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继戎东马
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1 园艺学报 2014,41(6): http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica 菠萝凋萎相关病毒 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立胡加谊 1,2, 罗志文 2, 范鸿雁 2, 李向宏 2, 刘志昕 3, 何凡 ( 1 海南大学环境与植物保护学院, 海口 ; 2 海南省农业科学院热带果树研究所, 农业部海口热带果树科学观测实验站, 海口 ; 3 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 ) 2,* 摘要 : 菠萝凋萎相关病毒 (Pineapple mealybug wilt associated virus-2,pmwav-2) 是引起的菠萝凋萎病 (Mealybug wilt of pineapple,mwp) 的重要病原本研究中根据 PMWaV-2 外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针, 建立基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法该方法能高灵敏检测出阳性样品, 对阴性样品及空白对照均无荧光反应 ; 灵敏度比普通 PCR 高 100 倍 ; 重复性试验表明批内和批间变异系数均在 1.85% 以内, 表明本方法是一种操作简便特异性强灵敏度高重复性较好的 PMWaV-2 定量检测方法关键词 : 菠萝 ; 菠萝凋萎病毒 2(PMWaV-2);TaqMan 探针 ; 实时荧光定量 RT-PCR; 检测中图分类号 :S 668.3;S 432 文献标志码 :A 文章编号 : X(2014) Development of a Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method for the Detection of Pineapple mealybug wilt associated virus-2 HU Jia-yi 1,2,LUO Zhi-wen 2,FAN Hong-yan 2,LI Xiang-hong 2,LIU Zhi-xin 3,and HE Fan 2,* ( 1 College of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou ,China; 2 Institute of Tropical Fruit Trees,Hainan Academy of Agricultural Sciences/Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees,Ministry of Agriculture,Haikou ,China; 3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou ,China) Abstract:Pineapple mealybug wilt associated virus-2(pmwav-2)is an important pathogen that causes Mealybug wilt of pineapple(mwp). This study established a real-time quantitative RT-PCR method with TaqMan probe based on specific primers of conserved nucleotide sequence of PMWaV-2 coat protein gene. The results showed that the method is highly sensitive to positive sample,but has no fluorescence signal to health sample and water control. The sensitivity of real-time quantitative RT-PCR is about 100 times higher than regular PCR. Three-time repeats revealed that the coefficients of variation between the intra- and inter-assay were both within 1.85%,indicating a simple,specificity,high sensitivity,and reliable reproducibility detection method to PMWaV-2. Key words:pineapple;pmwav-2;taqman probe;real-time quantitative RT-PCR;detction 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项经费项目 ( ); 海南省重大科技项目 (ZDZX ); 海南省科学事业费项目 ( 琼财预 [2013]131 号 ); 海南省重点科技计划应用研究及产业化项目 (ZDXM ) * 通信作者 Author for correspondence( hefanhn@163.com)

2 1258 园艺学报 41 卷菠萝凋萎病 (Mealybug wilt of pineapple wilt,mwp) 是世界各菠萝主产区的重要病害之一, 对经济栽培造成严重影响 (Carter,1934,1942,1945) 菠萝凋萎病的发生被认为是菠萝凋萎病毒 (Pineapple mealybug wilt associated virus) 和粉蚧共同危害的结果, 全世界已报道了 5 种菠萝凋萎病毒, 即 PMWaV-1 PMWaV-2 PMWaV-3 PMWaV-4 和 PMWaV-5(Gambley et al.,2008) 和两种传毒粉蚧, 即菠萝洁白粉蚧 (Dysmicoccus brevipes) 和新菠萝灰粉蚧 (D. neobrevipes) 目前, 在中国已见报道的菠萝凋萎病毒有 PMWaV-1 PMWaV-2 和 PMWaV-3( 吴丽亭等,2009,2010; 李运合等,2010) 夏威夷大学的学者经研究首次提出 PMWaV-2 为菠萝凋萎病的重要病原之一 (Sether et al.,1998,sether & Hu,2002) 国内有学者报道,PMWaV-2 和菠萝粉蚧共同作用是引起菠萝凋萎病的最重要原因, 其发病率可高达 60%, 可造成 25% ~ 30% 的经济损失 ( 龚标勋,2002) 病毒病的防治目前还没有疗效明显的药剂, 对发病植株做到提前检测和及早诊断, 及时作出病害防治措施, 对减少田间损失就显得尤为重要目前用于菠萝凋萎病毒的检测方法主要有免疫电镜检测 (Gunasinghe & German,1989) 酶联免疫吸附(Hu et al.,1996) 组织免疫印记(Hu et al.,1997) 和反转录聚合酶链反应 (Reverse transcription-polymerse chain reaction,rt-pcr)(walkman et al., 1995;Sether et al.,2001,2005) 等技术, 但这些方法都存在较大的限制因素, 诸如免疫电镜成本太高, 血清学方法病毒粒子提纯困难, 组织免疫印迹容易出现假阳性,RT-PCR 的后期处理易交叉污染等实时荧光定量 PCR 技术 (Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,fq PCR) 是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司研发的一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法该方法具有可定量高特异性高敏感性高通量等优点, 非常适合于植株体内病毒的定量检测 ( 徐小刚和刘雅婷,2009), 目前国际上尚无应用重组质粒作为标准品构建标准曲线达到对 PMWaV-2 定量检测的报道, 国内也无关于 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测的报道鉴于菠萝凋萎病对中国菠萝产业造成较大的损失, 急需建立一种高灵敏度的检测方法年作者根据 PMWaV-2 外壳蛋白 (coat protein,cp) 基因的保守序列设计引物和 TaqMan 探针, 通过制备重组质粒标准品构建标准曲线, 建立起一套基于 TaqMan 探针 PMWaV-2 的实时荧光定量 RT-PCR 检测体系 1 材料与方法 1.1 材料本试验于年在海南省海口市中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行菠萝植株样品及 PMWaV-2 阳性样品均为海南省农业科学院热带果树研究所提供 RNA 提取试剂盒为 Bioteke 公司的多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒 ; 反转录酶为 TransGen 公司的 Transscriptfiret-strand cdna synthesis supermix;trans5α Cell 购自 TransGen 公司 ;pmd18-t 载体 Taq DNA 聚合酶 DNA Marker DL2000 Real Master Mix(Prob) 均购自 TaKaRa 公司 ; 琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自 AXYGEN 公司 ;TaKaRa TP600 PCR 仪 ;Stratagene 公司的 MX3005 荧光 PCR 仪 ; 美国 Thermo 公司 NanoDrop ND-2000C 微量紫外分光光度计 1.2 引物和探针的设计合成根据 NCBI 报道的 PMWaV-2 外壳蛋白基因 (HE EU JN JX JN JN DQ225114) 的保守序列设计特异性 TaqMan 探针和引物 ( 表 1), 探针 5 标记荧光基团 FAM,3 标记淬灭基团 TAMRA, 预计扩增片段大小 168 bp

3 6 期胡加谊等 : 菠萝凋萎相关病毒 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1259 引物名称 Primer 表 1 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针 Table 1 The primers and probe designed for real-time fluorescent quantitative RT-PCR of PMWaV-2 引物探针序列 (5 3 ) Sequence PMWaV-2-F CGTGAGTGAGGTGGTTGAG 59 PMWaV-2-R GCAAAGAACTGCTTGGGT 55 Probe FAM-TGGCTCATCACGGAGTACCCAAGC-TAMRA 66 退火温度 / Annealing temperature 1.3 菠萝总 RNA 提取和 RT-PCR 称取 0.1 g 的菠萝叶片基部白色组织, 用 Bioteke 公司的多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 提取菠萝叶片总 RNA, 取 5 µl RNA 于 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 ; 用 ND-2000C 紫外分光光度计测定其浓度, 并将叶片总 RNA 置 80 冰箱中备用以提取的菠萝叶片总 RNA 为模板, 按康为世纪有限公司 TransScript Ⅱ Reverse Transcriptase 说明书反转录合成第一链 cdna 20 µl 反转录体系为 Primer Mix 2 µl 2.5 mmol L -1 dntp Mix 4 µl RNase-free H 2 O 3.5 µl 5 RT Buffer 4 µl Ribonuclease Inhibitor 0.5 µl Super RT 1 µl 和 RNA 模板 5 µl 混合溶液于 42 水浴 1 h,85 孵育 5 min 结束反应以反转录合成的 cdna 为模板进行 PCR 扩增,20 µl 扩增体系包括 Taq(5 U µl -1 )0.2 µl, 10 PCR buffer( 含 Mg 2+ )2 µl,dntp Mixture(2.5 mmol L -1 )1 µl,pmwav-2-f(10 µmol µl -1 ) 0.5 µl,pmwav-2-r(10 µmol µl -1 )0.5 µl,cdna 1 µl 和 ddh 2 O 14.8 µl PCR 反应条件为 :94 预变性 3 min;94 30 s,55 30 s,72 20 s, 循环 35 次 ;72 10 min,4 停止 PCR 产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 拍照并比对序列 1.4 质粒标准品的制备以总 RNA 反转录合成的第一链 cdna 为模板, 以特异性引物 PMWaV-2-F/PMWaV-2-R 扩增获得其特异性目的片段, 将获得的目的片段克隆到 pmd18-t 载体上, 转化大肠杆菌感受态, 挑取阳性克隆于 LB 液体培养基中, r min -1 振荡培养 6 h 以上提取质粒, 经菌液 PCR 测序确定目标序列核酸蛋白测定仪测定阳性质粒的浓度, 并按照公式 C = A/B ( 其中 C 为 copies µl -1,A 为以 OD 260 分析得到的浓度 ng µl -1,B 为质粒 DNA 分子量 ) 计算质粒浓度拷贝数, 20 保存作为标准品备用 1.5 探针适用性验证以菠萝凋萎病显症叶片总 RNA 反转录合成的第一链 cdna 为模板, 质粒 DNA 为阳性模板, 健康菠萝叶片总 RNA 反转录合成的 cdna 为阴性对照, 水为空白对照进行实时荧光定量 PCR 反应, 即 25 µl 反应体系包括 Premix Ex Taq(probe qpcr)(2 )12.5 µl,pmwav-2-f(10 µmol L -1 )0.5 µl,pmwav-2-r(10 µmol L -1 )0.5 µl,rox reference Dye(50 )0.5 µl,probe(10 µmol L -1 ) 1 µl, 模板 1 µl,ddh 2 O 9 µl 反应程序为:95 预变性 3 min;95 变性 30 s,55 退火 30 s, 72 延伸 20 s,40 个循环 1.6 标准曲线的建立以 10 倍梯度稀释的质粒标准品为模板, 取终浓度为 ~ copies µl -1 的 6 个质粒样品, 按 1.5 中的实时荧光定量反应体系在 Mx3005 荧光定量 PCR 仪上检测, 得出各自的荧光扩增曲线, 仪器软件自动生成标准曲线

1260 园艺学报 41 卷 1.7 特异性试验以含 PMWaV-2 CP 基因目的片段的重组质粒为阳性模板, 分别对含有 PMWaV-1 和 PMWaV-3 等病毒的 cdna 模板进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增, 同时设置阴性对照 1.8 灵敏度试验将质粒标准品按 10 倍梯度稀释, 取终浓度为 6.16 ~ 6.

4 1260 园艺学报 41 卷 1.7 特异性试验以含 PMWaV-2 CP 基因目的片段的重组质粒为阳性模板, 分别对含有 PMWaV-1 和 PMWaV-3 等病毒的 cdna 模板进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增, 同时设置阴性对照 1.8 灵敏度试验将质粒标准品按 10 倍梯度稀释, 取终浓度为 6.16 ~ copies µl -1 等 10 个浓度的质粒标准品作为模板, 按 1.5 中的实时荧光定量反应体系在 Mx3005 荧光定量 PCR 仪上检测, 得出荧光定量 PCR 所能检出的最低模板拷贝数同时按照 1.3 中 PCR 反应体系进行普通 PCR 的灵敏度测试实验, 与所建立的荧光定量 PCR 的灵敏度进行比较 1.9 重复性试验将质粒标准品按 10 倍梯度稀释, 取 ~ copies µl -1 等 5 个稀释浓度的样品为模板进行实时荧光定量 PCR 反应将以上不同浓度的质粒 DNA 模板每天进行 1 次实时荧光定量 PCR 反应, 连续 3 d 即 3 次重复, 考察不同试验的批次差异性根据获得的 Ct 值计算平均 Ct 值标准差和变异系数 1.10 田间样品检测应用已建立的方法对采自田间的 11 份菠萝样品进行实时荧光定量 RT-PCR 检测 2 结果与分析 2.1 菠萝叶片总 RNA 提取与 RT-PCR 检测结果健康和染病菠萝叶片中提取的总 RNA 经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测,18S 和 28S RNA 条带清晰可见, 无弥散, 经紫外分光光度计测定, 其 OD 260 /OD 280 比值为 2.05, 符合下一步试验要求以反转录生成的第一链 cdna 为模板扩增 PMWaV-2 CP 基因目的片段, 所设计的引物在常规 PCR 体系和程序下能够清晰敏捷地扩增出与预测片段大小一致的片段 ( 图 1), 经测序分析及 Blast 比对, 确定所获得的序列为 PMWaV-2 CP 基因目的片段图 1 RT-PCR 检测 PMWaV-2 M:Marker DL2000;1:CP 基因片段扩增 ; 2:CP 基因片段重复扩增 ;CK - : 阴性对照 Fig. 1 Detection of PMWaV-2 by RT-PCR M:Marker DL2000;1:Fragment of CP gene amplification; 2:Fragment of CP gene repeat amplification; CK - :Negative control. 2.2 探针适用性检测以含有 PMWaV-2 目的片段的重组质粒为阳性模板, 经实时荧光定量 RT-PCR 检测, 可观察到明显荧光信号强度的增长, 而健康 ( 阴性 ) 对照和空白对照荧光吸收值均没有变化 ( 图 2), 表明所设计的引物和探针适用于 PMWaV-2 的实时荧光定量 RT-PCR 检测

5 6 期胡加谊等 : 菠萝凋萎相关病毒 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1261 图 2 实时荧光定量 RT-PCR 探针适用性试验 Fig. 2 Probe applicability of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV 标准曲线的建立以 10 倍梯度稀释的阳性质粒为标准模板进行 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 反应其扩增曲线随着阳性质粒模板浓度的稀释倍数增大,Ct 值呈现递增趋势如图 3 所示, 在 ~ copies µl -1 浓度范围内, 标准品浓度与 Ct 值之间具有良好的线性关系, 曲线斜率为 3.267, 决定系数 R 2 = 0.997, 直线方程为 Y = 3.267log(X) , 扩增效率为 102.3%, 由此建立的标准曲线可以用于 PMWaV-2 的检测 Fig. 3 图 3 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 标准品动力曲线图 Strand curve of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV 实时荧光定量 RT-PCR 检测的特异性用本试验所建立实时荧光定量 RT-PCR 检测体系, 分别以 PMWaV-2 CP 片段的重组质粒和含 PMWaV-1 PMWaV-3 等病毒的 cdna 样品为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增结果如图 4, 除了含 PMWaV-2 目的片段的阳性质粒出现良好的特异性扩增曲线,PMWaV-1 PMWaV-3 和阴性对照检测结果均无荧光吸收值的变化, 表明本试验所建立的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法能够特异性地检测 PMWaV 实时荧光定量 RT-PCR 检测的灵敏度普通 RT-PCR 的最低检出限测为 copies µl -1 ( 图 5), 实时荧光定量 RT-PCR 最低检出为 61.6 copies µl -1 ( 图 6), 表明实时荧光定量 RT-PCR 检测灵敏度为普通 RT-PCR 的 100 倍

1262 园艺学报 41 卷图 4 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 特异性试验结果 Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-2 图 5 PMWaV-2 普通 RT-PCR 检测灵敏度 Fig. 5 General RT-PCR for PMWaV-2 M:Marker 2000;1:6.

16 10 3 copies µl -1 ; 9:6.16 10 2 copies µl -1 ;10:6.16 10 1 copies µl -1 ;CK - :Negative control. 2.6 重复性通过对 6.16 10 2 ~ 6.

6 1262 园艺学报 41 卷图 4 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 特异性试验结果 Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-2 图 5 PMWaV-2 普通 RT-PCR 检测灵敏度 Fig. 5 General RT-PCR for PMWaV-2 M:Marker 2000;1: copies µl -1 ;2: copies µl -1 ;3: copies µl -1 ;4: copies µl -1 ; 5: copies µl -1 ;6: copies µl -1 ;7: copies µl -1 ;8: copies µl -1 ; 9: copies µl -1 ;10: copies µl -1 ;CK - :Negative control. 2.6 重复性通过对 ~ copies µl -1 稀释梯度的质粒 DNA 实时荧光定量 RT-PCR 的扩增曲线 ( 图 7) 和进行统计学分析 ( 表 2), 发现同一批次试验各梯度的变异系数均小于 1.25%, 表明该方法具有较好组内的重复性而批次间重复性试验结果表明, 各梯度批间差异系数均小于 1.85%, 表明该方法的批间重复性较好, 可以用于菠萝叶片 PMWaV-2 的定量检测表 2 重复性试验统计结果 Table 2 Intral-assay and inter-assay reproducibility of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2 质粒拷贝数 /(copies µl -1 ) 组内重复 Reproducibility of intral-assay 组间重复 Reproducibility of inter-assay Plasmid concentration Ct SD CV/% Ct SD CV/%

7 6 期胡加谊等 : 菠萝凋萎相关病毒 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1263 图 6 PMWaV-2 单重实时荧光定量 RT-PCR 的灵敏度 Fig. 6 The sensibility of single RT-qPCR for PMWaV-2 图 7 实时荧光定量 RT-PCR 扩增曲线重复性 Fig. 7 The reproducibility test of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV 田间样品检测结果对采自海南省田间的 11 份菠萝凋萎病症显隐症植株样品进行检测, 应用所建立的实时荧光定量 RT-PCR 体系均可以进行稳定的扩增, 所以可以利用扩增曲线和 Ct 值来对样品是否带毒和病毒含量进行检测和定量由样品检测图 8 可以看出, 除了 4 号和 5 号样品, 其它样品均出现特异性扩增曲线说明除了 4 号和 5 号样品, 其他样品均为 PMWaV-2 阳性样品图 8 应用实时荧光定量 RT-PCR 对田间样品 (1 ~ 11) 进行带毒检测的效果比较 Fig. 8 The comparison results of field samples(1 11)by real-time fluorescent quantitative RT-PCR for the PMWaV-2 detection

1264 园艺学报 41 卷普通 RT-PCR 检测结果中, 除了 9 号样品与实时荧光定量 RT-PCR 不同, 其他样品均与普通 RT-PCR 检测结果一致 ( 图 9) 对 9 号样品进行测序, 结果表明 9 号样品与 PMWaV-2 的同源性为 100% 说明实时荧光定量 RT-PCR 灵敏度高于普通 RT-PCR, 能够检测到 9 号样品较低的病毒含量图 9 普通 RT-PCR

3 讨论实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 RNA 病毒, 通常用体外转录的 RNA 片段作为标准品 (Nolan et al.,2006), 可消除因 RNA 提取和反转录效率不同带来的试验误差但存在标准品易降解较难保存每次试验均要重新稀释定量等问题 (Hoffmann et al.

8 1264 园艺学报 41 卷普通 RT-PCR 检测结果中, 除了 9 号样品与实时荧光定量 RT-PCR 不同, 其他样品均与普通 RT-PCR 检测结果一致 ( 图 9) 对 9 号样品进行测序, 结果表明 9 号样品与 PMWaV-2 的同源性为 100% 说明实时荧光定量 RT-PCR 灵敏度高于普通 RT-PCR, 能够检测到 9 号样品较低的病毒含量图 9 普通 RT-PCR 对田间样品进行带毒检测的效果比较 M:Marker 2000;1 ~ 11: 样品编号 ;CK - : 阴性对照 Fig. 9 General RT-PCR for the PMWaV-2 detection of field samples M:Marker 2000;1 11:Code of the samples;ck - :Negative control. 3 讨论实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 RNA 病毒, 通常用体外转录的 RNA 片段作为标准品 (Nolan et al.,2006), 可消除因 RNA 提取和反转录效率不同带来的试验误差但存在标准品易降解较难保存每次试验均要重新稀释定量等问题 (Hoffmann et al.,2005), 一定程度上增加了操作难度和试验误差本试验采用重组质粒 DNA 作为标准品, 具有保存稳定易于标准化等优点 ; 同时, 在样品检测的试验中, 通过取等量的菠萝叶片提取总 RNA, 并且在测定 RNA 浓度和质量后将样品 RNA 稀释到同一浓度, 再在相同的反转体系下同时反转录生成第一链 cdna, 最大程度地避免了 RNA 提取效率和反转录效率不同引起的误差, 提高试验效率同时也有研究表明不同目的片段 RNA 的反转录效率相差很大, 但对于同一个靶片段而言, 其反转录效率稳定 (Hayward et al.,1998), 可见在本研究中采用重组质粒 DNA 作为标准品并不会影响试验效果样品检测试验中,9 号样品在实时荧光定量 RT-PCR 检测下呈现 PMWaV-2 阳性, 并且经测序验证无误, 但是在普通 RT-PCR 检测中却呈现 PMWaV-2 阴性现象, 这是因为 9 号样品 Ct 值为 31.53, 根据实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线算得 9 号样品 PMWaV-2 外壳蛋白基因拷贝数为 copies 所以 9 号样品所含病毒拷贝数在普通 RT-PCR 最低检测线以下, 但在实时荧光定量 RT-PCR 检测范围之内这表明本试验所建立的 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的灵敏度远高于普通 RT-PCR, 不仅适合于凋萎病隐症植株叶片组织中 PMWaV-2 的检测和量化, 监测田间凋萎病的发生和蔓延, 为病情及时有效的控制提供一定的技术支持, 还能为菠萝脱毒苗繁育过程中菠萝凋萎病病毒病原的定量检测提供有效的方法实时荧光定量检测方法已广泛的应用于植物病毒学研究中, 国外 Zhu 等 (2010) 用实时荧光定量 RT-PCR 方法监测和定量夏威夷的甘蔗黄叶病毒,Rizza 等 (2009) 发现实时荧光定量方法检测植物组织中柑橘病毒体 Ⅲ 具有很强的特异性和高灵敏度在中国实时荧光定量 PCR 技术目前已应用于柑橘碎叶病毒 ( 刘科宏等,2009) 和李痘病毒 ( 高雅红等,2011), 特异性和灵敏度都强于普通

9 6 期胡加谊等 : 菠萝凋萎相关病毒 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1265 RT-PCR 本研究是应用重组质粒作为标准品构建标准曲线, 从而建立起 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的首次报道, 这也是国内首次关于 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的报道, 同样具有优于普通 RT-PCR 的高灵敏度, 且能快速准确地检测 PMWaV-2 在寄主中的含量, 适用于在寄主组织中含量较低的植物病毒的定量检测, 还可应用于病毒在寄主内的运动复制规律及其与寄主互作机制的研究 References Carter W Mealy-bug wilt and green spot in Jamaica and Central America. Phytopathology,24 (4): Carter W The geographical Distribution of mealybug wilt with notes on some other insect pests of pineapple. Journal of Economic Entomology,35 (1): Carter W Some etiological aspects of mealybug wilt. Phytopathology,35: Gambley C F,Steele V,Geering A D W,Geering J E. Thomas The genetic diversity of ampeloviruses in Australian pineapples and their association with mealybug wilt disease. Australasian Plant Pathology,37 (2): Gao Ya-hong,Wang Jin-zhong,Li Ming-fu,Li Gui-fen Development of a Real-time fluorescent quantitative RT-PCR method for the detection of Plum pox virus. Letters in Biotechnology,22 (1): (in Chinese) 高雅红, 王进忠, 李明福, 李桂芬李痘病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立. 生物技术通讯,22 (1):77 80 龚标勋菠萝凋萎病及其防治措施. 植物医生,(1):31. Gunasinghe U B,German T L Purification and partial characterization of a virus from pineapple. Phytopathology,70: Hayward A L,Oefner P J,Sabatini S,Kainer D B,Hinojos C A,Doris P A Modeling and analysis of competitive RT-PCR. Nucleic Acids Research,26 (11): Hoffmann B,Beer M,Schelp C,Schirrmeier H,Depner K Validation of a Real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. Journal of Virological Methods,130 (1): Hu J S,Sether D M,Liu X P,Wang M,Zee F,Ullman D E Use of a tissue blotting immunoassay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii. Plant Disease,81 (10): Hu J S,Sether D M,Ullman D E Detection of pineapple closterovirus in pineapple plants and mealybugs using monoclonal antibodies. Plant Pathology,45: Li Yun-he,Mo Yi-wei,Xi Jin-gen,Zhang Lu-bin,Sun Guang-ming Detection of Pineapple mealybug wilt-associated viruses with RT-PCR. Chinese Journal of Tropical Crops,31 (6): (in Chinese) 李运合, 莫忆伟, 习金根, 张鲁斌, 孙光明应用 RT-PCR 方法检测菠萝凋萎病病毒. 热带作物学报,31 (6): Liu Ke-hong,Zhou Chang-yong,Song Zhen,Zhou Yan,Li Zhong-an,Tang Ke-zhi Detection of Citrus tatter leaf virus(ctlv)by Real-time RT-PCR. Journal of Fruit Science,26 (5): (in Chinese) 刘科宏, 周常勇, 宋震, 周彦, 李中安, 唐科志运用实时荧光 RT-PCR 技术检测柑橘碎叶病毒. 果树学报,26 (5): Nolan T,Hands R E,Bustin S A Quantification of mrna using Real-time RT-PCR. Nature Protocols,1 (3): Rizza S,Nobile G,Tessitori M,Catara A,Conte E Real time RT-PCR assay for quantitative detection of Citrus viroid III in plant tissues. Plant Pathology,58 (1): Sether D M,Hu J S Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of disease. Phytopathology,92: Sether D M,Karasev A V,Okumura C,Arakawa C,Zee F,Kislan M M,Hu J S Differentiation,distribution,and elimination of two different pineapple mealybug wilt-associated viruses found in pineapple. Plant Disease,85 (8): Sether D M,Melzer M J,Busto J,Zee F,Hu J S Diversity and mealybug transmissibility of ampeloviruses in pineapple. Plant Disease,89 (5): Sether D M,Ullman D E,Hu J S Transmission of pineapple mealybug wilt-associated virus by two species of mealybug(dysmicoccus spp.).

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124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,