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1 2017 年 8 月第 25 卷第 4 期 中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA August 2017 Vol. 25 No. 4 Micro CT 观察重组人甲状旁腺素在骨折愈合过程中的作用 研究报告 吴成爱 1, 阎国强 1, 李宁 2, 姜旭 3 1, 赵丹慧 (1. 北京市创伤骨科研究所, 北京 ; 2. 北京积水潭医院创伤骨科, 北京 ; 3. 北京积水潭医 院矫形骨科, 北京 ) 摘要 目的使用 Micro CT, 探讨重组人甲状旁腺激素 ( rhpth) 在 2 月龄雄性大鼠骨折愈合过程中的作 用 方法应用 2 月龄雄性 SD 大鼠建立单侧闭合性股骨骨折内固定模型, 随机分为甲状旁腺素治疗组和对照组, 术后分别皮下注射重组人甲状旁腺素 (1-34) 10 μg / (kg. d) 或等剂量生理盐水安慰剂 ( 对照组 ), 分别于术后第 和 42 天取双侧股骨标本, 分别行 X 线检查和 Micro CT 观察, 并进行骨结构的定量分析 结果术后第 21 天, 甲状旁腺素组骨折断端两侧的骨痂之间连续性良好, 骨折线已模糊不清 甲状旁腺组较对照组, 在术后第 42 天骨体积 (bone Volume, BV) 骨体积分数 (BV / TV) 骨密度 (bone mineral density,bmd) 和骨小梁模式因子 (trabec ular bone pattern factor, Tb. Pf) 明显高于对照组 ; 而骨小梁分离度 ( trabecular separation, Tb. Sp) 和各向异性的程度 (degree of anisotropy, DA) 低于对照组 结论 BMD 而降低 Tb. Sp 和 DA, 从而促进骨折的愈合 关键词 低剂量重组人甲状旁腺激素可提高大鼠骨折 BV BV / TV Tb. Pf 和 骨折愈合 ; 甲状旁腺激素 ; 骨体积 ; 骨小梁模型因子 ; 骨密度 ; 大鼠 中图分类号 Q95 33 文献标识码 A 文章编号 (2017) Doi: / j. issn Effect of recombinant human parathyroid hormone on bone fracture healing in the rat observed by micro CT WU Cheng ai 1, YAN Guo qiang 1, LI Ning 2, JIANG Xu 3, ZHAO Dan hui 1 (1. Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics; 2. Department of Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital; 3. Department of Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing , China) Abstract Objective To investigate the accelerating role of recombinant human parathyroid hormone ( PTH) in bone fracture repair. Methods 2 month old male Sprague Dawley rats underwent closed unilateral femoral fracture and in tramedullary nail fixation. The rats were divided into 2 equal groups randomly: the treatment group receiving subcutaneous injection of rhpth(1-34) 10 μg / (kg d) immediately after operation and for 2,7,14,21 and 42 d,respectively, and the control group receiving subcutaneous injection of normal saline in the same volume. X ray and micro CT were conducted at 2, 7, 14, 21 and 42 days after surgery. Results The continuity of porosis between fracture sides was better and fracture line has been blurred in the PTH treated group at 21 days after fracture compared with the control group, the bone volume ( BV),BV / TV, bone mineral density( BMD) and trabecular pattern factor ( Tb. Pf) were significantly higher, and trabecu lar separation ( Tb. Sp) and degree of anisotropy ( DA) were significantly lower in the PTH treated group at 42 days after fracture. Conclusions Our findings suggest that a low dose recombinant human parathyroid hormone can accelerate the bone fracture healing, probably through improving the BV, BV / TV, Tb. P and BMD, and decreasing the Tb. Sp and DA.. Key words Bone fracture healing; Parathyroid hormones; Bone volume fraction; Trabecular pattern factor; Bone mineral density; Rats Corresponding author:wu Cheng ai. wuchengai05@ 163. com [ 基金项目 ] 国家自然科学基金 ( 编号 : ) [ 通讯作者 ] 吴成爱, 女, 副研究员, 研究方向 : 骨科退行性疾病发病机制研究 wuchengai05@ 163. com

2 中国实验动物学报 2017 年 8 月第 25 卷第 4 期 Acta Lab Anim Sci Sin,August 2017,Vol. 25 No 骨折愈合包括了软骨内成骨及膜内成骨两种骨形成的方式 骨折患者中骨折的不愈合率为 5% ~ 10% [1] 重组人甲状旁腺激素 (1-34) (recombinant hu man parathyroid hormone (1-34) 已临床应用于骨质疏松症的治疗以及骨质疏松性骨折的预防, 并且对骨折的愈合同样具有促进作用 本研究室的前期研究表明 : 间断性低剂量应用重组人甲状旁腺素 (1-34) 在骨折愈合的早期过程中, 可上调成骨基因 RUNX2 Osx 的 mrna 表达和蛋白质水平, 促进骨折的愈合 [2] 近年兴起的显微 ( micro CT), 作为一种无创检测手段常用来评价小动物的骨组织, 目前该成像技术的分辨率通常在 10 ~ 82 μm, 可充分满足临床与动物实验对脊柱等部位的皮质骨和骨小梁结构观察及形态计量学分析的需求 [3,4] 为了观察在骨折愈合早期中间断性低剂量重组人甲状旁腺素 (1-34) 作用, 本研究使用 Micro CT 分析了大鼠股骨骨折段骨小梁各项指标 1 材料与方法 1 1 实验动物 2 月龄雄性 SPF 级 SD 大鼠 60 只, 体重 (227 3 ± 6 1) g, 来自北京维通利华实验动物技术有限公司 SCXK( 京 ) ), 饲养于北京大学医学部实验动物部 SYXK( 京 ) 饲养环境温度控制在 (25 ± 2),12 h 昼 / 夜循环 实验动物自由摄入食水 饲料为 SPF 级标准实验室动物饲料 水为蒸馏水 动物饲养管理和动物实验操作均符合 北京市实验动物管理条例, 并通过北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会和北京积水潭医院伦理委员会的批准 ( 批准号 :LA , 积伦动审字第 号 ) 1 2 分组将全部实验大鼠随机分为甲状旁腺激素治疗组 [(227 1 ± 5 9)g,n = 30] 和对照组 ( 等剂量生理盐水安慰剂 )[(227 5 ± 6 4) g,n = 30] 各组在随机分为 5 个亚组 ( n = 6) 于术后当天开始分别给予 rhpth(sigma, 美国 )10 μg / (kg. d) 和等剂量安慰剂 ( 生理盐水 ), 皮下注射, 每日 1 次, 至术后第 天和 42 天安乐死为止 1 3 骨折模型的制备骨折模型的制备参考已有方法 [5], 并加以改 良 用 10% 水合氯醛 300 mg / kg 腹腔内注射麻醉全部大鼠 麻醉成功后, 取右侧卧位, 左侧股骨近端术区备皮,0 5% 碘伏消毒, 于左侧股骨大粗隆上约 0 5 cm 向大粗隆做长约 0 5 cm 纵行切口, 逐层切开深筋膜和肌肉层, 暴露股骨大粗隆顶部, 于大粗隆内侧梨状窝处以 20 号角针开髓进入髓腔, 将直径 1 0 mm 的克氏针 ( 上海浦东金环医疗用品有限公司 ) 植入股骨髓腔 术中触摸股骨干周围及股骨远端, 以确定克氏针位于髓腔内, 用 Kocher 钳以三点折弯方式在左侧股骨干中段制造闭合性骨折 从模型制作上, 由同一实验人员进行操作, 且遵循统一的操作流程, 模型的建立具有一致性 对于横断或短斜形骨干骨折这一类简单骨折, 根据经典的骨折分型 ( 例如 AO 分型 ), 保证骨折部位所受到的暴力程度基本是相同的 三点折弯造成的骨折类型, 均为骨干部位横断或短斜形骨折, 属于简单骨折类型或 AO 分型中的 A 型骨折 再次确定骨折及内固定物位置 内固定效果后, 冲洗伤口, 逐层缝合关闭切口 大鼠分别于术后第 和 42 天给药后 6 h 内,10% 水合氯醛 300 mg / kg 腹腔内注射麻醉后腹主动脉穿刺取血处死各亚组 (n = 6), 取双侧股骨标本, 剔除周围组织, 液氮转运至 - 80 冰箱保存 1 4 实验用药实验用 rhpth (1-34) 以生理盐水稀释至 20 μg / ml, 以 0 1 mol / L 盐酸溶液滴定 ph 值至 4 0, 4 保存 安慰剂为生理盐水, 同样以 0 1 mol / L 盐酸溶液滴定 ph 值至 4 0,4 保存 1 5 Micro CT 扫描与三维重建将股骨标本经保湿处理后置于 Micro CT( Sky Scan 1172,Belgium) 仪器中进行扫描, 扫描方式为旋转 180, 步长 0 4, 扫描分辨率为 12 μm, 管电压 60 kv, 管电流 120 μa, 曝光时间 700 ms,0 5 mm 铝过滤器 扫描完毕后, 采用设备自带的重构软件 NRe con (V ) 获得 1199 张标本的横断面图 使用采用 CTan (V1.14.4) 软件对数据进行分析, 选取以骨折线为中心上下各 200 层 ( 共计 401 层 ) 作为感兴趣区域 ( region of interest, ROI), 完成图像二值化 ( 阈值 ) 后并进行分析, 比较各组 ROI 范围内骨小梁体积 ( BV) ROI 区域总体积 (TV) ROI 区域骨体积分数 (BV / TV) 骨小梁模型因子 (Tb. Pf) 骨小梁分离度( Tb. Sp) 各向异性的程度 (degree of anisotropy, DA) 和骨密度 (BMD); 最

3 352 中国实验动物学报 2017 年 8 月第 25 卷第 4 期 后采用 CTvol V2 2 软件进行三维制图 1 6 骨折愈合的 X 线评估 将股骨标本置于 10 cm 深的水膜中 使用 DR Shimadzu MUX 200D Japan 放射成像 放射条件 为 55 mv 14 ma 投照高度为 100 cm 由同一个放 射科医师评价各组骨折的愈合情况 1 7 统计学分析 使用 SPSS 15 0 软件 计量数据用均值 ± 标准差 表示 进行 t 检验 以 P 0 05 为差异有统计学意义 2 2 1 结果 在大鼠模型中 PTH 促进骨折愈合 rhpth 1 34 促进骨折愈合的作用已在多篇 动物实验研究中报道 如间歇性注射 rhpth 1 34 可提高骨痂的骨密度和骨形成 图1 Fig 1 2 2 6 7 术后第 2 天取得标本中显示 骨折端均尚不连 续 术后第 7 天 甲状旁腺素组和对照组两组骨折端 均未出现明显的骨性连接 术后第 14 天 对照组虽 有骨痂形成 但骨折段端两侧骨痂之间的连续性并 不明显 甲状旁腺素组骨折线仍可见 但骨折断端两 侧的骨痂之间连续性良好 11 术后第 21 天 对照组骨痂之间连续性好 但骨 折线仍可清晰分辨 骨痂体积较小 甲状旁腺素组骨 折断端两侧的骨痂之间连续性良好 骨折线已模糊 不清 骨痂体积较大 在术后第 42 天时 对照组虽 然骨痂之间连续性已经很好 但骨折线仍可清晰分 辨 且骨痂体积较小 而甲状旁腺素组骨折断端两侧 的骨痂之间连续性已经很好 且骨折线已经模糊 骨 痂体积较大 图 1 两组在术后第 21 A C 42 天 B D 骨折愈合情况的 X 线比较 X ray images of the femur fracture repair at 21 A C and 42 B D days after fracture BMD 测量结果 与对照组比较 甲状旁腺激素治疗 42 d 后 BMD 显著升高 t 3 52 P 0 05 但治疗 21 d 后甲状 旁腺 组 与 对 照 组 差 异 无 显 著 性 t 1 556 P 0 05 2 3 Acta Lab Anim Sci Sin August 2017 Vol 25 No 4 Micro CT 结果 Micro CT 扫 描 骨 折 部 位 的 三 维 结 构 见 图 2 绿色为新生成的骨痂 蓝色为原皮质骨和 新 沉积的皮质骨 术后第 21 天 甲状旁腺组新生成 的骨痂 比 对 照 组 的 多 术 后 第 42 天 甲 状 旁 腺 组骨痂外新沉积的皮质骨比对照组的厚 表1 甲状旁腺素治疗组与生理盐水安慰剂 对照组 组大鼠骨折部位 BMD 比较 Tab 1 组别 Groups 对照组 Control Comparison of BMD at the fracture site between PTH and control groups 甲状旁腺组 PTH 术后 21 d 21 days after fracture 术后 42 d 42 days after fracture 0 462 ± 0 044 a 0 582 ± 0 031 bc 0 392 ± 0 062 0 516 ± 0 0073 a 注 对照组术后 21 d 比 较 P 0 05 与 甲 状 旁 腺 组 术 后 21 d 比 较 b P 0 05 与对照组术后 42 d 比较 c P 0 05 Note Compared with the control group at 21 days after fracture a P 0 05 compared with the PTH group at 21 days after fracture b P 0 05 compared with the control group at 42 days after fracture c P 0 05 BMD bone mineral density a

4 中国实验动物学报 2017 年 8 月第 25 卷第 4 期 353 Acta Lab Anim Sci Sin August 2017 Vol 25 No 4 通过软件分析计算出 ROI 范围内骨小梁体积 μm 与 DA 值 显 著 降 低 t 3 78 3 486 P 总体积 骨体积分数和骨小梁模型因子 结果见表 0 05 术后第 21 天 与对照组比较 甲状旁腺组 BV TV 与 Tb Pf mm 值 显 著 升 高 t Tb Sp μm 与 DA 值 显 著 降 低 t 2 79 3 027 2 术后第 42 天 与对照组比较 甲状旁腺组 BV 3 295 14 88 2 79 P 0 05 或 0 01 而 Tb Sp BV TV 值 显 著 升 高 t 4 302 P 0 05 而 P 0 05 注 A B 对照组术后 21 42 d C D 甲状旁腺组术后 21 42 d 图2 大鼠骨折处冠状位 Micro CT 扫描图 Note A B control group at 21 and 42 days after fracture C D PTH group at 21 and 42 days after fracture Fig 2 表2 甲状旁腺素治疗组与生理盐水安慰剂 对照组 组大鼠骨折部位 Micro CT 参数比较 x ± s Tab 2 术后 21 d 21 days after fracture 术后 42 d 42 days after fracture Coronal micro CT scans of the femur fractures Comparison of micro CT parameters at the fracture site between PTH and control rats 变量 Variables TV mm3 BV mm3 BV TV Tb Th mm Tb Sp mm Tb Pf mm 1 DA TV mm3 BV mm3 BV TV Tb Th mm Tb Sp mm Tb Pf mm 1 DA 对照组 Control 65 3 ± 113 66 9 ± 21 48 8 ± 4 268 ± 93 337 8 ± 34 10 ± 7 1 88 ± 0 19 105 7 ± 3 8 a 61 3 ± 22 a 58 1 ± 1 d 374 ± 11 a 340 7 ± 38 a 6 ± 0 8 a 1 9 ± 0 1 a 甲状旁腺组 PTH 143 7 ± 85 a 89 3 ± 67 a 62 3 ± 7 d 256 ± 12 a 232 1 ± 34 d 20 ± 5 a 1 53 ± 0 05 d 151 9 ± 36 bf 107 6 ± 24 bc 70 9 ± 1 bg 395 ± 90 bf 218 5 ± 65 bc 16 ± 3 bg 1 6 ± 0 1 bc 注 与对照组术后 21 d 比较 a P 0 05 与甲状旁腺组术后 21 d 比较 b P 0 05 与对照组术后 42 d 比较 c P 0 05 与对照组术后 21 d 比 较 d P 0 05 与甲状旁腺组术后 21 d 比较 b P 0 05 与对照组术后 42 d 比较 f P 0 05 与对照组术后 42 d 比较 g P 0 01 TV 为骨痂总体 积 BV 为骨体积 BV TV 为骨体积分数 Tb Th 为骨小梁厚度 Tb Sp 为骨小梁分离度 Tb Pf 为骨小梁模式因子 DA 为各异向性程度 Note Compared with the control group at 21 days after fracture a P 0 05 Compared with the PTH group at 21 days after fracture b P 0 05 Com pared with the control group at 42 days after fracture c P 0 05 Compared with the control at 21 days after fracture d P 0 05 Compared with the PTH at 21 days post fracture e P 0 05 Compared with the control group at 42 days after fracture f P 0 05 Compared with the control group at 42 days af ter fracture g P 0 01 TV total volume BV bone mineral density BV TV bone volume total volume Tb Th trabecular thickness Tb Sp tra becular separation Tb Pf trabecular pattern factor DA degree of anisotropy

5 354 中国实验动物学报 2017 年 8 月第 25 卷第 4 期 Acta Lab Anim Sci Sin,August 2017,Vol. 25 No. 4 3 讨论 骨折愈合是一个复杂的生物修复过程, 涉及一 系列组织 细胞 细胞成分等的共同参与和相互作 用, 该过程的最终目的是恢复骨的力学特性 [8,9] 人体内源性甲状旁腺素 ( parathyroid hormone, PTH) 是由 84 个氨基酸残基缩合而成的多肽激素, 在甲状旁腺的内质网中合成, 其在血中存在有 3 种 形式 :(1) 具有生物活性的全段 PTH, 约占 5% ~ 20% ;(2) 氨基端 PTH 片段 ( N PTH1 34), 含量甚 少, 具有生物活性 ;(3) 羧基端 PTH 片段 ( C PTH), 为血循环中的主要部分, 约占 75% ~ 95%, 但其只 有免疫源性, 而无生物活性 对 PTH(1-34) 这一 生物活性片段的研究表明,PTH 可能通过影响包括 成骨细胞 破骨细胞 骨骼内衬细胞 骨细胞等众多 种类的细胞系, 并激活多种信号途径, 从而达到促进 骨形成的作用 [10] 在骨折愈合这一特殊过程中,PTH 对于各种骨 折模型, 包括正常的骨折愈合 [7] 延迟的骨折愈合 以及骨缺损 骨延长术等 [12], 均表现出促进骨形成 的作用 目前公认的大鼠模型中的有效剂量为 60 ~ 200 μg / (kg d), 也有报道低剂量的 PTH 也可有 效的促进骨形成 [13], 而 10 μg / ( kg d) 的剂量是较 接近于患者临床治疗剂量 (20 μg / d) 的 为了评价 10 μg / (kg. d) 低剂量的 PTH 在骨折 愈合过程中的作用, 本研究使用大鼠股骨骨折的模 型检测在 ROI 范围内的骨参数 我们选择于术后 第 l 天和 42 天进行 X 线检测, 术后第 7 天 时, 两组骨折端均未出现骨性连接 术后第 14 天, 甲状旁腺素组骨折线仍可见, 但骨折断端两侧的骨 痂之间连续性良好 在术后第 21 和 42 天,PTH 组 优于对照组的骨折愈合, 提示 10 μg / (kg. d) 低剂量 的 PTH 在术后第 21 天开始明显促进骨折愈合 Micro CT 可以观察局部组织的微管结构, 更加 清晰准确地了解骨折修复的具体情况 [14,15] 采用 Micro CT 技术对骨折愈合状况进行评估, 可以更加 贴切地反映处理因素的对骨折的影响, 对评估骨折 愈合提供更加可靠地依据 [16-18] 本研究结果发现术后第 42 天,PTH 的骨密度 (BMD) 骨体积 (BV) 骨体积分数 (BV / TV) 骨小梁 模式因子 (Tb. Pf) 均高于对照组, 术后第 21 天相对 [7] 骨体积 (BV / TV) 高于对照组 Alkhiary 等观察到 在骨折术后应 rhpth(1-34) 35 d 后停药, 直到术 后第 84 天, 其促进骨折愈合的作用仍持续存在, 这些结果提示 PTH 促进骨折愈合的作用不仅限于骨折愈合早期, 在骨折修复晚期骨重建的过程中同样发挥着作用, 并且在骨折愈合早期开始就开始应用 PTH 可能会获益更大 骨折的愈合过程受到诸多因素影响, 包括创伤能量 骨折端移位程度 骨折类型以及周围软组织损伤程度等 在本实验中, 由同一术者进行骨折模型的制备, 采用标准化操作流程, 通过对骨折所受暴力大小 骨折部位及移位程度等方面的控制, 尽量避免骨折标本的个体间差异 同时本研究所使用的大鼠股骨骨折的模型可间接反映长骨骨干骨折的愈合过程, 但还无法有效的解释以松质骨为主的干骺端骨折的愈合过程 综上所述, 间断性低剂量应用 rhpth(1-34) 在骨折愈合早期可以促进 RUNX2 的表达, 从而促进骨折的愈合, 这也为 PTH 临床应用于骨折的治疗提供了一定的佐证 对骨折部位骨痂体积 皮质骨厚度以及生物力学性能等的定量评价还有待进一步研究 参考文献 [ 1 ] Beaver R, Brinker MR, Barrack RL. An analysis of the actual cost of tibial nonunions [ J]. J La State Med Soc, 1997, 149: [ 2 ] 李宁, 王满宜, 贺良, 等. 间断性低剂量应用重组人甲状旁腺素 (1-34) 在骨折愈合早期促 RunX2 基因的表达 [ J]. 中华医学杂志,2009, 89(11): [ 3 ] 陶剑锋, 赵丹慧, 吴成爱, 等. 显微 CT 旋转步长对牛腰椎松质骨重建图像及数据的影响 [J]. 中国脊柱脊髓杂志,2012, 22(9): [ 4 ] Khosla S, Riggs BL, Atkinson EJ, et al. Effcts of sex and age on bone microstructure at the ultradistal radius: a population based noninvasive in vivo assessment [ J]. Bone Miner Res, 2006, 21 (1): [ 5 ] Bonnarens F, Einhorn TA. Production of a standard closed frac ture in laboratory animal bone [J]. J Orthop Res, 1984, 2: [ 6 ] Andreassen TT, Ejersted C, Oxlund H. Intermittent parathyroid hormone ( 1 34 ) treatment increases callus formation and me chanical strength of healing rat fractures [J]. J Bone Miner Res, 1999, 14(6): [ 7 ] Alkhiary YM, Gerstenfeld LC, Krall E, et al. Enhancement of experimental fracture healing by systemic administration of recom binant human parathyroid hormone ( PTH 1 34 ) [ J]. J Bone Joint Surg Am, 2005, 87(4): [ 8 ] 王耀琴, 彭江, 眭翔, 等. Micro CT 动态观察骨质疏松骨折的愈合 [J]. 中国骨质疏松杂志, 2013, 19(3):

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