充质干细胞保持了生物活性, 具备较强的增殖能力和向成骨细胞分化能力, 这为人脐带间充质干细胞在骨组织工程的研究和合理应用提供了可能性 3 讨论 Discussion 脐带是分娩后的废弃物, 采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤, 引起感染的概率低, 并且鲜有引起移植物抗宿主病 [16] 许多研究已表明脐带间充质干细胞表达部分胚胎干细胞的标志, 是一种更原始的干细胞, 而且不涉及法律和伦理方面的争议 [17-19] 这些优点为人脐带间充质干细胞在骨组织工程领域提供更为广泛的应用前景这项研究选用组织块贴壁法, 不仅避免了污染, 提高细胞提取成功率 ; 而且防止了酶处理对细胞的损伤, 更好的保持了细胞的生物活性和功能 [20-21] 实验中从脐带华通胶中提取出的间充质干细胞贴壁生长, 呈现典型的成纤维样细胞形态 [22] 流式细胞仪检测结果显示, 贴壁细胞高表达间充质干细胞的表面抗原 CD73 CD90 和 CD105, 而不表达造血细胞表面抗原 CD34 和 CD45, 这说明从脐带分离出的细胞符合间充质干细胞的表达特征, 且不具有造血细胞特性 [23-24] 此研究将第 2 代经形态学及表面抗原鉴定的人脐带间充质干细胞冻存于液氮中 6 个月, 复苏率高达 90% 且细胞生长状态良好, 证明低温冻存不会影响人脐带间充质干细胞的生物活性, 而且是长期保存人脐带间充质干细胞的理想方法流式细胞仪分析细胞周期显示有 75% 的 P8 人脐带间充质干细胞处于 G 0 /G 1 期,25% 处于 S+G 2 M, 提示绝大部分细胞为早期细胞, 保留着自我更新和增殖能力, 表明低温冻存不会影响人脐带间充质干细胞的干细胞特性为证实冻存复苏多次传代后的人脐带间充质干细胞仍具有向成骨细胞分化的能力, 对冻存复苏传至第 12 代人脐带间充质干细胞进行了成骨诱导目前认为, 碱性磷酸酶和钙结节的形成是向成骨细胞分化的标志 [25-26] ; 而并且有研究显示骨钙素和骨涎蛋白是成骨致谢 : 感谢哈尔滨医科大学附属第一医院细胞移植实验室在实验过程的帮助作者贡献 : 第一作者进行实验实施, 第三作者进行设计, 第二作者进行实验评估, 资料收集为第一二三作者, 第一作者成文, 第二三作者审校, 第一三作者对文章负责利益冲突 : 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助伦理要求 : 实验用脐带为产妇遗弃, 实验方案获医院伦理委员会批准学术术语 : 华通胶 - 已经有很多报道证实, 人脐带组织是间充质干细胞的一个备选来源在怀孕期间, 脐带连接母亲和胎儿, 它由脐血管和一种特殊的黏液样的结缔组织组成, 这种黏液组织被称为华通胶, 羊膜上皮包裹在这些组织外面现已证实脐带间充质干细胞除了具备和骨髓间充质干细胞相似的生物学特性, 还拥有比骨髓间充质干细胞更高的增殖和分化能力, 而且在一定条件诱导下可分化为脂肪细胞成骨细胞软骨细胞神经细胞心肌细胞和骨骼肌细胞等多种细胞类型作者声明 : 文章为原创作品, 数据准确, 内容不涉及泄密, 无一稿两投, 无抄袭, 无内容剽窃, 无作者署名争议, 无与他人课题以及专利技术的争执, 内容真实, 文责自负 4 参考文献 References [1] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411): [2] Li ZY, Chen L, Liu L, et al. Odontogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells. J Oral Maxillofac Surg. 2007;65(3): [3] Secco M, Zucconi E, Vieira NM, et al. Multipotent stem cells from umbilical cord: cord is richer than blood! Stem Cells.2008; 26(1): [4] Wang L, Tran I, Seshareddy K, et al. A comparison of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A. 2009;15(8): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6441

7 [5] 吕江涛, 田少奇, 孙康, 等. 血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成骨分化的影响 [J]. 中国组织工程研究,2012,16(41): [6] 张镇, 田少奇, 张才龙, 等. 携带人骨形态发生蛋白 2 可诱导慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的成骨 [J]. 中国组织工程研究, 2012,16(14): [7] 曲志国, 野向阳, 林辉, 等. 人脐带间充质干细胞诱导成骨及治疗骨缺损 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(45): [8] Kadner A, SP Hoerstrup, J Tracy, et al. Human umbilical cord cells: a new cell source for cardiovascular tissue engineering. Ann Thorac Surg.2002;74:S1422 S1428. [9] Wang L, Ott L, Seshareddy K, et al. Musculoskeletal tissue engineering with human umbilical cord mesenchymal stromal cells. Regen Med. 2011;6(1): [10] Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells. Stem Cells. 2007;25(11): [11] Peng J, Wang Y, Zhang L, et al. Human umbilical cord Wharton's jelly- derived mesenchymal stem cells differentiate into a Schwann-cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Brain Res Bull. 2011;84(3): [12] 刘忠, 李素萍, 杨宏友, 等. 人脐带间充质干细胞体外分化成骨细胞的研究 [J]. 中国输血杂志, 2011,24(5): [13] 扎拉嘎胡, 陈莉, 兰晓霞, 等. 脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(40): [14] 何绍清, 罗振宇, 刘秋英, 等. 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(14): [15] 孙国栋, 李志忠, 王晶, 等. 人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究 [J]. 西安交通大学学报 : 医学版,2010, 14(2): [16] 赵磊, 王文加, 付常皓, 等. 人脐带间充质干细胞的分离培养及成脂成骨分化 [J]. 中国老年学杂志,2010,29(17): [17] 野向阳, 李相军, 徐岩, 等. 人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征 [J]. 国组织工程研究与临床康复,2009,13(36): [18] Hsieh JY, Fu YS, Chang SJ, et al. Functional module analysis reveals differential osteogenic and stemness potentials in human mesenchymal stem cells from bone marrow and Wharton's jelly of umbilical cord. Stem Cells Dev. 2010;19(12): [19] Han Y, Chai J, Sun T, et al. Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into dermal fibroblasts in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2011;413(4): [20] Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E, et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro Surveys. Stem Cells. 2007;25(2): [21] De Bruyn C, Najar M, Raicevic G, et al. A rapid, simple, and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton s jelly without enzymatic treatment. Stem Cells. 2011;20(3): [22] Peng J, Wang Y, Zhang L, et al. Human umbilical cord Wharton's jelly- derived mesenchymal stem cells differentiate into a Schwann-cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Brain Res Bull. 2011;84(3): [23] Tong CK, Vellasamy S, Tan BC, et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using combination of enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biol Int. 2011;35(3): [24] Chen MY, Lie PC, Li ZL, et al. Endothelial differentiation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 2009;37(5): [25] Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton s jelly of the human umbilical cord. Stem Cells. 2004;22(7): [26] Yu J, Deng Z, Shi J, et al. Differentiation of Dental Pulp Stem Cells into Regular-Shaped Dentin-Pulp Complex Induced by Tooth Germ Cell Conditioned Medium. Tissue Eng. 2006; 12(11): [27] Huang CH, Tseng WY, Yao CC, et al. Glucosamine promotes osteogenic differentiation of dental pulp stem cells through modulating the level of the transforming growth factor-beta type I receptor. J Cell Physiol. 2010;225(1): [28] Lindroos B, Mäenpää K, Ylikomi T, et al. Characterisation of human dental stem cells and buccal mucosa fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 2008;368(2): [29] Phuc PV, Nhung TH, Loan DT, et al. Differentiating of banked human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into insulin-secreting cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011; 47(1): P.O. Box 1200, Shenyang

Microsoft Word - 7469-7474张斌6.0最终版.DOC

Microsoft Word - 7469-7474张斌6.0最终版.DOC 中国组织工程研究第 17 卷第 42 期 2013 10 15 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 15, 2013 Vol.17, No.42 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.020 [http://www.crter.org] 张斌, 王兵济, 李