<4D F736F F D20CAB5CAB1D3ABB9E2B6A8C1BF52542D504352BCECB2E2B2BBCDACBCA6D6D6C8E2C6B7D6CACFE0B9D8B9A6C4DCBBF9D2F2412D BACD20482D B5C4B1EDB4EF2E646F63>
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- 轻戎 管
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1 实 时 荧 光 定 量 TPC 检 测 不 同 鸡 种 肉 品 质 相 关 功 能 基 因 AFABP 和 HFABP 的 表 达 屠 云 洁, 高 玉 时, 王 克 华, 陈 宽 维, 窦 套 存, 唐 修 君 中 国 农 业 科 学 院 家 禽 研 究 所 ( 中 国 农 业 科 学 院 家 禽 研 究 所, 扬 州 ) 摘 要 : 本 研 究 以 如 皋 黄 鸡 和 安 卡 红 鸡 为 研 究 群 体, 选 用 AFABP 和 HFABP 作 为 影 响 鸡 肌 内 脂 肪 的 候 选 基 因, 利 用 实 时 荧 光 定 量 逆 转 录 PC(FQTPC), 对 12 周 龄 AFABP 和 HFABP 基 因 mna 进 行 定 量 分 析, 结 合 IMF 含 量 和 屠 宰 性 状 测 定, 分 析 AFABP 和 HFABP 基 因 表 达 水 平 对 IMF 含 量 等 性 状 的 影 响 结 果 表 明 :HFABP 基 因 mna 表 达 量 与 肌 内 脂 肪 呈 现 显 著 的 负 相 关,AFABP 基 因 表 达 对 IMF 影 响 不 显 著, 但 与 腹 脂 率 呈 显 著 正 相 关 (P<0.05) 安 卡 红 鸡 HFABP 基 因 mna 在 IMF 含 量 的 表 达 量 显 著 高 于 生 长 较 慢 的 如 皋 黄 鸡 (P<0.05) 安 卡 红 鸡 AFABP 基 因 mna 在 腹 脂 的 表 达 量 显 著 低 于 生 长 较 慢 的 如 皋 黄 鸡 H FABP 基 因 表 达 水 平 在 不 同 性 别 间 差 异 不 显 著, 而 AFABP 基 因 表 达 水 平 母 鸡 显 著 高 于 公 鸡 关 键 词 : 鸡, 荧 光 定 量 逆 转 录 PC; 基 因 表 达 ; 肉 品 质 肌 内 脂 肪 与 肌 肉 的 风 味 品 质 和 食 用 价 值 有 很 大 的 关 系, 是 影 响 肉 质 的 重 要 因 素 因 此 进 行 肌 内 脂 肪 性 状 的 研 究, 是 改 善 快 大 鸡 种 肉 质 和 保 持 地 方 鸡 种 特 殊 肉 质 风 味 的 重 要 举 措 心 脏 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 (HFABP) 和 脂 肪 细 胞 型 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 (AFABP) 是 影 响 肌 内 脂 肪 (IMF) 含 量 的 候 选 基 因 (Fisher,2001;Hotamisligi, 1996) 在 纯 种 的 杜 洛 克 猪 群 中 已 经 证 实,AFABP 基 因 位 点 的 遗 传 变 异 与 肌 内 脂 肪 含 量 显 著 相 关 (Gerbens 等,1998, 1999) 尤 溪 麻 鸡 鹿 苑 鸡 和 隐 性 白 羽 鸡 品 种 间 基 因 的 AFABP 第 三 外 显 子 (1805 位 点 ) 的 SNP 影 响 氨 基 酸 序 列 的 变 化 : 由 脯 氨 酸 变 为 丝 氨 酸 ; AFABP 基 因 多 态 位 点 产 生 的 不 同 基 因 型 对 鸡 IMF 含 量 具 有 显 著 的 影 响 ;( 屠 云 洁 等,2004;Tu YunJie 等,2004; 陈 宽 维 等,2006) 由 于 FABPs 基 因 上 的 遗 传 变 化 最 终 将 影 响 他 们 基 因 表 达 水 平 的 质 或 量 的 变 化, 所 以 在 mna 水 平 上 研 究 AFABP 和 HFABP 基 因 对 IMF 沉 积 的 影 响 作 用, 具 有 十 分 重 要 的 意 义 实 时 荧 光 定 量 PC(real time fluorescent quantitativ PC,FQ PC) 技 术 实 现 了 PC 从 定 性 到 定 量 的 飞 跃, 与 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (reverse transcriptase PC,TPC) 相 结 合 使 定 量 极 微 量 的 基 因 表 达 成 为 可 能, 广 泛 用 于 基 因 表 达 研 究 基 因 功 能 研 究 ( 张 静 敏 等,2004; 李 文 海 等,2005) 等 方 面 本 研 究 利 用 实 时 荧 光 定 量 逆 转 录 PC 技 术 (FQTPC), 分 析 不 同 品 种 性 别 鸡 AFABP 和 HFABP 基 因 mna 表 达 在 不 同 品 种 中 的 变 化 规 律, 并 结 合 屠 宰 试 验, 分 析 AFABP 和 HFABP 基 因 mna 表 达 水 平 对 肌 内 脂 肪 含 量 (IMF) 含 量 的 影 响, 检 测 这 两 个 基 因 在 鸡 群 体 中 表 达 的 差 异, 探 索 其 对 鸡 肉 的 风 味 品 质 的 作 用 这 有 利 于 我 们 进 一 步 认 识 肌 内 脂 肪 含 量 (IMF) 的 遗 传 机 制, 为 鸡 肉 质 性 状 的 遗 传 改 良 提 供 新 的 途 径 1. 材 料 与 方 法 1.1 试 验 材 料 选 用 如 皋 黄 鸡 和 安 卡 红 鸡 作 为 试 验 群 体 两 种 鸡 均 来 自 中 国 农 业 科 学 院 家 禽 研 究 所 育 种 中 心 试 验 鸡 群 采 用 网 上 平 养 方 式, 整 个 饲 养 周 期 采 用 肉 鸡 全 价 日 粮 饲 养 于 同 一 试 验 场 中 1.2 屠 宰 性 能 测 定 及 样 品 采 集 在 12 周 龄 屠 宰 取 样, 随 机 抽 取 皋 黄 鸡 50 只 鸡 ( 公 母 各 半 ) 和 安 卡 红 鸡 30 只 ( 公 母 各 半 ) 屠 宰 过 程 中, 立 即 采 集 鸡 心 肌 组 织 和 腹 脂, 保 存 于 液 氮 中, 随 后 转 存 到 70 冰 箱 用 于 候 选 基 因 的 表 达 NA 的 提 取 采 集
2 完 整 的 单 侧 胸 肌 和 腿 肌, 在 进 行 各 测 定 指 标 的 称 量 后, 分 别 去 掉 可 见 脂 肪, 绞 碎 后 装 袋, 保 存 于 20 用 于 肌 内 脂 肪 的 提 取 1.3 肌 内 脂 肪 的 提 取 屠 宰 后 24h, 采 用 索 氏 浸 提 法 测 定 胸 肌 及 腿 肌 的 肌 内 脂 肪 含 量 (IMF) 最 后 根 据 公 式 :IMF%=( 提 前 总 重 提 后 总 重 )/( 提 前 总 重 空 纸 包 重 ) 100 计 算 IMF 含 量 1.4 HFABP 及 AFABP 基 因 mna 表 达 分 析 总 NA 的 提 取 和 检 测 取 约 50100mg 心 肌 腹 脂, 采 用 Tizol 一 步 法 提 取 总 NA 取 1 μl 总 NA 在 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 检 测 其 完 整 性, 利 用 分 光 光 度 计 进 行 NA 浓 度 检 测, 测 定 其 A 260 /A 280 值 cdna 第 一 链 的 合 成 利 用 AMV 反 转 录 酶 试 剂 盒, 将 mna 合 成 cdna 第 一 条 链 反 转 录 反 应 体 系 为 20 μl, 包 括 总 NA 2 μl,oligo dt20 1 μl, AMV 反 转 录 酶 (200U/μL) 1 μl,na 酶 抑 制 剂 1 μl,10 mmol/l dntp Mix 2 μl, 5 TBuffer 4 μl,depc 水 9 μl 反 转 录 条 件 为 :42 30s,99 5min,44 5min mna 定 量 引 物 的 设 计 与 制 备 使 用 Beacon Designer 2.1 软 件 进 行 目 的 基 因 引 物 的 设 计,PC 所 用 引 物 产 物 大 小 见 表 1 基 因 Gene HFABP AFABP GAPDH 表 1 PC 所 用 引 物 产 物 大 小 及 位 置 引 物 (5 3 ) 产 物 长 度 位 置 primers( 5 3 ) Product(bp) Loci F: CCTTACCCACCACCATCAT : GTCTCCTTGGGATCCCACTT F: TGTGGGGTTTGCTA : TAGGGAAATGACATTCAAAGT F: CCCAGACAGAAGGGAACAG : GGGAGACAGAACCCAACAG 退 火 温 度 ( / ) Annealing temperature ( / ) FQPC 测 定 基 因 的 差 异 表 达 量 将 合 成 的 cdna 产 物 做 一 系 列 浓 度 梯 度 稀 释 使 用 Mx300P 荧 光 定 量 PC 仪 进 行 定 量 分 析 每 个 样 品 的 A FABP 和 HFABP 基 因 的 表 达 使 用 GAPDH 作 为 内 对 照 荧 光 定 量 PC 试 验 反 应 体 系 为 15μL, 其 中 包 括 10μL 2 SYBGreenI Master mix( 试 剂 盒 提 供 ), 上 下 游 引 物 各 1μl(100 nm),3μl cdna 产 物, 混 合 样 品, 不 能 使 其 产 生 气 泡 反 应 条 件 为 :95 10 min,95 30 s,5560 1min, 40 循 环 根 据 电 脑 自 动 分 析 荧 光 信 号 将 其 转 换 为 AFABP 和 HFABP 基 因 的 起 始 拷 贝 数 Ct 值, 根 据 各 样 品 的 Ct 值, 计 算 其 起 始 模 板 拷 贝 数 1.5 mna 定 量 数 据 与 肌 内 脂 肪 含 量 等 生 产 性 状 的 关 系 利 用 实 时 定 量 PC 技 术 通 过 2 CT 方 法 分 析 基 因 相 对 表 达 差 异 量 针 对 所 测 定 的 群 体 中 两 种 基 因 mna 的 表 达 情 况, 根 据 影 响 观 测 性 状 的 因 素, 采 用 固 定 模 型 yijkl=μ+dayi+breedj +Sexk+Quantityl +eijklm 对 基 因 表 达 效 应 进 行 分 析, 其 中 yijkl 为 个 体 表 型 记 录 Dayi 为 日 龄 效 应 Breedj 为 品 种 效 应 Sexk 为 性 别 效 应 Quantityl 为 基 因 表 达 效 应 eijklm 为 随 机 误 差
3 运 用 SPSS10.0 软 件 对 数 据 进 行 统 计 分 析,Duncan 多 重 比 较 检 验 不 同 小 组 的 显 著 性 相 关 分 析 使 用 Pearson 检 验 的 偏 相 关 分 析 2 结 果 与 分 析 2.1 NA 提 取 与 T PC 结 果 分 析 总 NA 通 过 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测, 见 NA 有 明 显 的 2 条 带, 可 进 行 反 转 录 用 AFABP 和 HFABP 基 因 引 物 先 在 普 通 PC 仪 上 进 行 PC 扩 增, 检 测 是 否 为 目 的 条 带 2.2 荧 光 定 量 PC 结 果 分 析 将 合 成 的 cdna 第 一 链 产 物 进 行 荧 光 定 量 分 析, 测 定 基 因 的 差 异 表 达 量, 扩 增 结 果 ( 见 图 1, 图 2) 从 图 2, 图 3 可 见, 不 同 品 种 不 同 个 体 的 域 值 循 环 数 (Ct) 不 同 ( 见 表 2) 域 值 循 环 数 (Ct) 的 含 义 指 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 域 值 (threshold) 时 所 经 历 的 循 环 数 根 据 Ct 值 的 不 同 可 以 计 算 出 不 同 品 种 间 基 因 表 达 的 差 异 量 图 1 中, 不 同 品 种 个 体 AFABP 基 因 的 Ct 值 均 比 看 家 基 因 GAPDH 的 Ct 值 大, 安 卡 红 鸡 的 Ct 值 均 比 如 皋 黄 鸡 的 Ct 值 小, 由 图 2 可 见, HFABP 基 因 的 表 达 情 况 则 相 反, 安 卡 红 鸡 的 Ct 值 均 比 如 皋 黄 鸡 的 Ct 值 大 由 表 2 可 见, 如 皋 黄 鸡 HFABP 基 因 的 表 达 是 安 卡 红 鸡 HFABP 基 因 的 表 达 的 倍, 而 如 皋 黄 鸡 AFABP 基 因 的 表 达 是 安 卡 红 鸡 AFABP 基 因 的 表 达 的 倍 图 2 三 个 品 种 AFABP 基 因 及 内 参 GAPDH 基 因 荧 光 定 量 PC 扩 增 曲 线 图 3 三 个 品 种 HFABP 基 因 荧 光 定 量 PC 扩 增 曲 线 表 2 不 同 品 种 AFABP HFABP 基 因 及 内 参 GAPDH 基 因 的 Ct 值 及 相 对 表 达 差 异 量 HFABP GAPDH Ct Ct Ct Ct HFABP BA 2 CT A 对 于 B Ct 的 相 对 表 A GAPDH Ct FABP Ct Ct AFABP BA 2 CT B 对 于 A 的 相 对 表
4 达 量 达 量 安 卡 红 鸡 A 如 皋 黄 鸡 B HFABP 和 AFABP 基 因 表 达 水 平 与 IMF 含 量 等 的 相 关 分 析 将 品 种 和 性 别 作 为 固 定 效 应 对 总 体 数 值 进 行 偏 相 关 分 析, 结 果 表 明 :HFABP 基 因 mna 表 达 量 与 肌 内 脂 肪 呈 现 显 著 的 负 相 关,HFABP mna 相 对 表 达 水 平 与 胸 肌 IMF 含 量 偏 相 关 系 数 为 0.38(P<0.01);A FABP 基 因 表 达 对 IMF 影 响 不 显 著, 但 与 腹 脂 率 呈 极 显 著 正 相 关 (=0.5,P<0.01) 不 同 品 种 间 HFABP 与 AFABP 基 因 表 达 水 平 对 IMF 含 量 及 生 长 性 状 的 作 用 强 度 不 同 将 性 状 作 为 固 定 效 应, 分 析 结 果 见 表 4 如 皋 黄 鸡 HFABP 基 因 mna 表 达 水 平 与 胸 肌 IMF 含 量 存 在 显 著 负 相 关 (0.43,P <0.05),AFABP 基 因 mna 表 达 水 平 对 IMF 含 量 无 显 著 影 响, 但 与 腹 脂 率 (=0.45,P<0.05) 存 在 显 著 正 相 关 ; 安 卡 红 鸡 HFABP 基 因 mna 表 达 水 平 与 屠 体 重 存 在 显 著 正 相 关 (=0.58, P<0.05), AFABP 基 因 mna 表 达 水 平 与 腹 脂 率 存 在 显 著 正 相 关 (=0.51 P<0.01) 表 3 不 同 品 种 HFABP 和 AFABP 基 因 mna 表 达 量 与 相 关 性 状 偏 相 关 分 析 如 皋 黄 鸡 HmNA A mna 安 卡 红 鸡 HmNA AmNA 胸 肌 IMF/% 腹 脂 率 /% 胸 肌 率 /% 腿 肌 率 /% 屠 体 重 0.43* 0.45* 0.23* 0.58* 0.51** 3 讨 论 本 研 究 结 果 表 明 :HFABP 基 因 表 达 水 平 和 IMF 存 在 显 著 的 负 相 关, 即 :HFABP 基 因 表 达 量 减 少 可 引 起 如 皋 黄 鸡 和 安 卡 红 鸡 肌 内 脂 肪 含 量 增 加, 这 一 结 果 与 Gerbens 进 行 不 同 HFABP 基 因 型 表 达 水 平 的 研 究 结 论 相 符 由 于 对 HFABP 基 因 从 基 因 表 达 研 究 上 出 发, 对 生 产 性 状 影 响 的 报 道 少, 有 必 要 进 一 步 扩 大 样 本 含 量 进 一 步 分 析 研 究 AFABP 在 心 肌 和 胸 肌 中 不 表 达, 而 在 脂 肪 组 织 中 表 达 鉴 于 家 禽 脂 肪 组 织 ( 主 要 是 腹 脂 ) 中 脂 肪 酸 的 代
5 谢 强 度 高 差 异 大, 推 测 可 能 与 家 禽 腹 脂 沉 积 有 关 AFABP 基 因 表 达 水 平 在 研 究 中 主 要 对 体 重 屠 体 重 净 膛 率 等 指 标 的 影 响 上, 而 对 IMF 含 量 影 响 不 显 著 这 与 猪 AFABP 基 因 表 达 研 究 结 论 存 在 差 异 : 猪 AFABP 基 因 的 mna 含 量 与 猪 背 最 长 肌 IMF 含 量 显 著 相 关 家 禽 脂 肪 代 谢 不 同 于 猪, 家 禽 脂 肪 的 合 成 主 要 在 肝 脏 组 织, 而 猪 主 要 合 成 部 位 在 脂 肪 组 织, 诸 多 方 面 脂 肪 酸 代 谢 差 异 可 能 是 造 成 种 间 AFABP 基 因 表 达 水 平 研 究 结 果 不 一 致 的 原 因 此 外, 有 研 究 显 示 :IMF 含 量 和 体 重 的 影 响 密 切 相 关,AFABP 基 因 表 达 对 鸡 屠 体 重 净 膛 率 存 在 显 著 的 正 相 关, 因 此 鸡 AFABP 基 因 表 达 水 平 对 IMF 含 量 的 影 响 作 用 需 要 值 得 进 一 步 研 究 本 研 究 应 用 荧 光 定 量 逆 转 录 PC 技 术 检 测 不 同 肉 品 质 相 关 功 能 基 因 HFABP 和 AFABP 的 表 达 差 异, 研 究 结 果 表 明 FQTPC 技 术 具 有 特 异 性 强 灵 敏 度 高 重 复 性 好 定 量 准 确 速 度 快 等 优 点, 使 定 量 极 微 量 的 基 因 表 达 成 为 可 能, 可 以 广 泛 用 于 基 因 表 达 基 因 功 能 研 究 主 要 参 考 文 献 [1] Fisher M, Eriksson P, Hoffstedt J, Hotamisligil G S, Thorne A, yden M, Hamsten A, Arner P. Fatty acid binding p rotein expression in different adipose tissue depots from lean and obese individuals. D iabetologia Oct, (10): [2] Hotamisligil GS, Johnson S, Distel J, Ellis, Papaioannou VE, Spiegelman BM. Uncoupling of obesity from insulin resistance through targeted mutation in ap2, the adipocyte fatty acid binding protein. Science (5291): [3] Gerbens F, Jansen A, van Erp A JM, Harders F, Meuwissen T H E, ettenberger G, Veerkamp J H, te PasM FW. The adipocyte fatty acid2binding p rotein locus: characterization and association with intramuscular fat content in pigs. Mamm Genome, : [4] Gerbens F, van Erp AJ, Harders FL, Verburg FJ, Meuwissen TH, Veerkamp JH, te Pas MF. Effect of genetic variants of the heart fatty acidbinding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs. Anim.Sci (4): [5] Yun Jie TU,Kuan Wei CHEN,et al., Genetic Diversity of Chinese 14 Indigenous Grey goose Breeds Based on Microsatellite Markers,AsianAustralasian Journal of Animal Sciences. 2006,26(1):16. [6] 屠 云 洁, 陈 宽 维 等,3 个 鸡 种 AFABP 基 因 单 核 酸 多 态 性 的 研 究. 扬 州 大 学 学 报, 2004,25(4):4446. [7] 陈 宽 维, 屠 云 洁 等,AFABP 在 不 同 鸡 种 中 遗 传 多 态 性 分 析. 畜 牧 兽 医 学 报. 2006,37(11): [8] 张 静 敏, 金 宁 一, 米 志 强 等, 运 用 实 时 荧 光 定 量 TPC 检 测 人 正 常 组 织 与 肿 瘤 组 织 中 BDT 的 表 达, 中 国 生 物 制 品 学 杂 志,2004,17(3): [9] 李 文 海, 邓 学 梅, 李 宁 等, 用 SSH 法 结 合 荧 光 定 量 PC 技 术 研 究 猪 双 肌 臀 和 非 双 肌 臀 肌 肉 组 织 的 差 异 表 达 基 因, 生 物 化 学 与 生 物 物 理 进 展,2005,32(4):
标题
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