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1 中 国 组 织 工 程 研 究 第 19 卷 第 11 期 出 版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 12, 2015 Vol.19, No.11 成 骨 细 胞 增 殖 和 钙 盐 沉 积 能 力 : 在 接 骨 七 厘 片 药 物 溶 液 中 的 反 应 姚 明 智 ( 沈 阳 市 第 一 人 民 医 院, 辽 宁 省 沈 阳 市 ) 文 章 亮 点 : 1 接 骨 七 厘 片 药 理 特 性 在 早 期 为 活 血 化 瘀 和 消 炎 止 痛, 在 中 期 能 够 加 速 骨 折 愈 合, 而 后 期 主 要 能 够 增 强 骨 痂 强 度 的 作 用 研 究 表 明 该 药 物 能 够 在 动 物 水 平 促 进 血 液 循 环 加 速 钙 离 子 的 吸 收 和 沉 积, 增 大 骨 小 梁 密 度, 促 进 骨 痂 形 成 的 速 度 和 质 量 2 实 验 以 体 外 培 养 的 MC3T3-E1 细 胞 为 研 究 对 象, 通 过 观 察 接 骨 七 厘 片 药 液 对 成 骨 细 胞 增 殖 和 矿 化 能 力 的 直 接 作 用, 对 接 骨 七 厘 片 促 进 骨 折 愈 合 可 能 的 作 用 机 制 进 行 了 初 步 探 索 关 键 词 : 组 织 构 建 ; 骨 细 胞 ; 接 骨 七 厘 片 ; 骨 折 ; 成 骨 细 胞 增 殖 ; 钙 盐 沉 积 主 题 词 : 成 骨 细 胞 ; 细 胞 增 殖 ; 骨 折 愈 合 ; 中 草 药 摘 要 背 景 : 接 骨 七 厘 片 是 促 进 骨 折 愈 合 临 床 疗 效 较 好 的 复 方 中 药, 但 其 作 用 机 制 尚 不 十 分 清 楚 目 的 : 观 察 接 骨 七 厘 片 药 物 溶 液 对 成 骨 细 胞 增 殖 和 钙 盐 沉 积 能 力 的 影 响 方 法 : 以 体 外 培 养 的 MC3T3-E1 成 骨 细 胞 为 研 究 对 象 1 常 规 培 养 24 h 更 换 无 血 清 DMEM 培 养 液, 饥 饿 培 养 24 h 同 步 化 细 胞 周 期, 弃 去 培 养 液, 实 验 组 每 孔 加 入 100 µl 含 接 骨 七 里 片 药 物 溶 液 的 DMEM 完 全 培 养 基, 对 照 组 加 入 DMEM 完 全 培 养 基, 于 培 养 24 h 和 48 h 使 用 MTS 一 步 法 检 测 细 胞 增 殖 活 力 2 以 密 度 接 种 MC3T3-E1 细 胞 于 96 孔 板, 培 养 4 h 更 换 成 骨 诱 导 培 养 液, 诱 导 21 d 进 行 茜 素 红 染 色 观 察 MC3T3-E1 细 胞 的 钙 盐 沉 积 能 力, 对 照 组 细 胞 不 进 行 成 骨 诱 导 结 果 与 结 论 : 在 培 养 24 h 和 48 h, 接 骨 七 厘 片 药 物 实 验 组 细 胞 增 殖 程 度 均 较 对 照 组 上 调 (P < 0.05); 成 骨 诱 导 21 d 后, 茜 素 红 染 色 发 现 接 骨 七 厘 片 药 物 实 验 组 钙 盐 结 节 生 成 明 显 多 于 对 照 组 (P < 0.01) 以 上 结 果 表 明 接 骨 七 厘 片 药 物 溶 液 能 够 明 显 促 进 成 骨 细 胞 增 殖 和 钙 盐 沉 积 能 力 姚 明 智, 男,1979 年 生, 辽 宁 省 沈 阳 市 人, 汉 族, 2011 年 辽 宁 医 学 院 毕 业, 硕 士, 主 治 医 师, 主 要 从 事 脊 柱 骨 关 节 损 伤 和 生 物 材 料 研 究 中 图 分 类 号 :R318 文 献 标 识 码 :B 文 章 编 号 : (2015) 稿 件 接 受 : 姚 明 智. 成 骨 细 胞 增 殖 和 钙 盐 沉 积 能 力 : 在 接 骨 七 厘 片 药 物 溶 液 中 的 反 应 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究,2015,19(11): doi: /j.issn Effects of Jiegu Qili Tablet on proliferation and mineralization of MC-3T3 cells Yao Ming-zhi (The First Hospital of Shenyang, Shenyang , Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: Jiegu Qili Tablet is a compound Chinese medicine which can promote fracture healing, but its mechanism is still unclear. OBJECTIVE: To observe the effects of Jiegu Qili Tablet on the proliferation and mineralization of MC-3T3 cells. METHODS: MC-3T3 cells cultured in vitro were selected. (1) After 24 hours of routine culture, cells were cultured in serum-free DMEM for another 24 hours to synchronize cell cycles. Then, the culture solution was removed, and cells were cultured in DMEM complete medium with (experimental group) or without (control group) Jiegu Qili Tablet solution. At 24 and 48 hours of culture, MTS assay was used to detect the proliferative ability of cells. (2) In the experimental group, MC3T3-E1 cells at a density of were inoculated into 96-well plates, and after 4 hours of culture, cells were cultured in an osteogenic induction medium. After 21 days of osteogenic induction, the mineralization of MC3T3-E1 cells was examined using alizarin red S staining. Cells in the control groups were treated without osteogenic induction. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the cell proliferation rate was up-regulated in the experimental group at 24 and 48 hours after culture (P < 0.05), and the number of calcium nodules was also larger in the experimental group at 21 days after osteogenic induction (P < 0.01). These findings indicate that Jiegu Qili Tablet solution can up-regulate the proliferation and mineralization of MC-3T3 cells. Subject headings: Osteoblasts; Cell Proliferation; Fracture Healing; Drugs, Chinese Herbal Yao MZ. Effects of Jiegu Qili Tablet on proliferation and mineralization of MC-3T3 cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2015;19(11): Yao Ming-zhi, Master, Attending physician, the First Hospital of Shenyang, Shenyang , Liaoning Province, China Accepted: P.O. Box 10002, Shenyang

2 0 引 言 Introduction 随 着 人 口 老 龄 化 的 加 剧 和 交 通 事 故 等 的 多 发, 骨 折 发 生 率 越 来 越 高 如 果 骨 折 移 位 不 明 显, 或 经 过 手 法 复 位 后, 可 以 通 过 石 膏 夹 板 或 持 续 牵 引 等 保 守 治 疗 方 法, 必 要 时 需 要 行 切 开 复 位 内 固 定 治 疗 骨 折 愈 合 过 程 中, 成 骨 细 胞 和 破 骨 细 胞 所 诱 导 的 骨 重 建 和 骨 吸 收 被 重 新 激 活, 打 破 原 有 的 动 态 平 衡, 二 者 的 相 互 协 调 作 用 促 进 骨 折 愈 合 并 沿 应 力 线 重 新 调 整 塑 型 [1-2] 成 骨 细 胞 和 破 骨 细 胞 的 增 殖 分 化 矿 化 和 骨 吸 收 功 能 的 失 调 能 够 导 致 骨 折 迁 延 愈 合 甚 至 不 愈 合 [3-4] 成 骨 细 胞 起 源 于 多 能 的 骨 髓 基 质 的 间 质 细 胞, 在 骨 形 成 过 程 中 经 历 分 裂 增 殖 分 化 成 熟 和 基 质 钙 化 3 个 阶 段 [5-6] MC3T3-E1 成 骨 细 胞 具 有 碱 性 磷 酸 酶 活 性 Ⅰ 型 胶 原 合 成 和 基 质 钙 化 等 成 骨 细 胞 的 生 物 学 特 性, 国 际 上 常 作 为 骨 代 谢 研 究 的 细 胞 模 型 [7] 接 骨 七 厘 片 是 促 进 骨 折 愈 合 临 床 疗 效 较 好 的 复 方 中 药 [5-6], 但 其 作 用 机 制 尚 不 十 分 清 楚 本 文 通 过 在 细 胞 水 平 探 讨 接 骨 七 厘 片 对 成 骨 细 胞 增 殖 和 矿 化 能 力 的 影 响, 对 促 进 骨 折 愈 合 作 用 的 机 制 进 行 了 初 步 研 究 1 材 料 和 方 法 Materials and methods 设 计 : 细 胞 学 体 外 观 察 实 验 时 间 及 地 点 : 于 2007 年 3 月 至 2012 年 5 月 在 辽 宁 医 学 院 科 学 实 验 中 心 和 沈 阳 市 第 一 人 民 医 院 骨 科 实 验 室 完 成 材 料 : 接 骨 七 厘 片 促 进 成 骨 细 胞 增 殖 和 钙 盐 沉 积 实 验 所 用 主 要 药 物 细 胞 试 剂 : 药 物 细 胞 试 剂 来 源 接 骨 七 厘 片 ( 糖 衣 片 剂, 每 片 相 当 于 原 生 药 量 0.3 g) 珠 海 金 沙 ( 湖 南 ) 制 药 有 限 公 司 MC3T3-E1 细 胞 上 海 鑫 闵 生 物 科 技 有 限 公 司 MTS 一 步 法 细 胞 活 力 检 测 试 剂 盒 (CellTiter 96 美 国 Promega 公 司 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay) 二 甲 基 亚 砜 茜 素 红 美 国 Sigma Aldrich 公 司 DMEM 培 养 液 胎 牛 血 清 Clontech 公 司 实 验 方 法 : 药 物 制 备 : 将 接 骨 七 厘 片 除 去 糖 衣 研 细, 加 水 2 ml, 振 摇 3 min, 经 0.22 μm 滤 膜 滤 过 除 菌 制 含 原 生 药 0.15 g/ml 药 物 溶 液 按 每 毫 升 完 全 培 养 液 添 加 1 μl 药 物 溶 液 的 比 例 配 制 药 物 质 量 浓 度 为 0.15 g/l 的 含 药 培 养 液 将 g 茜 素 红 溶 于 100 ml PBS 中, 调 节 ph 值 到 制 成 茜 素 红 染 色 液 MC3T3-E1 细 胞 的 体 外 培 养 :MC3T3-E1 细 胞 复 苏, 加 入 含 体 积 分 数 为 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 完 全 培 养 基, 置 于 体 积 分 数 为 5%CO 2 培 养 箱 中 37 培 养 至 80% 汇 合 度 时 经 0.25% 胰 酶 消 化 3 min, 加 入 含 体 积 分 数 为 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 基 终 止 消 化, 按 1 3 比 例 传 代 至 新 的 培 养 瓶 中 继 续 培 养 MTS 一 步 法 检 测 细 胞 增 殖 活 力 : 常 规 培 养 MC3T3-E1 细 胞 至 对 数 生 长 期,0.25% 胰 酶 消 化 细 胞 3 min, 加 入 含 体 积 分 数 为 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 基 中 和 胰 酶, 吹 打 成 单 细 胞 悬 液 应 用 血 球 计 数 板 计 数 细 胞, 按 个 细 胞 / 孔 密 度 接 种 于 96 孔 板, 培 养 24 h 细 胞 贴 壁 后 弃 去 原 培 养 液, 更 换 无 血 清 DMEM 培 养 液, 饥 饿 培 养 24 h 同 步 化 细 胞 周 期 弃 去 培 养 液, 实 验 组 每 孔 加 入 100 μl 含 接 骨 七 里 片 药 物 溶 液 的 DMEM 完 全 培 养 基, 对 照 组 加 入 DMEM 完 全 培 养 基, 于 培 养 24 h 和 48 h 进 行 细 胞 增 殖 活 力 检 测 : 弃 原 培 养 液, 每 孔 加 入 100 μl 完 全 DMEM 培 养 液 和 20 μl CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent, 培 养 2 h, 以 495 nm 为 测 定 波 长 测 定 吸 光 度 值, 每 组 4 个 复 孔 茜 素 红 染 色 法 检 测 细 胞 钙 盐 沉 积 能 力 :MC3T3-E1 细 胞 以 密 度 接 种 于 96 孔 板, 培 养 4 h 细 胞 贴 壁 后 更 换 成 骨 诱 导 培 养 液 ( 含 β- 磷 酸 甘 油 10 mmol/l, 抗 坏 血 酸 盐 50 g/l), 每 3 d 更 换 1 次 培 养 液, 培 养 21 d 诱 导 培 养 完 成 后 进 行 茜 素 红 染 色 :40 g/l 多 聚 甲 醛 固 定 15 min, 加 入 40 mmol/l 茜 素 红 染 色 液, 室 孵 育 20 min, 去 离 子 水 漂 洗 4 次, 弃 去 液 体, 室 温 晾 干 后 显 微 镜 下 观 察 计 数 并 拍 照 记 录 主 要 观 察 指 标 :1 接 骨 七 厘 片 对 MC3T3-E1 细 胞 增 殖 的 影 响 2 接 骨 七 厘 片 对 MC3T3-E1 细 胞 矿 化 能 力 的 影 响 统 计 学 分 析 : 所 有 数 据 采 用 GraphPad Prism 6.0 统 计 学 软 件 处 理, 用 t 检 验 比 较 两 个 独 立 样 本 组 间 均 数, 用 方 差 分 析 进 行 多 组 的 组 间 比 较 P < 0.05 为 差 异 有 显 著 性 意 义,P > 0.05 为 差 异 无 显 著 性 意 义 2 结 果 Results 2.1 接 骨 七 厘 片 对 MC3T3-E1 细 胞 增 殖 的 影 响 与 对 照 组 比 较, 接 骨 七 厘 片 药 物 溶 液 作 用 于 MC3T3-E1 细 胞 24 h,mts 检 测 495 nm 吸 收 值 高 于 对 照 组 (P < 0.05), 说 明 该 药 物 溶 液 对 细 胞 增 殖 产 生 促 进 作 用 ; 培 养 48 h 后, 药 物 处 理 组 与 对 照 组 MTS 吸 收 值 差 异 增 大 (P < 0.05), 结 果 见 表 接 骨 七 厘 片 对 细 胞 钙 盐 沉 积 能 力 的 影 响 MC3T3-E1 细 胞 经 成 骨 诱 导 培 养 液 诱 导 21 d 后, 经 茜 素 红 染 色 可 见 细 胞 基 质 中 形 成 形 态 大 小 不 一 的 矿 化 结 节 接 骨 七 厘 片 药 物 处 理 细 胞 的 矿 化 结 节 数 量 明 显 高 于 对 照 组, 差 异 有 显 著 性 意 义 (P < 0.05), 结 果 见 图 1 3 讨 论 Discussion 中 医 理 论 认 为, 骨 骼 的 生 长 和 功 能 均 依 赖 气 血 的 推 动 和 滋 养, 骨 折 后 筋 脉 势 必 同 时 受 伤, 脉 络 受 伤, 气 血 离 经 妄 行, 致 血 瘀 气 滞, 血 不 活 则 瘀 不 去, 瘀 积 不 散 则 为 肿 为 痛 气 血 不 通 则 不 能 充 养 筋 骨, 致 使 骨 不 能 接, 故 骨 折 复 位 后 治 宜 活 血 散 瘀 接 骨 续 筋, 为 骨 折 断 端 及 早 生 长 接 续 创 造 条 件 历 代 中 医 验 方 中, 常 用 的 几 味 中 药 为 当 归 乳 香 没 药 大 黄 骨 碎 补 自 然 铜 血 竭 目 前 常 用 的 骨 伤 科 中 成 药 均 以 此 为 组 方 基 础 接 骨 七 厘 片 也 是 在 此 基 础 上 作 适 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1695

3 矿 化 结 节 数 量 P < 0.05 表 1 接 骨 七 厘 片 对 MC3T3-E1 细 胞 增 殖 的 影 响 (x _ ±s) Table 1 Effect of Jiegu Qili Tablet on proliferation of MC-3T3 cells 组 别 495 nm 吸 收 值 0 h 24 h 48 h 实 验 组 0.342± ±0.005 a 0.657±0.003 a 对 照 组 0.342± ± ±0.006 表 注 : 与 对 照 组 比 较, a P < 0.05 实 验 组 对 照 组 图 1 接 骨 七 厘 片 对 MC3T3-E1 细 胞 矿 化 能 力 的 影 响 Figure 1 Effects of Jiegu Qili Tablet on mineralization of MC-3T3 cells 图 注 :MC3T3-E1 细 胞 成 骨 诱 导 21 d 后, 经 茜 素 红 染 色 可 见 接 骨 七 厘 片 药 物 处 理 细 胞 的 矿 化 结 节 数 量 明 显 高 于 对 照 组, 差 异 有 显 著 性 意 义 (P < 0.05) 当 改 进, 主 要 由 乳 香 当 归 血 竭 没 药 大 黄 自 然 铜 骨 碎 补 土 鳖 虫 等 组 成, 是 骨 伤 科 理 想 用 药 接 骨 七 厘 片 依 据 患 者 的 临 床 症 状 进 行 立 法 选 药, 取 用 通 行 血 脉 改 善 血 行 消 散 瘀 血 强 骨 续 筋 等 药 物 组 成 纯 中 药 复 方 制 剂, 方 中 当 归 能 补 血 活 血 止 痛, 土 鳖 虫 破 血 逐 瘀 续 筋 接 骨 化 瘀 生 新, 乳 香 没 药 相 须 为 用, 活 血 祛 瘀 行 气 止 痛, 瘀 去 络 通, 血 竭 有 抗 真 菌 止 血 作 用, 大 黄 能 清 热 泻 火 凉 血 解 毒 逐 瘀 通 经 骨 碎 补 自 然 铜 有 强 骨 接 骨 续 骨 之 功 效 诸 药 合 用, 共 奏 活 血 化 瘀 止 痛 强 骨 之 效, 临 床 用 于 骨 伤 后 止 痛 化 瘀 消 肿, 加 速 骨 折 修 复 重 建 过 程, 为 早 期 功 能 锻 炼 提 供 了 条 件, 达 到 有 效 的 治 疗 目 的 [8] 现 代 药 理 学 也 表 明, 诸 味 中 药 合 用, 有 助 于 骨 折 部 位 骨 基 质 钙 盐 的 沉 积, 有 利 于 骨 痂 形 成, 同 时 还 能 促 进 骨 生 长 因 子 及 生 长 激 素 的 分 泌, 有 效 促 进 骨 折 端 的 愈 合 [9-12] 龙 [13] 涛 应 用 接 骨 七 厘 片 治 疗 四 肢 骨 折 患 者 120 例, 随 机 分 为 对 照 组 和 治 疗 组 各 60 例, 其 中 对 照 组 患 者 采 用 口 服 三 七 片 治 疗 ; 治 疗 组 患 者 采 用 口 服 接 骨 七 厘 片 治 疗,0.3 g/ 片,5 片 / 次,2 次 /d,15 d 为 1 个 疗 程 结 果 治 疗 组 治 愈 率 为 53.3%, 有 效 率 为 95.0%, 均 高 于 对 照 组 ( 治 愈 率 为 15.0%, 有 效 率 为 70.0%), 差 异 有 显 著 性 意 义 (P < 0.05); 治 疗 组 患 者 无 论 是 在 肿 胀 疼 痛 程 度 改 善 还 是 骨 折 愈 合 时 间 方 面 都 明 显 优 于 对 照 组, 而 且 未 见 不 良 反 应 发 生, 说 明 接 骨 七 厘 片 在 治 [14] 疗 四 肢 骨 折 方 面 临 床 疗 效 显 著, 而 且 安 全 性 高 李 遐 方 对 胫 腓 骨 延 迟 愈 合 患 者 给 予 口 服 接 骨 七 厘 片,2 周 为 1 个 疗 程, 连 续 使 用 3 个 疗 程, 结 果 表 明 接 骨 七 厘 片 促 进 胫 腓 骨 下 [15] 段 延 迟 愈 合 具 有 良 好 的 疗 效 罗 毅 文 等 运 用 接 骨 七 厘 片 对 150 例 骨 折 患 者 进 行 了 临 床 观 察 研 究, 结 果 表 明 接 骨 七 厘 片 具 有 抗 炎 镇 痛 改 变 局 部 血 循 环 及 氧 供 给 和 促 进 骨 折 愈 合 的 作 用 骨 折 愈 合 是 一 个 复 杂 的 病 理 生 理 过 程, 有 多 种 生 长 因 子 参 与 并 发 挥 着 重 要 的 作 用, 大 量 的 研 究 表 明, 血 管 内 皮 生 长 因 子 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 2 骨 形 态 发 生 蛋 白 转 化 生 长 因 子 等 是 促 进 血 管 内 生 以 及 骨 合 成 代 谢 的 重 要 耦 联 因 子 [16-27] [28] 李 恒 等 采 用 三 点 弯 曲 方 法 造 成 大 鼠 右 胫 骨 中 段 闭 合 性 骨 折 后, 采 用 完 全 随 机 法 分 为 3 组 : 阿 胶 强 骨 口 服 液 组 接 骨 七 厘 片 组 生 理 盐 水 组, 在 灌 胃 药 物 后 采 用 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 大 鼠 右 胫 骨 骨 痂 区 血 管 内 皮 生 长 因 子 和 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 2 表 达 明 显 增 加, 说 明 阿 胶 强 骨 口 服 液 和 接 骨 七 厘 片 在 骨 愈 合 早 中 期 可 通 过 调 节 血 管 内 皮 生 长 因 子 和 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 2 的 表 达, 促 进 前 成 骨 细 胞 和 成 软 骨 细 胞 的 有 丝 分 裂 血 管 内 生 以 及 骨 的 合 成 代 谢 达 到 促 骨 折 愈 合 的 作 用 [29] 张 继 东 等 研 究 表 明 壮 筋 续 骨 汤 可 能 通 过 降 低 内 源 性 骨 形 态 发 生 蛋 白 7 和 胰 岛 素 样 生 长 因 子 1 降 解, 增 强 其 活 性, [30] 发 挥 促 进 骨 折 愈 合 的 作 用 黄 有 荣 等 研 究 表 明 外 用 白 脉 软 膏 对 骨 折 模 型 动 物 骨 伤 愈 合 过 程 具 有 明 显 的 促 进 作 用, 其 促 进 骨 折 愈 合 作 用 与 调 节 骨 痂 处 骨 形 态 发 生 蛋 白 2 及 碱 [31] 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 水 平 有 关 王 琴 等 研 究 表 明 愈 骨 胶 囊 能 使 骨 痂 生 长 塑 形 提 前, 促 进 骨 折 愈 合, 可 能 与 提 高 骨 痂 组 织 内 血 管 内 皮 生 长 因 子 转 化 生 长 因 子 β 表 达, 完 善 骨 痂 内 微 血 管 重 建 有 关 [32] 冯 伟 等 应 用 RT-PCR 方 法 观 察 常 用 接 骨 单 味 中 药 含 药 血 清 对 体 外 培 养 成 骨 细 胞 成 骨 相 关 基 因 的 表 达 结 果 显 示 单 味 中 药 在 促 进 成 骨 细 胞 中 cbfa1 的 表 达 以 自 然 铜 为 最, 其 下 依 次 为 续 断 当 归 乳 香 没 药 和 地 鳖 虫, 而 骨 碎 补 并 没 有 促 进 cbfa1 的 表 达 ; 在 促 进 成 骨 细 胞 骨 形 态 发 生 蛋 白 2 的 表 达 中 以 续 断 和 骨 碎 补 为 最, 依 次 为 当 归 自 然 铜 和 没 药, 但 是 地 鳖 虫 和 乳 香 并 没 有 促 进 骨 形 态 发 生 蛋 白 2 表 达 的 功 能 ; 在 促 进 胰 岛 素 样 生 长 因 子 的 表 达 中, 以 乳 香 为 最, 依 次 当 归 自 然 铜 续 断, 而 骨 碎 补 地 鳖 虫 和 没 药, 却 没 有 上 调 胰 岛 素 样 生 长 因 子 的 表 达, 表 明 单 味 接 骨 中 药 可 影 响 成 骨 相 关 基 因 的 表 达, 但 不 同 药 物 作 用 的 基 因 靶 点 不 同 根 据 组 织 学 研 究, 骨 愈 合 的 主 要 生 物 学 演 变 过 程 包 括 以 下 几 个 自 然 分 期 [33-35] :1 骨 损 伤 早 期 : 局 部 幸 存 细 胞 被 激 活, 它 们 能 很 好 地 担 负 起 全 身 和 局 部 的 信 使 作 用, 传 递 创 伤 刺 激, 提 高 骨 折 后 局 部 细 胞 反 应, 从 而 促 进 骨 折 愈 合 2 血 肿 形 成 期 : 骨 折 后 的 出 血 填 充 在 骨 折 的 两 断 端 及 周 围 组 织 间, 形 成 血 肿, 其 中 的 纤 维 素 网 有 如 支 架 一 样, 使 新 生 毛 细 血 管 及 增 生 的 纤 维 母 细 胞 容 易 长 入 血 肿 内, 使 血 肿 1696 P.O. Box 10002, Shenyang

4 逐 渐 吸 收 和 机 化 3 肉 芽 组 织 形 成 期 : 在 局 部 介 质 作 用 下, 原 始 细 胞 开 始 增 殖 分 化 形 成 新 生 毛 细 血 管 纤 维 母 细 胞 支 持 细 胞 和 其 他 细 胞 等, 所 有 这 些 细 胞 细 胞 间 质 和 血 管 共 同 构 成 肉 芽 组 织 长 入 血 肿 内, 使 血 肿 逐 渐 吸 收 和 机 化 4 骨 痂 形 成 期 : 随 着 细 胞 的 进 一 步 增 殖 分 化, 在 肉 芽 组 织 内 开 始 生 成 新 软 骨 细 胞 和 成 骨 细 胞, 并 合 成 基 质,1 周 后 便 开 始 钙 化, 几 周 后 出 现 骨 折 端 骨 痂 5 骨 重 建 和 塑 型 期 在 骨 折 愈 合 的 整 个 过 程 中, 以 上 各 个 时 期 是 互 相 交 叉 重 叠 连 续 不 断 的 过 程 接 骨 七 厘 片 药 理 特 性 在 早 期 为 活 血 化 瘀 和 消 炎 止 痛, 在 中 期 能 够 加 速 骨 折 愈 合, 而 后 期 主 要 能 够 增 强 骨 痂 强 度 的 作 用 [36-37] 动 物 实 验 证 实 接 骨 七 厘 片 可 刺 激 骨 折 局 部 毛 细 血 管 网 形 成, 增 加 成 骨 细 胞 数 目, 使 骨 折 愈 合 时 间 提 前, 并 使 骨 痂 质 量 提 高, 抗 折 力 增 强, 能 促 进 骨 折 愈 合 方 中 药 物 与 药 物 之 间 的 协 同 作 用, 增 强 了 骨 断 端 细 胞 修 复 和 局 部 骨 细 胞 代 谢, 促 进 新 的 毛 细 血 管 在 骨 断 端 的 滋 生 和 沟 通, 有 利 于 骨 痂 的 形 成 和 骨 细 胞 再 生, 故 可 缩 短 骨 折 愈 合 时 间 研 究 表 明 局 部 的 血 液 供 应 是 影 响 骨 折 愈 合 的 最 根 本 因 素, 一 切 影 响 血 液 供 应 的 因 素 都 会 影 响 骨 折 愈 合, 而 血 管 的 形 成 在 骨 折 愈 合 中 起 着 重 要 的 新 生 作 用, 也 是 支 持 成 骨 细 胞 成 骨 所 必 需 [38] 陈 玲 等 实 验 数 据 证 明, 接 骨 七 厘 片 可 显 著 降 低 全 血 黏 度 及 血 浆 黏 度, 改 善 血 液 流 变 性, 使 骨 折 部 位 的 血 供 得 到 明 显 改 善, 而 骨 折 处 毛 细 血 管 再 生 活 跃, 可 使 局 部 血 容 量 增 加, 血 液 供 应 丰 富, 加 速 血 肿 吸 收 机 化 促 使 纤 维 组 织 增 生, 纤 维 骨 痂 形 成 加 快, 成 骨 细 胞 再 生 活 跃, 可 缩 短 纤 维 骨 痂 转 变 为 骨 性 骨 痂 的 过 程 经 组 织 学 切 片 检 查, 也 从 新 生 肉 芽 组 织 骨 愈 合 性 质 骨 痂 形 成 量 及 骨 髓 出 现 情 况 等 方 面 证 实 了 上 述 的 观 点 有 研 究 表 明 接 骨 七 厘 片 能 够 在 动 物 水 平 促 进 血 液 循 环 加 速 钙 离 子 的 吸 收 和 沉 积 [39], 增 大 骨 小 梁 密 度, 促 进 骨 痂 形 成 的 速 度 和 质 量 [40-41] MC3T3-E1 细 胞 呈 成 纤 维 细 胞 样, 有 多 个 亚 克 隆, 可 以 作 为 体 外 研 究 成 骨 细 胞 分 化 的 良 好 模 [42] 型 周 铜 水 等 实 验 证 明, 骨 碎 补 主 要 成 分 柚 皮 苷 具 有 促 [43] 进 大 鼠 实 验 性 骨 损 伤 愈 合 作 用 宋 钦 兰 实 验 证 明, 骨 碎 补 水 煎 液 (0.02 g/l) 具 有 体 外 增 强 MC3T3-E1 细 胞 增 殖 作 用 本 文 以 体 外 培 养 的 MC3T3-E1 细 胞 为 研 究 对 象, 从 细 胞 水 平 通 过 观 察 接 骨 七 厘 片 药 液 对 成 骨 细 胞 增 殖 和 矿 化 能 力 的 直 接 作 用, 对 其 促 进 骨 折 愈 合 可 能 的 作 用 机 制 进 行 了 初 步 探 索 实 验 使 用 了 比 传 统 细 胞 增 殖 研 究 方 法 MTT 效 果 更 为 稳 定 方 法 更 为 简 便 的 MTS 一 步 法 细 胞 活 力 检 测 试 剂 来 研 究 细 胞 增 殖 情 况 研 究 结 果 显 示, 接 骨 七 厘 片 药 物 处 理 实 验 组 细 胞 在 24 h 和 48 h 的 495 nm 吸 光 度 值 均 显 著 大 于 对 照 组 MC3T3-E1 细 胞 经 成 骨 诱 导 培 养 液 诱 导 21 d 后, 经 茜 素 红 染 色 可 见 细 胞 基 质 中 形 成 形 态 大 小 不 一 的 矿 化 结 节 接 骨 七 厘 片 药 物 处 理 细 胞 的 矿 化 结 节 数 量 明 显 高 于 对 照 组, 差 异 有 显 著 性 意 义 (P < 0.05) MC3T3-E1 细 胞 在 复 苏 时 需 要 注 意 的 问 题 : 取 出 冷 冻 管 后, 须 立 即 放 入 37 水 槽 中 快 速 解 冻, 轻 摇 冷 冻 管 使 其 在 1 min 内 全 部 融 化, 并 注 意 水 面 不 可 超 过 冷 冻 管 盖 沿, 否 则 易 发 生 污 染 情 形 在 解 冻 之 后, 应 直 接 放 入 含 有 ml 新 鲜 培 养 基 的 培 养 瓶 中, 待 隔 天 再 置 换 新 鲜 培 养 基 以 去 除 二 甲 基 亚 砜 即 可, 如 此 可 避 免 大 部 分 解 冻 后 细 胞 无 法 生 长 或 贴 附 之 问 题 根 据 上 述 结 果, 作 者 推 断 促 进 成 骨 细 胞 增 殖 和 矿 化 能 力 可 能 是 接 骨 七 厘 片 在 临 床 上 促 进 骨 折 愈 合 作 用 的 两 条 途 径 作 者 贡 献 : 资 料 收 集 分 析 评 估 成 文 均 为 姚 明 智 利 益 冲 突 : 文 章 及 内 容 不 涉 及 相 关 利 益 冲 突 伦 理 要 求 : 没 有 与 相 关 伦 理 道 德 冲 突 的 内 容 学 术 术 语 : 茜 素 红 染 色 - 成 骨 诱 导 的 过 程 是 使 钙 离 子 能 够 以 钙 盐 的 方 式 沉 淀 下 来, 这 就 是 常 说 的 钙 结 节 鉴 定 钙 结 节 的 染 色 方 法 常 用 茜 素 红 染 色, 染 色 的 原 理 就 是 茜 素 红 和 钙 发 生 显 色 反 应, 产 生 一 种 深 红 色 的 带 色 化 合 物, 这 样 成 骨 诱 导 的 细 胞 外 面 沉 积 的 钙 结 节 也 就 被 染 成 了 深 红 色 作 者 声 明 : 文 章 为 原 创 作 品, 无 抄 袭 剽 窃, 无 泄 密 及 署 名 和 专 利 争 议, 内 容 及 数 据 真 实, 文 责 自 负 4 参 考 文 献 References [1] 胡 蕴 玉. 骨 折 愈 合 的 分 子 生 物 学 进 展 [J]. 当 代 医 学,2002,8(1): [2] 王 慧, 李 玉 坤. 成 骨 细 胞 分 化 调 控 因 子 研 究 进 展 [J]. 国 际 骨 科 学 杂 志,2011,32(6): [3] 于 明 圣, 黄 东, 刘 晓 春, 等. 炎 性 因 子 对 骨 折 愈 合 过 程 中 Runx2 信 号 通 道 影 响 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 医 药 指 南,2013,11(29): [4] 王 保 仓, 张 立 峰, 于 永 林, 等. 骨 折 愈 合 研 究 进 展 [J]. 局 解 手 术 学 杂 志, 2003,12(5): [5] Manolagas SC, Jilka RL. Bone marrow, cytokines, and bone remodeling. Emerging insights into the pathophysiology of osteoporosis. N Engl J Med. 1995;332(5): [6] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol. 1990;143(3): [7] Sudo H, Kodama HA, Amagai Y, et al. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol. 1983;96(1): [8] 朱 建 林, 于 跃 爱, 王 玉 霞. 接 骨 七 厘 片 治 疗 创 伤 骨 折 临 床 疗 效 观 察 [J]. 中 国 中 医 骨 伤 科 杂 志,2000,8(5): [9] 王 力, 郑 甦, 杨 风 云, 等. 壮 筋 续 骨 汤 促 进 大 鼠 胫 骨 骨 折 愈 合 :RT-PCR 法 检 测 核 心 结 合 子 α1 基 因 表 达 的 验 证 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复,2010,14(20): [10] 魏 合 伟, 林 一 峰, 曲 崇 正, 等. 中 药 骨 康 含 药 血 清 对 骨 质 疏 松 性 骨 折 愈 合 过 程 中 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 表 达 的 影 响 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复,2008,12(37): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1697

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