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1 第 33 卷第 4 期 2010 年 8 月 牛蒡子中牛蒡子苷元的分离及结构表征 1, 周渭渭 2, 刘振国 3, 单淇 1, 张新鑫 1, 周鸿 3, 辛宁 2, 侯文彬 1 天津药物研究院, 天津市中药质量控制技术工程实验室, 天津 ; 2 广西中医学院, 广西南宁 ; 3 天津药物研究院药业有限责任公司, 天津 * 摘要目的 : 从牛蒡子中分离纯化出有效成分, 并对其分子结构进行鉴定与表征 方法 : 采用醇提酸解法提取, 分离出粗品, 经过对粗品进行脱脂 结晶处理, 得到无色棱状晶体 采用紫外光谱 (UV) 红外光谱(FTIR) 质谱(MS) 氢谱 (H-NMR) 碳谱(C-NMR) 及单晶衍射对该有效成分进行组成和分子结构的鉴定与表征 结果 : 从牛蒡子粗粉中经提取分离, 得到结晶, 提取率为 4.46%, 显色反应及波谱分析均显示为木脂素类化合物 结论 : 该有效成分鉴定为牛蒡子苷元, 即 (3R,4R)-4-[(3,4- 二甲氧基苯基 ) 甲基 ] 二氢 -3-[(4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 ) 甲基 ]-2(3H)- 呋喃酮, 分子式为 C 21 H 24 O 6 关键词牛蒡子 ; 牛蒡子苷元 ; 分离 ; 结构表征中图分类号 :R284.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2010) Separation and structural characterization of arctigenin in Arctii Fructus ZHOU Wei-wei 1,2, LIU Zhen-guo 3, SHAN Qi 1, ZHANG Xin-xin 1, ZHOU Hong 3, XIN Ning 2, HOU Wen-bin 1 1 Tianjin Engineering Laboratory of Quality Control Techniques for TCM, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin, , China; 2 Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Guangxi , China; 3 Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Responsible Co.Ltd, Tianjin, , China Abstract Objective: To isolate and purify active component from Arctii Fructus and identify and characterize. Methods: The crude product was separated from Arctii Fructus by alcohol extraction and acid hydrolysis. Using recrystallization its structure was method, colorless prismatic crystal was obtained. The composition and molecular structure were characterized by UV, FTIR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, and X-ray analyses. Results: The extracting rate of the crystal gained from the powder of Arctii Fructus was 4.46%. Both color reactions and spectral analyses indicated that the compound was lignan. Conclusion: The active component is characterized as (3R, 4R)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl) methyl] dihydro-3-[(4-hydroxy-3-methoxy phenyl) methyl]-2(3h)-furanone (arctigenin, ARC-G) and the molecular formula is C 21 H 24 O 6. Key words Arctii Fructus; arctigenin; separation; structural characterization 牛蒡子为牛蒡 Arctium lappa L. 的干燥成熟果实, 是著名的传统中药 [1] 全世界共有 10 种, 我国有 2 种 始载于 本草图经 [2] 功能宣散风热 消肿利咽, 用于治疗风热感冒 咽喉肿痛 斑疹不透 痈肿疮毒等症 现代药理学证明牛蒡子还具有抗菌 抗肿瘤 降血糖等功效 [3-4] 值得注意的是, 牛蒡子在各药理研究中起作用的主要成分是牛蒡子苷元 牛蒡子苷在进行动物体内试验 ( 尤其是经口 给药 ) 时表现出活性, 主要是由于牛蒡子苷在消化道中, 在肠菌的作用下转变为苷元的脱甲基化物, 此脱甲基化物在肝脏中的儿茶酚 -O- 甲基转移酶 (COMT) 的作用下恢复为苷元, 苷元被血液输送到各个器官而发挥作用 所以, 可以认为牛蒡子苷元是牛蒡子中的直接有效成分, 而牛蒡子苷是前体物质 [5-7] 本实验采用醇提酸解法, 提取分离出粗品, 经 收稿日期 : 基金项目 : 十一五 国家科技支撑计划资助项目 (2007BAI41B06) 作者简介 : 周渭渭 (1984 ), 男, 陕西省渭南市人, 硕士研究生, 研究方向 : 中药及天然产物的研究 Tel: zww984716@126.com *通讯作者侯文彬 (1969 ), 男, 研究员, 硕士生导师 Tel: houwb@tjipr.com

2 Drug Evaluation Research Vol.33 No.4 August 2010 过脱脂, 然后进行结晶处理, 得到牛蒡子苷元单晶 利用紫外光谱 (UV) 红外光谱(IR) 推断了牛蒡子苷元的母核结构及取代基位置 ; 利用质谱确定出相对分子质量, 推导出分子式 ; 对化合物的 1 H-NMR, 13 C-NMR 核磁信号进行了归属 ; 测定化合物的单晶衍射图谱, 并对其空间结构进行了确定并进行结构验证 1 实验部分 1.1 仪器及材料熔点采用上海科学精密仪器有限公司产 SGW XT-4 型显微熔点仪测定,FTIR 光谱采用 Nicolet FT-IR 红外光谱仪测定,KBr 压片 ;UV 光谱采用日本岛津公司产 UV-3101 型紫外光谱仪测定 ;H-NMR, C-NMR 谱采用 Bruker-AV400 型超导核磁共振仪 ( 瑞士 Bruker 公司 );ESI-MS 谱采用日本岛津公司产 LCMS-2010 型 LC-MS 联用仪测定 ; 单晶衍射谱由 APEXIICCD area detector 型单晶衍射仪测定 实验原料为野生牛蒡子, 购于河北安国药市, 由天津药物研究院周福军副研究员鉴定为 Arctium lappa L., 实验所用试剂均为分析纯 1.2 牛蒡子中牛蒡子苷元的提取 分离和纯化将 5 kg 牛蒡子粗粉用 70% 乙醇溶液回流提取 3 次, 每次 2 h; 提取液加入硫酸调 ph 值至 1~2, 并保持温度 50 下搅拌, 进行酸水解 ; 将水解液先用石油醚萃取 ( 脱脂 )3 次, 再用醋酸乙酯萃取 3 次 ; 醋酸乙酯萃取液用水进行反洗, 蒸干醋酸乙酯层, 甲醇溶解, 以硅藻土拌样 ; 用石油醚回流提取 3 次, 再用醋酸乙酯回流提取 3 次 ; 蒸干醋酸乙酯提取液, 得浸膏 0.63 kg; 浸膏以丙酮结晶, 再反复重结晶, 得牛蒡子苷元纯品 223 g, 收率 4.46% 牛蒡子苷元的结构式见图 1 2 牛蒡子苷元的结构表征 2.1 性状及显色反应 O H 3 CO O HO H 3 CO OCH 3 图 1 牛蒡子苷元的结构式 Fig.1 Structure of arctigenin 牛蒡子苷元为无色透明棱状结晶,mp 89~91 易溶于氯仿 丙酮 甲醇等有机溶剂, 不溶于水 三氯化铁 - 铁氰化钾反应显阳性 ( 蓝色 ), 说明分子内存在酚羟基 ;Molish 反应呈阴性, 说明分子中不含糖 ; 碘化铋钾反应呈阴性, 说明分子中不含氮 2.2 UV 光谱分析 UVλ max (EtOH)nm(1ogε):208( 末端吸收 ), 230(4.47),280(4.08) UV 谱在 220 和 276 nm 处有吸收, 提示该化合物含有芳环结构 2.3 IR 光谱分析 IR(KBr)cm -1 : 3 432(OH),3 000,2 937,2 915, 2 838( 芳环 ),1 765(C=O),1 605,1 516,1 464,1 452 ( 芳环 ),1 156( 内酯 ),1 266,1 238,1 027( 烷基芳香醚 ),813,735,701( 芳环 ) cm -1 峰形强而宽大, 表明羟基存在着分子内或分子间的氢键缔合 ;1 765 cm -1 (νc=o) 处强峰为分子中羰基的特征吸收峰, 由于木脂素母核中存在的内酯环, 氧原子有强的吸电子诱导效应, 使羰基氧上的电子云转向双键中间, 增加了 C=O 键的电子云密度, 导致 C=O 双键性增强, 因而与羰基的特征峰 (1 705~1 725 cm -1 ) 相比, 向高波数方向移动了约 40 cm -1 ; cm -1 ( 芳环骨架 C=C) 处出现了 4 个强弱不等的吸收峰, 为共轭芳环体系存在的重要标志 ; cm -1 为苯环的 (γc-h) 伸缩振动峰 ; cm -1 (γc-h, 面外弯曲振动 ) 处出现较强峰及 701 cm -1 (γc=c 面外弯曲振动 ) 处出现弱峰, 表明分子结构中含有三取代苯环 cm -1 为烷基芳香醚的特征峰 2.4 质谱分析 EI-MS m / z: 在 ESI 负离子模式下, 化合物形成准分子离子峰 [M-H] 为 m / z , 牛蒡子苷元的分子式为 C 21 H 24 O 6, 计算值为 372.4, 二者基本一致 C-NMR 解析及 1 H-NMR 解析 13 C-NMR 谱显示含有 21 个碳原子, 在 δ110~ 149 出现 12 个苯环的碳信号, 在碳谱中 δ , 这些碳信号说明该化合物存在五元内酯环结构 结合 2 个苄基中的亚甲基信号, 和 说明该化合物存在二苄基丁内酯型木脂素基本骨架的信号 该化合物的氢谱在 δ3.78 出现 3 个甲氧基信号, 说明分子中含有 3 个和苯环相连的甲氧基 与牛蒡子苷元的光谱数据对照 [8], 二者完全一致, 数据见表 1

3 第 33 卷第 4 期 2010 年 8 月 表 1 化合物的 1 H-NMR 和 13 C-NMR 数据 ( 1 H-NMR 400 MHz, 13 C-MNR 100 MHz; 溶剂 CDCl 3 ) Table 1 1 H-NMR and 13 C-NMR data of compounds ( 1 H-NMR 400 MHz, 13 C-MNR 100 MHz; CDCl 3 ) 序号 1 H 及 J 序号 13 C 序号 13 C (d,2) (d,7.6) (dd,8,1.6) , 2.88(m) (m) (d,2) (d,8) (dd,8,2) OCH , 2.57(m) OCH (m) OCH , 4.10 (dd) 单晶衍射图谱 晶体结构测定选取尺寸为 0.30 mm 0.26 mm 0.16 mm 的单晶, 用 APEXIICCD area detector 型单晶衍射仪进行检测 测量方法为 φ 扫描, 用 A= nm 的石墨单色化的 MoKa 射线辐射, 在 113(2)K 温度下, 在 θ=2.04 ~27.88,-12 h 12,-13 k 11,-26 L 23 在 θ=2.04 ~27.88, 扫描范围内共收集到 个衍射点, 其中独立衍射点 个, 选择 I>2σ 的 个衍射点, 数据经吸收校正后 R int = , 这些衍射点用于结构测定和修正 氢原子采用各向同性热参数, 其它原子均采用各向异性热参数修正 分析结果表明, 晶体属斜方晶系, 空间群 :P2 (1)2(1)2(1), 晶胞参数 :a= (19)nm; b= (2)nm;c= (4)nm;V= (7)nm 3 ; 晶胞内所含分子数 Z=4; 密度计算值 D c =1.298 g cm -3, 吸收系数 μ=0.095 mm -1 最终收敛偏差因子 R l = ,wR 2 = , 拟合优度 s=1.048, 最终差值 Fourier 图上最高峰值为 : Δ ρ max = e / nm 3, 最高峰值为 Δ ρ min = e/nm 3,W=1/[σ 2 (F 2 o )+( P) P], 其中 P=(F 2 o +2F 2 C )/3 用 SHEIXS97 (sheldriek,1990) 和 SHELXL97(sheldrick,1997) 程序完成晶体结构的解析和结构修正 结构分析牛蒡子苷元单晶的分子结构图见图 2, 键长和键角数据列于表 2, 氢键的键长和键角列于表 3, 晶 胞三维堆积图见图 3 图 2 牛蒡子苷元的 X 射线单晶衍射图 Fig.2 Single-crystal X-ray diffraction analysis of arctigenin 图 3 牛蒡子苷元的晶胞三维堆积图 Fig.3 Three-dimensional packing diagram of arctigenin

4 Drug Evaluation Research Vol.33 No.4 August 2010 表 2 牛蒡子苷元的键长 Table 2 Bond distances for arctigenin 键 L/nm 键 L/nm 键 L/nm O(1)-C(3) 1.371(2) C(5)-C(6) 1.398(3) C(13)-C(14) 1.536(2) O(1)-C(7) 1.431(2) C(5)-H(5) C(13)-H(13) O(2)-C(4) 1.369(2) C(6)-H(6A) C(14)-C(15) 1.506(3) O(2)-C(8) 1.427(2) C(7)-H(7A) C(14)-H(14A) O(3)-C(12) 1.357(2) C(7)-H(7B) C(14)-H(14B) O(3)-C(11) 1.458(2) C(7)-H(7C) C(15)-C(20) 1.388(3) O(4)-C(12) 1.205(2) C(8)-H(8A) C(15)-C(16) 1.401(2) O(5)-C(17) 1.372(2) C(8)-H(8B) C(16)-C(17) 1.381(3) O(5)-C(21) 1.422(2) C(8)-H(8C) C(16)-H(16) O(6)-C(18) 1.366(2) C(9)-C(10) 1.547(2) C(17)-C(18) 1.397(3) O(6)-H(6) 0.89(2) C(9)-H(9A) C(18)-C(19) 1.385(2) C(1)-C(6) 1.387(2) C(9)-H(9B) C(19)-C(20) 1.400(3) C(1)-C(2) 1.402(3) C(10)-C(11) 1.527(3) C(19)-H(19) C(1)-C(9) 1.510(3) C(10)-C(13) 1.541(2) C(20)-H(20) C(2)-C(3) 1.386(3) C(10)-H(10) C(21)-H(21A) C(2)-H(2) C(11)-H(11A) C(21)-H(21B) C(3)-C(4) 1.404(3) C(11)-H(11B) C(21)-H(21C) C(4)-C(5) 1.377(3) C(12)-C(13) 1.507(3) 表 3 牛蒡子苷元的键角 Table 3 Bond angles for arctigenin 键 θ/ ( ) 键 θ/ ( ) 键 θ/ ( ) C(3)-O(1)-C(7) (15) H(8A)-C(8)-H(8B) C(15)-C(14)-C(13) (13) C(4)-O(2)-C(8) (17) O(2)-C(8)-H(8C) C(15)-C(14)-H(14A) C(12)-O(3)-C(11) (15) H(8A)-C(8)-H(8C) C(13)-C(14)-H(14A) C(17)-O(5)-C(21) (15) H(8B)-C(8)-H(8C) C(15)-C(14)-H(14B) C(18)-O(6)-H(6) 111.6(17) C(1)-C(9)-C(10) (14) C(13)-C(14)-H(14B) C(6)-C(1)-C(2) (18) C(1)-C(9)-H(9A) H(14A)-C(14)-H(14B) C(6)-C(1)-C(9) (18) C(10)-C(9)-H(9A) C(20)-C(15)-C(16) (17) C(2)-C(1)-C(9) (16) C(1)-C(9)-H(9B) C(20)-C(15)-C(14) (17) C(3)-C(2)-C(1) (17) C(10)-C(9)-H(9B) C(16)-C(15)-C(14) (17) C(3)-C(2)-H(2) H(9A)-C(9)-H(9B) C(17)-C(16)-C(15) (18) C(1)-C(2)-H(2) C(11)-C(10)-C(13) (15) C(17)-C(16)-H(16) O(1)-C(3)-C(2) (16) C(11)-C(10)-C(9) (14) C(15)-C(16)-H(16) O(1)-C(3)-C(4) (17) C(13)-C(10)-C(9) (16) O(5)-C(17)-C(16) (18) C(2)-C(3)-C(4) (18) C(11)-C(10)-H(10) 108 O(5)-C(17)-C(18) (16) O(2)-C(4)-C(5) (17) C(13)-C(10)-H(10) 108 C(16)-C(17)-C(18) (17) O(2)-C(4)-C(3) (18) C(9)-C(10)-H(10) 108 O(6)-C(18)-C(19) (18) C(5)-C(4)-C(3) (18) O(3)-C(11)-C(10) (14) O(6)-C(18)-C(17) (17) C(4)-C(5)-C(6) (18) O(3)-C(11)-H(11A) C(19)-C(18)-C(17) (17) C(4)-C(5)-H(5) C(10)-C(11)-H(11A) C(18)-C(19)-C(20) (18)

5 第 33 卷第 4 期 2010 年 8 月 ( 续表 3) 键 θ/ ( ) 键 θ/ ( ) 键 θ/ ( ) C(6)-C(5)-H(5) O(3)-C(11)-H(11B) C(18)-C(19)-H(19) C(1)-C(6)-C(5) (19) C(10)-C(11)-H(11B) C(20)-C(19)-H(19) C(1)-C(6)-H(6A) H(11A)-C(11)-H(11B) C(15)-C(20)-C(19) (17) C(5)-C(6)-H(6A) O(4)-C(12)-O(3) (19) C(15)-C(20)-H(20) O(1)-C(7)-H(7A) O(4)-C(12)-C(13) (19) C(19)-C(20)-H(20) O(1)-C(7)-H(7B) O(3)-C(12)-C(13) (15) O(5)-C(21)-H(21A) H(7A)-C(7)-H(7B) C(12)-C(13)-C(14) (14) O(5)-C(21)-H(21B) O(1)-C(7)-H(7C) C(12)-C(13)-C(10) (15) H(21A)-C(21)-H(21B) H(7A)-C(7)-H(7C) C(14)-C(13)-C(10) (15) O(5)-C(21)-H(21C) H(7B)-C(7)-H(7C) C(12)-C(13)-H(13) H(21A)-C(21)-H(21C) O(2)-C(8)-H(8A) C(14)-C(13)-H(13) H(21B)-C(21)-H(21C) O(2)-C(8)-H(8B) C(10)-C(13)-H(13) Table 4 表 4 牛蒡子苷元中的氢键键长和键角 Hydrogen bond distances and angles for arctigenin D-H...A d(d-h)/nm d(h...a) /nm d(d...a) /nm < (DHA) / ( ) O(6)-H(6)...O(1)#1 0.89(2) 2.04(2) (19) 148(2) O(6)-H(6)...O(5) 0.89(2) 2.25(3) 2.681(2) 109.7(18) O(6)-H(6)...O(2)#1 0.89(2) 2.58(2) (19) 132.2(17) 3 讨论 3.1 本实验旨在克服现有技术使用易燃易爆的麻醉剂乙醚, 有害的重金属铅盐的不足 [9], 同时又考虑到经济成本方面, 因而没有选择采用蜗牛酶对牛蒡子苷粗品进行酶解 [10], 而是采用了最简单且方便的方法 酸解, 利用硫酸对牛蒡子乙醇提取液调酸后, 进行酸水解, 从而实现制备抗病毒与抗肿瘤天然药物牛蒡子苷元 3.2 本实验的实用性在于, 酸水解反应将高含量的牛蒡子苷高效率地转化为牛蒡子苷元, 大大增加了从单位质量药材中获得牛蒡子苷元的量, 此方法获得的纯品牛蒡子苷元得率至少比药材中原有量提高了 20 倍 3.3 单晶结构分析不是 万能的 确定分子结构的手段, 尤其是对于天然物等结构比较复杂 主要由 C H N 和 O 等轻原子所组成的有机分子 本试验通过紫外 红外 质谱和核磁等手段来确定分子可靠结构, 然后通过单晶结构分析进行了空间结构验证 参考文献 [1] 中国药典 [S]. 一部 [2] 肖培根. 新编中药志 [M]. 第二卷, 北京 : 化学工业出 版社, [3] 王 潞, 赵 烽, 刘 珂. 牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药 理作用研究进展 [J]. 中草药, 2008, 39 (3): [4] 徐朝晖, 李 婷, 邓 毅, 等. 牛蒡子提取物的降血糖 作用 [J]. 中草药, 2005, 36 (7): [5] Nose M, Fujimoto T, Takeda T, et al. Structural transformation of lignan compounds in rat gastrointestinal tract [J]. Planta Med, 1992, 58: [6] Nose M, Fujimoto T, Nishibe S, et al. Structural transformation of lignan compounds in rat gastrointestinal tract II Serum concentration of lignans and their metabolites [J]. Planta Med, 1993, 59: [7] 刘德茂, 史德胜. HPLC 法测定降糖益肾片中牛蒡 苷.[J]. 现代药物与临床, 2009, 24 (3): [8] Kaoru U, Ariko S, Massanori K, et al. Studies on differentiation-inducers from Arctium Fructus (1) [J]. Chem Pharm Bull, 1993, 41 (10): [9] 肖崇厚. 中药化学 [M]. 上海 : 上海科技出版社, [10] 胡英杰, 樊蕴华, 肖敏勋. 蜗牛酶水解牛蒡子苷制备苷 元的研究 [J]. 广州中医药大学学报, 2004, 21 (6):

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