Annexin V-EGFP凋亡检测试剂盒

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1 ATP 酶测试盒 ( 组织及细胞膜需高速离心 ) Cat number:kgt02550-kgt Store at -20 for for 6 months For Research Use Only( 科研专用 ) 说明书修订日期 : 此试剂盒可测试高速冷冻离心后的红细胞膜 组织细胞膜 线粒体 微粒体的 ATPase 一 测定意义 : ATP 酶存在与组织细胞及细胞器的膜上, 是生物膜上的一种蛋白酶, 它在物质运送 能量转换以及信息 传递方面具有重要的作用 二 测定原理 : ATP 酶可分解 ATP 生成 ADP 及无机磷, 测定无机磷的量可判断 ATP 酶活力的高低 三 试剂组成及配制 (100T/50 样 ): 名称 规格 储存条件 Buffer A 10ml*3 瓶 4 保存 Buffer B 10ml*1 瓶 4 保存 Buffer C 10ml*1 瓶 4 保存 试剂 D 粉剂 *5 支 -20 以下保存 用时每支加水至 5ml, 现用现配 余下的 -20 以下可保存一周 试剂 E 粉剂 *2 支 用时加水至 5ml, 适当加热溶解,4 保存 试剂 F 粉剂 *1 支 用时加水至 10ml, 室温保存 [ 注 1] Buffer G 10ml*1 瓶 用时加水至 25ml,4 保存 试剂 H 粉剂 *5 瓶 用时每支加水至 40ml 溶解, 溶解后 4 避光保存一周 试剂 I 粉剂 *2 瓶 用时每瓶加水至 100ml 溶解, 室温保存 Buffer J 100ml*2 瓶 2.5mol/L 硫酸,4 保存 Buffer K 10ml*1 瓶 10mmol/L 标准磷储备液,4 保存 1μmol/ml 标准磷应用液配制 : 用时将贮备液 10 倍稀释, 即取 1ml 加蒸馏水至 10ml 定磷剂的配制 : 按 H 2O: 试剂 J: 试剂 H: 试剂 I=2:1:1:1 的比例配制, 配好的定磷剂应为浅黄色, 若无 色则试剂失效, 若是蓝色则为磷污染, 定磷剂需现用现配 [ 注 1]: 试剂 F 为过饱和溶液, 所以在配制时最好用 90 ~100 的热蒸馏水 10.3ml( 热胀冷缩 ) 边隔水加 热边用玻璃棒搅拌, 以使其充分溶解 一次实验用不完再用时可能有结晶, 用之前可以再次边隔水加热边用 玻璃棒搅拌使其溶解 [ 注 2]: 配试剂最好用新的烧杯 玻棒和玻璃移液器, 也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染 四 试剂组成及配制 (50T/24 样 ): 名称 规格 储存条件 Buffer A 10ml*2 瓶 4 保存 Buffer B 10ml*1 瓶 4 保存 Buffer C 10ml*1 瓶 4 保存 试剂 D 粉剂 *3 支 -20 以下保存 用时每支加水至 5ml, 现用现配 余下的 -20 以下可保存一周 试剂 E 粉剂 *1 支 用时加水至 5ml, 适当加热溶解,4 保

2 存 试剂 F 粉剂 *1 支 用时加水至 10ml, 室温保存 [ 注 1] Buffer G 10ml*1 瓶 用时加水至 25ml,4 保存 试剂 H 粉剂 *3 瓶 用时每支加水至 40ml 溶解, 溶解后 4 避光保存一周 试剂 I 粉剂 *1 瓶 用时每瓶加水至 100ml 溶解, 室温保存 Buffer J 100ml*1 瓶 2.5mol/L 硫酸,4 保存 Buffer K 10ml*1 瓶 10mmol/L 标准磷储备液,4 保存 1μmol/ml 标准磷应用液配制 : 用时将贮备液 10 倍稀释, 即取 1ml 加蒸馏水至 10ml 定磷剂的配制 : 按 H 2O: 试剂 J: 试剂 H: 试剂 I=2:1:1:1 的比例配制, 配好的定磷剂应为浅黄色, 若无 色则试剂失效, 若是蓝色则为磷污染, 定磷剂需现用现配 [ 注 1]: 试剂 F 为过饱和溶液, 所以在配制时最好用 90 ~100 的热蒸馏水 10.3ml( 热胀冷缩 ) 边隔水加 热边用玻璃棒搅拌, 以使其充分溶解 一次实验用不完再用时可能有结晶, 用之前可以再次边隔水加热边用 玻璃棒搅拌使其溶解 [ 注 2]: 配试剂最好用新的烧杯 玻棒和玻璃移液器, 也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染 五 规范操作步骤 : 1 酶促反应: 管号 A 管 B 管 C 管 D 管 E 管 Buffer A(μl) Buffer B(μl) Buffer C(μl) 试剂 D(μl) 试剂 E(μl) 试剂 F(μl) 样本 (μl) 混匀,37 水浴准确反应 10 分钟 Buffer G(μl) 样本 (μl) 100 混匀, 离心 转 / 分 10 分钟, 取上清 100μl 定磷 2 定磷: 管号 标准管 A 管 B 管 C 管 D 管 E 管 1μmol/ml 标准磷应用液 (μl) 100 上清液 (μl) 定磷液 (μl) 混匀,45 水浴 20 分钟, 冷却至室温, 在 660nm 处,1cm 光径, 蒸馏水调零比色 [ 注 1]:A 管为对照管 ;B 管为 + + ATP 酶管 ;C 管为 Mg ++ ATP 酶管 ;D 管为 Ca ++ ATP 酶管 ;E 管为 Ca ++ Mg ++ ATP 酶管 ( 客户可以根据需要选用相应的管号进行实验操作 ) [ 注 2]: 本试剂盒保证做 100 份 A B C D 管 因目前学术界对钙镁 ATPase 能否分开有争议, 如果不 需分开, 即 E 管可以代表 Ca ++ Mg ++ ATP 酶 ; 如果认为可以分开, 即可测 C D 管来代表 Mg ++ ATP 酶和 Ca ++ ATP 酶 六 参考取样量 : 红细胞膜取 100μl,2% 组织细胞膜取 100μl,2% 线粒体取 100μl,2% 微线粒体取 100~200μl 七 如果您的样本很多可以采用简便操作法 :

3 1 测试将 A B C D E 五种混合试剂配制好 : 根据规范操作表中各管的试剂量乘以您所需要测试的样本数 (n) 再放 1~2 只管的量 ( 避免吸到最后试剂量 不够 ), 然后纵向混合 具体配制见下表 : 管号 A 管液体量 B 管液体量 C 管液体量 D 管液体量 E 管液体量 Buffer A(μl) 70 (n+2) 70 (n+2) 50 (n+2) 70 (n+2) 50 (n+2) Buffer B(μl) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) Buffer C(μl) 20 (n+2) 20 (n+2) 试剂 D(μl) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 试剂 E(μl) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 试剂 F(μl) 20 (n+2) 20 (n+2) 20 (n+2) 混合试剂总量 (μl) 130 (n+2) 130 (n+2) 130 (n+2) 130 (n+2) 130 (n+2) 每管应吸液量 (μl) 简化操作步骤: 1 酶促反应 : 管号 (μl) A 管 B 管 C 管 D 管 E 管 A 液 (μl) 130 B 液 (μl) 130 C 液 (μl) 130 D 液 (μl) 130 E 液 (μl) 130 样本 (μl) 混匀,37 水浴准确反应 10 分钟 Buffer G 样本 100 混匀, 离心 转 / 分 10 分钟, 取上清 100μl 定磷 2 定磷 : 标准管 A 管 B 管 C 管 D 管 E 管 1μmol/ml 标准磷应用液 (μl) 100 上清液 (μl) 定磷剂 (μl) 混匀,45 水浴 20 分钟, 冷却至室温, 在 660nm 处,1cm 光径, 蒸馏水调零比色 [ 注 1]:A 管为对照管 ;B 管为 + + ATP 酶管 ;C 管为 Mg ++ ATP 酶管 ;D 管为 Ca ++ ATP 酶管 ;E 管为 Ca ++ Mg ++ ATP 酶管 ( 客户可以根据需要选用相应的管号进行实验操作 ) [ 注 2]: 本试剂盒保证做 100 份 A B C D 管 因目前学术界对钙镁 ATPase 能否分开有争议, 如果不 需分开, 即 E 管可以代表 Ca ++ Mg ++ ATP 酶 ; 如果认为可以分开, 即可测 C D 管来代表 Mg ++ ATP 酶和 Ca ++ ATP 酶 3 按照试验方法学进行蛋白测定 八 计算公式及举例 : 1 定义: 每小时每毫克蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 ATP 酶活力单位 即 μmolpi/mgprot/hour(u/mgprot) 2 计算公式:

4 测定管 OD 对照管 OD 标准品浓度待测样本蛋白浓度 ATPase活力 反应体系中样本稀释倍数 6 * ** 标准管 OD ( 1mol ) mgprot * 反应时间为 10 分钟, 乘以 6 为 1 小时 ** 毫克蛋白 / 毫升 3 计算举例 : 1 取 2% 小鼠心肌细胞膜测 ARPase, 测得各管吸光度值 :A 管为 0.222;B 管为 0.570;C 管为 0.306;D 管 为 0.294;E 管为 0.458; 标准管为 % 小鼠心肌细胞膜的蛋白含量为 0.48mgprot/ml 则计算如下 : ATP酶活力 1μ = =30.0μmolPi/mgprot/hour mgprot Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 86.21=7.241μmolPi/mgprot/hour Ca ++ ATP 酶活力 =( ) 86.21=6.207μmolPi/mgprot/hour Ca ++ Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 86.21=20.34μmolPi/mgprot/hour 2 大鼠心肌中线粒体的 ATPase 测定, 测得各管吸光度值 :A 管为 0.078;B 管为 0.332;C 管为 0.325;D 管为 0.329;E 管为 0.369; 标准管为 线粒体中的蛋白含量为 1.99mgprot/ml 则计算如下 : ATP酶活力 1μ = =4.49μmolPi/mgprot/hour mgprot Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 17.66=4.36μmolPi/mgprot/hour Ca ++ ATP 酶活力 =( ) 17.66=4.43μmolPi/mgprot/hour Ca ++ Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 17.66=5.14μmolPi/mgprot/hour 3 大鼠心肌中微粒体的 ATPase 测定, 测得各管吸光度值 :A 管为 0.062;B 管为 0.330;C 管为 0.346;D 管为 0.340;E 管为 0.363; 标准管为 大鼠心肌微粒体中的蛋白含量为 2.78mgprot/ml 则计算如下 : ATP酶活力 1μ = =3.45μmolPi/mgprot/hour mgprot Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 12.86=3.65μmolPi/mgprot/hour Ca ++ ATP 酶活力 =( ) 12.86=3.57μmolPi/mgprot/hour Ca ++ Mg ++ ATP 酶活力 =( ) 12.86=3.87μmolPi/mgprot/hour 九 正常参考值 : + + ATPase(μ Mg ++ ATPase(μ Ca ++ ATPase(μ 2% 大鼠心肌匀浆 8.50± ± ± % 大鼠肾匀浆 1.09± ± ± % 大鼠肝匀浆 0.76± ± ±0.21 十 注意点 : 1 此法具有微量 灵敏 快速的特点 所以对测定所用试管要求严格, 要没有一点磷, 若试管放过磷酸或 磷酸盐缓冲液, 一定要洗的非常干净, 要先用洗洁精加水煮, 再用自来水冲, 最后用蒸馏水冲干净 最 好用一次性塑料管或新玻璃管, 避免磷污染是检测成败的关键 2 定磷剂配好后, 不可放置太久, 一般保存一天, 最好现用现配, 随时放冰箱 3 最好采用先配 A B C D E 五种混合液中的集中, 然后按简化操作步骤进行检测 这样快捷 准确

5 4 所有配试剂的器皿均要专用, 包括吸硫酸的吸管及盛水的器皿, 最好用新的 5 本试剂盒仅用于科研 凯基相关产品 ( 详见凯基网站

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<4D F736F F D204B B C8E9CBE1CDD1C7E2C3B8A3A84C4448A3A9B2E2CAD4BAD0A3ACD0DEB6A9C8D5C6DAA3BA 乳酸脱氢酶 (LDH) 测试盒 Cat numberkgt02424/kgt02448 Store at -20 for 3 months For Research Use Only( 科研专用 ) 说明书修订日期 2015.07.13 一. 测定原理乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase LDH) 能催化乳酸生成丙酮酸, 丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙,

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