张莉等 : 牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达 1161 酶 [1] 凝乳酶主要的生物学功能是水解牛乳中 - 酪蛋白的 Phe105-Met106 键, 导致牛乳凝结, 因此被广泛用于干酪制造业传统的凝乳酶通过宰杀未断奶小牛从皱胃中提取目前世界年均约 5000 万头小牛被宰杀供提取凝乳酶

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1 生物工程学报 Chin J Biotech 2009, August 25; 25(8): journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN cjb@im.ac.cn 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 食品生物技术牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达张莉, 姜媛媛, 张健, 杨贞耐中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心, 长春摘要 : 通过 PCR 技术从克隆载体 pmd18t-prochy 上扩增牛凝乳酶原基因, 双酶切后定向插入到酵母表达载体 ppiczaa 中, 构建表达质粒 ppiczaa-prochy, 线性化后电转化毕赤酵母 GS115, 经 PCR 和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达, SDS-PAGE 分析证明重组凝乳酶的分子量约为 37 kd, 培养基上清液中凝乳酶的活性为 12.2 SU/mL 本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶, 在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶, 为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源关键词 : 牛凝乳酶, 分泌表达, 毕赤酵母 Recombinant expression of bovine chymosin in Pichia pastoris Li Zhang, Yuanyuan Jiang, Jian Zhang, and Zhennai Yang Center of Agro-food Technology, Northeast Agricultural Research Center of China, Changchun , China Abstract: To express bovine chymosin in yeast, we amplified the prochymosin gene from the plasmid pmd18t-prochy by PCR, and then cloned the gene into the expression vector ppiczaa, resulting in ppiczaa-prochy. Pichia pastoris GS115 was used as host cells. Integration of the prochymosin cdna into the Pichia pastoris genome was confirmed by PCR and sequencing analysis. Chymosin was expressed in Pichia pastoris successfully, and a strong band at about 37 kd was shown by SDS-PAGE. Activity tests showed that the chymosin activity of the culture supernatant was 12.2 SU/mL. This is the first report of successful expression of chymosin in Pichia pastoris. The recombinant Pichia pastoris strain obtained in this study could be further used to produce recombinant chymosin for cheese making. Keywords: bovine chymosin, secretory expression, Pichia pastoris 凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶, 它可以切断牛乳中的 - 酪蛋白使乳凝固在小牛皱胃中, 凝乳酶通常合成为一个含有 381 个氨基酸的前体聚肽凝乳酶原前体, 凝乳酶原前体在分泌过程中去掉 16 个信号肽形成含有 365 个氨基酸的凝乳酶原凝乳酶原无活性, 它在酸性 ph 下通过多步的自动催化过程, 去掉 N 末端 42 个氨基酸形成有活性的含有 323 个氨基酸的蛋白凝乳 Received: April 20, 2009; Accepted: June 18, 2009 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA10Z306), Jilin Province Science and Technology Development Plan (Nos , ). Corresponding author: Zhennai Yang. Tel: ; Fax: ; zyang@cjaas.com 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(No. 2006AA10Z306), 吉林省科技发展计划项目 (Nos , ), 现代农业产业技术体系建设专项资金 ( 农科教发 [2007]14 号 ) 资助

2 张莉等 : 牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达 1161 酶 [1] 凝乳酶主要的生物学功能是水解牛乳中 - 酪蛋白的 Phe105-Met106 键, 导致牛乳凝结, 因此被广泛用于干酪制造业传统的凝乳酶通过宰杀未断奶小牛从皱胃中提取目前世界年均约 5000 万头小牛被宰杀供提取凝乳酶, 由于全球性的小牛短缺使其来源变得不稳定, 这种传统而昂贵的制法已不能满足世界干酪需求量不断增长的需要利用微生物生物工程技术生产凝乳酶可以获得高纯度的凝乳酶, 生产成本低, 来源稳定目前美国有 70% 英国有 90% 的干酪是用生物工程凝乳酶生产的 [2] Beppu 等在 1983 年首次报道利用 Escherichia coli 生产凝乳酶, 凝乳酶原 cdna 在 E. coli 中表达, 导致无活性的酶以包涵体的形式在细胞内积累通常, 在 E. coli lac 启动子 [3-4] trp 启动子 [2,5] tac 启动子 [4] P R 启动子 pho A 启动子和 T7 启动子的控制下, 凝乳酶以 Met- 凝乳酶原或 N- 末端融合蛋白的形式合成 [6] 一些真核生物, 包括酵母真菌已经用于凝乳酶原和凝乳酶的生产在 Saccharomyces cerevisiae 中, 编码凝乳酶原前体凝乳酶原和凝乳酶的基因在磷酸甘油酸激酶 (pgk) 半乳糖苷酶 (gal 1 和 gal 10) 和磷酸丙糖异构酶 (tpi) 的控制下表达这些蛋白质主要以不溶形式合成, 积累在细胞中难以激活应用酵母分泌信号, 将转录单位整合到酵母基因组和宿主基因组的突变体中, 凝乳酶原的分泌至少增加 80 倍, 可被激活的凝乳酶原产量可达 20 mg/l [7-9] 在 Aspergillus nidulans 中, 凝乳酶在使用源自 A. niger 的葡糖淀粉酶 (gla A) 启动子作用下以活性细胞外酶形式合成, 但凝乳酶产量较低 [10-11] 国内对凝乳酶研究也较早, 1988 年, 谭思元等研究了凝乳酶原 mrna 的分离及其 cdna 的克隆, 成功分离了凝乳酶原 mrna, 并通过拼接 pct 5 及 pct [12] [13-16] 15 获得完整的凝乳酶原基因唐兵等研究了凝乳酶原分子折叠和酶复性, 并通过进一步对大肠杆菌中表达调控的研究, 有效地在大肠杆菌中表达了牛凝乳酶最近冯镇等 1 材料与方法 [17] 乳酸克鲁维酵母中进行了分泌表达克隆了小牛凝乳酶, 并在毕赤酵母表达系统具有表达量高能进行蛋白质翻译后修饰容易大规模生产生产成本低外源蛋白基因遗传稳定性较好等特点, 目前国内外已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性, 获得包括美国 FDA 在内的广泛认可它能够对外源蛋白进行翻译后加工, 使之更接近于天然蛋白的构象和活性, 是一种广泛应用的真核表达系统目前, 在我国尚未见到利用毕赤氏酵母表达牛凝乳酶的报道本研究通过基因工程的方法构建牛凝乳酶毕赤酵母表达系统, 即从小牛皱胃中克隆得到牛凝乳酶基因, 将牛凝乳酶基因与酵母表达载体连接, 并将连接的载体转入毕赤酵母细胞中, 从而表达重组牛凝乳酶 1.1 菌株与质粒 EasySelect Pichia Expression Kit, 吉林省农业科学院李启云博士提供 ; 大肠杆菌 JM109 质粒 pmd18t-prochy, 本实验室保存 1.2 试剂与工程酶 Ex Ta q 聚合酶, pmd18t 试剂盒, DNA Marker DL2000 DL15000, 购自大连宝生物工程公司 ; 限制性内切酶 Xho I Xba I Sac I, DNA 回收试剂盒, T4 DNA 连接酶, 购自 MBI 公司 ; SDS 丙烯酰胺双丙烯酰胺 TEMED 等, 购自 BBI 公司 ; 其他试剂均为分析纯 1.3 仪器与设备 PCR 扩增仪, Eppendorf Mastercycler gradient; 全自动凝胶成像系统, AlphaImager HP; 蛋白电泳系统, Bio-rad Mini-Protean; 电转仪, Bio-rad

3 1162 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2009 Vol.25 No.8 MicroPulser; 台式高速离心机, Eppendorf 5415D; 紫外可见分光光度计, Varian Cary 300; 高速冷冻离心机, Thermo Sorvall Evolution RC 1.4 培养基 LLB YPD MDH MMH BMGY BMMY 培养基的组成和配制参见 Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册 1.5 PCR 扩增目的基因根据对酵母表达载体 ppiczaa 的限制性酶切位点分析, 并参考本实验室已克隆的凝乳酶基因序列 (GenBank Accession No. FJ ), 在基因上下游设计特异引物 ZaAProS 和 ZaAProAS, 序列见表 1, 由上海生工生物工程有限公司合成下划线部分分别是 Xho I 和 Xba I 酶切位点, 上游引物中 AAAAGA 为 ppiczα 系列载体 α 分泌因子的 KEX 2 切割位点表 1 本实验中使用的引物 Table 1 Primers used in this study Primer name Primer sequence (5 3 ) ZaAProS TGCTCGAGAAAAGAGCTGAGATCACCAGG ZaAProAS TGCTCTAGAATGATGGCTTTGGCCAGCC 5 AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3 AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC 以质粒 pmd18t-prochy 为模板, 通过 PCR 扩增得到牛凝乳酶原基因片段 PCR 反应条件 : 94 o C 预变性 5 min; 94 o C 变性 30 s, 52 o C 退火 30 s, 72 o C 延伸 90 s, 32 次循环 ; 72 o C 延伸 10 min 产物用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳进行检测 1.6 酵母表达载体的构建回收 PCR 产物, 用 Xho I 和 Xba I 对回收的 PCR 产物和质粒 ppiczaa 分别进行双酶切将分别回收载体和目的基因的双酶切产物用 T4 DNA 连接酶在 16 o C 下连接, 构建表达载体 ppiczaa-prochy, 将连接产物转化大肠杆菌 JM109, 用 LLB 琼脂平板 ( 含 Zeocin 25 g/ml) 筛选选择阳性克隆, 提取质粒 DNA, 用 Xho I 和 Xba I 双酶切验证后送上海生工生物工程有限公司测序 1.7 电转化毕赤酵母 GS115 使用 Sac I 酶切重组质粒 ppiczαa-prochy 使其线性化 65 o C 加热 20 min 使酶失活制备毕赤酵母 GS115 感受态细胞通过电脉冲法将线性化的质粒转化到毕赤酵母 GS115 中酵母转化株经 YPD 液体培养后提取染色体 DNA, 用 PCR 方法验证目的基因与染色体整合的情况在 MDH 和 MMH 平板筛选出 Mut + 表型重组菌株 1.8 重组酵母的诱导表达将筛选得到的重组酵母 GS115/pPICZaA- Prochy Mut + 接种于含 25 ml BMGY 培养基的三角瓶中, 30 o C 300 r/min 培养 16~18 h, 至 OD 600 达到 2.0~6.0 室温下 3000 g 离心 5 min, 收集菌体, 用约 200 ml BMMY 重悬菌体, 使 OD 600 为 1.0 左右将菌液置于 1 L 的摇瓶中, 用双层纱布或粗棉布封口, 放置于 30 o C 300 r/min 的摇床上进行诱导表达每 24 h 向培养基中添加 100% 甲醇至终浓度为 0.5%, 每隔 24 h 取样检测菌液 OD 600 及菌液上清凝乳酶活力, 实验重复 3 次上清液加入饱和 (NH 4 ) 2 SO 4 至终浓度为 60%, 4 o C 放置过夜 g 离心 10 min, 收集上清蛋白, 真空冷冻干燥后进行 SDS-PAGE(12%) 分析 1.9 重组凝乳酶蛋白活性检测将重组酵母培养液以 3000 r/min 离心 5 min, 取上清液直接用于凝乳酶活性的检测凝乳酶酶活测定方法 : 采用 Arima K 的方法进行凝乳酶活性的测定用 0.01 mol/l CaCl 2 溶液配制 10% 脱脂乳此溶液配制后在室温下放置 40 min 后使用, 取 5 ml 10% 脱脂乳于 35 o C 保温 10 min, 加入适量稀释的酶制剂, 振荡均匀并开始计时, 观察管壁上开始出现凝乳颗粒为终点, 记录凝乳时间 (t) 在上述条件下, 40 min 凝结 1 ml 10% 脱脂乳的酶量

M: DNA marker DL15000; 1: double enzyme digestion products. 2.

4 张莉等 : 牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达 1163 定义为一个 Soxhlet 单位 (SU) 凝乳酶活力 = 实验用乳量 40 凝乳酶量 t 实验重复 3 次, 结果以 3 次重复的平均值表示目的基因片段, 且读码框正确, 表达质粒 ppiczaa- Prochy 构建成功 2 结果与分析 2.1 PCR 扩增目的基因以含有凝乳酶原基因的 pmd18t-prochy 质粒为模板, 经 PCR 扩增得到 1100 bp 左右的片段, PCR 产物回收电泳结果见图 1 图 2 重组表达质粒酶切鉴定图 Fig. 2 Results of recombinant plasmid digested by Xho I and Xba I. M: DNA marker DL15000; 1: double enzyme digestion products. 2.3 电转化毕赤酵母 GS115 用 Sac I 对表达载体 ppiczaa-prochy 进行线性化处理, 用电转化的方式将质粒转入毕赤酵母 GS115, 利用含抗生素 Zeocin 的 YPD 培养基筛选阳性转化子提取重组酵母菌基因组 DNA 作为模板, 利用酵母表达载体通用引物 5 AOX1 3 AOX1 和图 1 牛凝乳酶原基因的克隆 Fig. 1 PCR product of bovine prochymosin gene. M: DNA marker DL2000; 1: prochymosin gene. 2.2 酵母表达载体的构建将 pmd18t-prochy 及表达载体 ppiczaa 经 Xho I 和 Xba I 双酶切, 纯化回收后, 在 T4 DNA 连接酶的作用下于 22 o C 连接, 构建重组表达质粒 ppiczaa-prochy, 转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞, 获得重组菌, 挑取重组菌单克隆, 提取质粒电泳结果如图 2 所示, 表达质粒 ppiczaa-prochy 经 Xho I 和 Xba I 双酶切后出现 2 条带, 其中一条带为载体, 约目的基因特异性引物 ZaAProS ZaAProAS 进行 PCR 鉴定从图 3 可以看出, 使用表达载体通用引物, 阳性重组菌扩增出 1600 bp 左右的片段 ; 使用基因特异性引物, 阳性重组菌扩增出 1100 bp 左右的片段电泳结果显示条带大小与理论值相符, 证明线性化的 ppiczaa-prochy 与酵母菌 GS115 染色体基因组成功重组挑选阳性克隆进行表型鉴定, 结果如图 4 所示, 重组毕赤酵母在 MDH 和 MMH 平板上均能正常生长, 说明挑选的阳性克隆均为 Mut + 表型 3600 bp, 另一条带为所克隆的凝乳酶基因片段, 约 1100 bp 测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有

1164 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech August 25, 2009 Vol.25 No.8 升的趋势, 192 h 酶活达到最高, 为 12.

M: DNA marker DL2000; 1: PCR products with universal primer; 2: PCR products with specific primer. 图 5 重组毕赤酵母 GS115/pPICZaA-Prochy 生长曲线及活力曲线 Fig.

4 重组酵母的诱导表达重组毕赤酵母 GS115/pPICZaA-Prochy 的生长曲线及活力曲线如图 5 所示重组毕赤酵母 GS115/ ppiczaa-prochy 在 24 h 内进入对数生长期, 48 h 以后进入稳定生长期, 菌液 OD 600 维持在 3.

5 1164 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2009 Vol.25 No.8 升的趋势, 192 h 酶活达到最高, 为 12.2 SU/mL 取上清蛋白加入 2 Loading Buffer 蛋白上样液, 95 o C 加热 5 min 后上样 SDS-PAGE 电泳结果如图 6 所示, 从图中可以看出, 在分子量 37 kd 处有明显的条带图 3 转化子的 PCR 鉴定结果 Fig. 3 Identification of transformant by PCR. M: DNA marker DL2000; 1: PCR products with universal primer; 2: PCR products with specific primer. 图 5 重组毕赤酵母 GS115/pPICZaA-Prochy 生长曲线及活力曲线 Fig. 5 Growth and activity curve of recombinant GS115/ ppiczaa-prochy. 图 4 重组毕赤酵母表型鉴定结果 Fig. 4 Mut phenotype identification of recombinant Pichia pastoris GS 重组酵母的诱导表达重组毕赤酵母 GS115/pPICZaA-Prochy 的生长曲线及活力曲线如图 5 所示重组毕赤酵母 GS115/ ppiczaa-prochy 在 24 h 内进入对数生长期, 48 h 以后进入稳定生长期, 菌液 OD 600 维持在 3.0 左右其产酶曲线滞后于生长曲线, 在 144 h 后, 产酶有明显上图 6 重组酵母上清液的 SDS-PAGE 检测 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant yeast supernatants. M: protein marker; 1: induced control yeast supernatant; 2, 3: induced positive recombinant yeast supernatant. 2.5 重组凝乳酶的酶学反应鉴定热失活试验加热可以使牛凝乳酶活性迅速消失将稀释的重组蛋白溶液 65 o C 加热 20 min, 检测活性全部丧失 ( 图 7-5)

6 张莉等 : 牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达 ph 反应试验牛凝乳酶处于碱性条件下 (ph 值大于 9.8), 由于蛋白构象变化造成活性迅速消失将稀释的重组蛋白溶液调 ph 值至 10.0, 反应 20 min, 检测活性全部丧失 ( 图 7-6) 酶抑制反应试验牛凝乳酶属于天冬氨酸蛋白酶, 胃蛋白酶抑制剂 Pepstatin A 可以专一地抑制天冬氨酸蛋白酶的活性在重组牛凝乳酶蛋白溶液中加入 Pepstatin A 至终浓度为 200 μmol/l, 反应 30 min 后, 检测活性完全丧失 ( 图 7-7) 重组凝乳酶的酶学反应鉴定结果如图 7 所示, 未添加凝乳酶的空白脱脂乳溶液未转入凝乳酶基因的空质粒对照均未出现凝乳反应商品凝乳酶和重组凝乳酶在较短时间内出现凝乳反应重组凝乳酶经过热处理碱处理及蛋白酶抑制剂处理后, 其生物活性消失, 充分证明了上清液的活性来源于重组牛凝乳酶胞外, 不但提高表达蛋白的活性, 而且有利于产物的纯化, 非常适宜扩大为工业规模目前, 国内外尚无利用毕赤酵母表达牛凝乳酶的报道国内外学者对生物工程凝乳酶已经进行了多年的研究, 而且应用了不同的载体表达凝乳酶基因, 如大肠杆菌酿酒酵母乳酸克鲁维酵母丝状真菌等但是使用这些载体表达的凝乳酶基因都需要在酸性条件下活化以后, 才能形成有活性的凝乳酶本研究利用 ppiczaa 质粒在毕赤酵母中表达牛凝乳酶, 不需要进一步的体外加工即可获得有活性的凝乳酶产生这种结果的机理可能是由于引物设计中包含了二肽 Lys -Arg, 可以被 KEX 2 基因编码的内切酶作用, 自动切掉 a-factor 前导肽, 从而产生有 [18] 活性的蛋白, 类似假凝乳酶的产生机理本研究成功构建了牛凝乳酶毕赤酵母分泌型表达载体 ppiczaa-prochy, 在毕赤酵母上清液中表达有活性的重组牛凝乳酶, 活性为 12.2 SU/mL 通过酶学实验证明了上清液的活性来源为重组牛凝乳酶本研究获得的重组凝乳酶不需要预酸化激活就可以得到有活性的凝乳酶, 减少了操作步骤, 简化了酶的纯化过程, 降低了凝乳酶生产成本本研究图 7 重组凝乳酶活性检测 Fig. 7 Milk-clotting test of recombinant chymosin. 1: skimmed milk; 2: control yeast; 3: commercial chymosin; 4: recombinant chymosin; 5 7: effects of temperature, ph and inhibitors on the activity of recombinant chymosin. 3 讨论毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前应用最为广泛的酵母表达系统, 其主要的优点有 : 醇氧化酶为可调控的强启动子, 能高密度发酵, 重组蛋白表达量高外源基因整合在酵母基因组上, 可以稳定存在同时, 高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后, 进行翻译后加工处理, 将外源蛋白分泌到细获得的重组毕赤酵母为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源 REFERENCES [1] Newman M, Safro M, Frazao C, et al. X-Ray analyses of aspartic proteinases IV. Structure and refinement at 2.2 Å resolution of bovine chymosin. J Mol Biol, 1991, 221(4): [2] Beppu T. The cloning and expression of chymosin (rennin) genes in microorganisms. Trends Biotechnol, 1983, 1(3): [3] Nishimori K, Shimizu N, Kawaguchi Y, et al. Expression of cloned calf prochymosin cdna under control of the tryptophan promoter. Gene, 1984, 29(1/2): [4] Mccaman MT, Andrews WH, Files JG. Enzymaticproperties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli. J Biotechnol, 1985, 2(3 4):

7 1166 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2009 Vol.25 No.8 [5] Emtage JS, Angal S, Doel MT, et al. Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80(12): [6] Crabbeb SCAM. Chymosin and aspartic proteinases. Food Chem, 1997, 61(4): [7] Mellor J, Dobson MJ, Roberts NA, et al. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1983, 24(1): [8] Goff CG, Moir DT, Kohno T, et al. Expression of calf prochymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1984, 27(1): [9] Moir DT, Davidow LS. Production of proteins by secretion from yeast. Methods Enzymol, 1991, 194: [10] Cullen D, Gray GL, Wilson LJ, et al. Controlled expression and secretion of bovine chymosin in Aspergillus nidulans. Analysis, 1987, 17: 19. [11] Ward M, Wilson LJ, Kodama KH, et al. Improved production of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion. Biotechnology (N Y), 1990, 8(5): [12] Tan SY, Liu NJ, Yang KY. Isolation of mrna coding for prochymosin and identification of its cdna clones in E. coli. Chin J Biotech, 1988, 4(2): 谭思元, 刘年娟, 杨开宇. 凝乳酶原 mrna 的分离及其 CDNA 克隆的鉴定. 生物工程学报, 1988, 4(2): [13] Wang G, Liu NJ, Yang KY. Regulation of the expression of calf prochymosin gene in Escherichia coli. Chin J Biotech, 1994, 10(2): 王革, 刘年娟, 杨开宇. 牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中表达调控的研究. 生物工程学报, 1994, 10(2): [14] Tang B, Yang KY. Research on the functional property of prochymosin disulfide bond Cys45-Cys50. Sci China: Series C, 1997, 27(1): 唐兵, 杨开宇. 凝乳酶原 Cys45-Cys50 二硫键功能的研究. 中国科学 : C 辑, 1997, 27(1): [15] Li HY, Dong YC. Construction, expression and characterization of calf chymosin β-turn mutants. Chin J Biotech, 1998, 14(1): 黎红晔, 董贻诚. 凝乳酶 β- 转角突变体的构建, 表达和性质分析. 生物工程学报, 1998, 14(1): [16] Chen HJ, Pan XF, Zhang GB, et al. Site-directed mutagenesis at disulfide bond Cys206-Cys210 of prochymosin (chymosin). Chin J Biotech, 2001, 17(1): 陈红杰, 潘学峰, 张国宝, 等. 凝乳酶原 ( 凝乳酶 ) 二硫键 Cys206-Cys210 的定位突变. 生物工程学报, 2001, 17(1): [17] Feng Z, Zhang LW. Study on expression of prochymosin in Kluyveromyces lactis and genetic stability. Food Sci, 2008, 29(7): 冯镇, 张兰威. 小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究. 食品科学, 2008, 29(7): [18] Barkholt PV, Asbaek CK, Foltmann B. Investigations on the activation of bovine prochymosin. Eur J Biochem, 1979, 94(2):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌