流感病毒基础知识 流行性感冒病毒简称流感病毒 它分为甲 (A) 乙 (B) 丙 (C) 三型, 近年来才发现的牛流感病毒将归为丁 (D) 型 流感病毒可引起人 禽 猪 马 蝙蝠等多种动物感染和发病, 是人流感 禽流感 猪流感 马流感等人与动物疫病的病原 这些疫病典型的临床症状是急性高热 全身疼痛 显

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1 人感染 H7N9 禽流感 采样以及实验室检测技术 六安市疾病预防控制中心微生物检验科常宏伟

2 流感病毒基础知识 流行性感冒病毒简称流感病毒 它分为甲 (A) 乙 (B) 丙 (C) 三型, 近年来才发现的牛流感病毒将归为丁 (D) 型 流感病毒可引起人 禽 猪 马 蝙蝠等多种动物感染和发病, 是人流感 禽流感 猪流感 马流感等人与动物疫病的病原 这些疫病典型的临床症状是急性高热 全身疼痛 显著乏力和呼吸道症状 流感病毒主要通过空气中的飞沫 易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播 一般秋冬季节是其高发期 人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的, 甲型流感病毒经常发生抗原变异, 可以进一步分为 H1N1 H3N2 H5N1 H7N9 等亚型 流感病毒对外界抵抗力不强 动物流感病毒通常不感染人, 人流感病毒通常不感染动物, 但是猪比较例外 猪既可以感染人流感病毒, 也可以感染禽流感病毒, 但它们主要感染的还是猪流感病毒 少数动物流感病毒适应人后, 可以引起人流感大流行

3 流感病毒 流行性感冒病毒 是一种造成人类及动物患流行性感冒的 RNA 病毒, 在分类学上, 流感病毒属于正黏液病毒科 理化特性 : 对热敏感,56 30min 可灭活 ; 最适 ph 为 7.0~8.0,<3.0 和 >10.0 感染力很快被破坏 ; 对紫外线敏感 ; 对乙醚 氯仿 丙酮等有机溶剂均敏感 禽流感病毒灭活应该是 65 30min, 或者煮沸 100 2min

4 Dliu et al., Lancet, 2013 Gao RB, et al, NEJM,2013 Morens DM et al, NEJM, 2013 Yi Guan et al, Nature, 2013

5 序列测定 PB2 PB1 HA PA NP NA MP NS 6 个内部片段来源于 H9N 年分离 3 株 H7N9 病毒为同一基因类型

6 采样人员 负责人感染 H7N9 禽流感病毒检测样本采集的操作人员必须经过生物安全培训合格, 并具备相应的操作技能 样本采集过程中操作者要加强防护, 应穿戴防护服 眼罩 N95 及以上水平的医用防护口罩 帽子 双层医用乳胶手套 鞋套等个体防护装备

7 标本采集对象 不明原因肺炎病例 同时具备以下 4 条的病例 : 1. 发热 ( 腋下体温 38 ); 2. 具有肺炎的影像学特征 ; 3. 发病早期白细胞总数降低或正常, 或淋巴细胞分类计数减少 ; 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致的肺炎 人感染 H7N9 禽流感疑似病例

8 上呼吸道标本 ( 包括咽拭子 鼻拭子 鼻咽抽取物 咽漱液和鼻洗液 ); 下呼吸道标本 ( 如气管吸取物 肺洗液 肺组织标本 ); 血清标本 ; 样本类型 如病人死亡, 应当尽可能说服家属同意尸检, 及时进行尸体解剖, 采集组织 ( 如肺组织 气管 支气管组织 ) 标本 ; 注 : 应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本 ( 尤其是下呼吸道标本 ) 和发病 7 天内急性期血清以及间隔 2-4 周的恢复期血清 要求 p 呼吸道标本 : 发病早期采样, 每份不少于 3ml p 血清标本每份分为 2 管, 每管不少于 0.5ml

9 样本采集方法 (1) 咽拭子 : 左手用压舌板压住患者舌头, 右手用 2 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁, 应避免接触舌头, 将拭子头浸入含 3ml 采样液的管中, 弃去尾部, 旋紧管盖

10 样本采集方法 (2) 鼻拭子 : 将 1 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处 ( 通常 5cm 以上 ), 停留片刻后缓慢转动退出 ; 取另 1 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔 ; 将上述 2 根拭子浸入同一含 3ml 采样液的管中, 弃去尾部, 旋紧管盖 患儿俯卧抬头, 采集者左手托住患儿的下颌部, 右手持无菌拭子, 将干拭子与上颚平行插入鼻孔 ( 不要向上 ) 直接与鼻咽后壁接触, 深度与到耳导管基本一致, 轻轻旋转 5 秒吸附分泌物, 慢慢移出拭子, 将拭子头浸入采样液中, 弃去尾部

11 样本采集方法 (3) 拭子的要求 : 标本应使用头部为合成纤维的拭子 ( 例如, 聚酯纤维 ) 铝或塑料做柄, 不推荐棉拭子和木柄 标本采集管应包含 3 毫升病毒采样液 ( 含有蛋白质稳定剂, 阻止细菌和真菌生长的抗生素, 缓冲液 ) 采样液中不能加入血清作为蛋白保护剂, 可以加入 BSA 作为蛋白保护剂, 加入 BSA 的采样液应 -20 保存备用 也可加入凝胶 (gelatin) 作为蛋白保护剂 使用商品化的无菌采样液, 在分离病毒时需补加抗生素

12 样本采集方法 (4) 鼻洗液患者取坐姿, 头微后仰, 用移液管将 5 ml 生理盐水注入一侧鼻孔, 嘱患者同时发 K 音以关闭咽腔 然后让患者低头使生理盐水流出, 用平皿或烧杯收集洗液 重复此过程洗两侧鼻孔漱口液用 10 ml 生理盐水漱喉 漱时让患者头部微后仰, 发 噢 声, 让生理盐水在咽部转动 然后, 用 50ml 的无菌螺口塑料管收集洗液 血清标本用真空负压采血管采集血液标本 5ml, 室温静置 30 分钟, 1500~2000rpm 离心 10 分钟, 收集血清于 2ml 无菌螺口塑料管中

13 样本采集方法 (5) 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物 : 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物 先将收集器头部插入鼻腔或气管, 接通负压, 旋转收集器头部并缓慢退出 ; 收集抽取的粘液, 并用采样液 3ml 涮洗收集器 1 次 ( 可用小孩导尿管接在 50ml 注射器上来代替收集 ) 呼吸道灌洗液 : 将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管 ( 约 30cm 深处 ), 注入 5ml 生理盐水, 接通负压, 旋转收集器头部并缓慢退出 ; 收集抽取的粘液, 并用采样液涮洗收集器 1 次 ( 可用小孩导尿管接在 50ml 注射器上来代替收集 )

14 禽流感环境标本采集 采集粪便时一定要采集新鲜的 ( 一般较湿润 ) 粪便, 太陈旧 ( 干燥 ) 的粪便对我们的检测意义不大 ; 在养殖户家中采集粪便标本时, 由于多鸡鸭混养难以分辨鸭粪和鸡粪, 最好能找到鸭子刚排泄的新鲜粪便 ; 采样液中最好已加入抗生素, 否则回实验室要先加入抗生素处理 ;

15 样本的运输 1 病毒培养物按照 A 类感染性物质进行包装运输, 其他感染性物质按照 B 类感染性物质进行包装运输 2 病例的临床标本采集后, 县级疾病预防控制机构和病例收治的医疗机构要密切配合, 按照生物安全的相关规定进行包装, 在 24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测

16 样本的分装与保存 样本的分装 : 采集的呼吸道标本每份分为 3 管, 每管不少于 1ml 血清标本每份分为 2 管, 每管不少于 0.5ml 并填写不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例标本送检单 样本的保存 : 所有呼吸道标本应保存在 4, 并尽快放置在 70 如果没有 70 度冰箱, 标本应保存在 4, 但不超过 24 小时 切勿置于 -20 长期保存 血清样本应置 -20 长期保存 注 : 标本运送期间应避免反复冻融

17 病原学检测 (1) 甲型流感病毒抗原筛查 呼吸道标本甲型流感病毒抗原快速检测阳性 但仅可作为初筛实验 (2) 核酸检测 对患者呼吸道标本采用 real time PCR( 或 RT-PCR) 检测 H7N9 禽流感病毒核酸 (3) 病毒分离 从患者呼吸道标本中分离 H7N9 禽流感病毒 (4) 动态检测双份血清 H7N9 禽流感病毒特异性抗体水平呈 4 倍或以上升高

18 检测策略 不明原因肺炎病例标本检测 : 建议各流感监测网络实验室收到不明原因肺炎标本后, 要在 12 小时内进行标本处理和核酸检测, 同时进行甲型 / 乙型通用引物, 甲型 H1N1 流感, 季节性 H3N2 流感,A(H5) A (H7 和 N9) 亚型流感病毒的检测 如果 H5 或 H7/N9 亚型检测阳性, 在生物安全三级实验室进行流感病毒的分离鉴定, 无病毒分离条件的实验室, 将标本在 24 小时内送国家流感中心进行复核鉴定和病毒分离

19 样品采集 / 接收 对于人禽流感, 咽拭子比鼻拭子检出率高 病毒滴度 : 气管吸取物 > 咽拭子 > 鼻拭子, 粪便中可能可检出 标本送至实验室后, 立即进行处理, 避免反复冻融 将原始标本分为三份, 取一份进行检测, 其余保存在 -70 或 -70 以下, 短时间保存在 4, 不要保存在 -20 在生物安全二级实验室从事相关实验室活动时, 操作者应穿戴眼罩 N95 及以上水平的医学防护口罩 防护服 帽子 双层乳胶手套 鞋套等个体防护装备 ; 实验活动应当有 2 名以上的工作人员共同进行

20 人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及 实验室检测策略 为避免标本反复冻融, 保证标本检测质量, 采集的呼吸道标本每份分为 3 管, 每管不少于 1ml 血清标本每份分为 2 管, 每管不少于 0.5ml 并填写不明原因肺炎病例 / 聚集性病例标本送检表

21 人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及 实验室检测策略 1.h7n9 禽流感病毒实验室活动和样本运输按照 人间传染的病原微生物名录 中高致病性禽流感病毒进行管理 病例的临床标本采集后, 县级疾病预防控制机构和病例收治的医疗机构要密切配合, 按照生物安全的相关规定进行包装, 在 24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测 2. 当地流感监测网络实验室收到标本后 24 小时内, 立即对呼吸道标本开展甲 乙型流感病毒通用引物 h5 h7 亚型的检测 若当地流感监测网络实验室检测结果为 h5 h7 核酸检测阳性时, 应当于 24 小时内将其中 2 管呼吸道相关原始标本分别送省级疾控中心流感网络实验室和国家流感中心 具备相应生物安全条件的网络实验室可开展病毒分离, 并将分离的毒株按要求及时送国家流感中心

22 人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及 实验室检测策略 3. 若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型流感和乙型流感通用引物均阴性时, 应当立即将 1 管原始呼吸道标本送省级疾控中心 省级疾控中心收到标本后, 应当立即对其中 1 管进行 sars 新型冠状病毒等相关病原体的检测, 另 1 管送国家流感中心 4. 当地流感监测网络实验室将采集的血清标本分别送省级疾控中心和国家流感中心开展病原体的抗体检测

23 核酸检测流程 1 样品采集/ 接收 2 核酸提取 3 反应体系配制 4 荧光 PCR 扩增 5 结果判断

24 流感病毒实验室检测 流感病毒核酸检测技术 : l 逆转录 聚合酶链反应 (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) l 巢式 PCR(nested PCR) l 多重 PCR(multiplex PCR) l 实时荧光定量 PCR(realtime PCR) l 环介导逆转录等温核酸扩增技术 (RT-LAMP) l 即依赖核酸序列的扩增技术 (nucleic acid sequence based amplification, NASBA ) l PAN-PCR(Particle-Associated Nucleic Acid PCR)

25 流感病毒实验室检测 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出, 由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃, 而且与常规 PCR 相比, 它具有特异性更强 有效解决 PCR 污染问题 自动化程度高等特点, 其原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法

26 Taqman 原理 Taqman 荧光定量技术是以 Taqman 荧光探针为基础,Taqman 荧光探针为一寡核苷酸, 两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团 探针完整时, 发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5-3 外切酶活性将探针酶切降解, 使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA 链, 就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步, 从而实现定量

27 TaqMan 探针的作用机理

28 Taqman 探针 优点 缺点 1. 灵敏 特异性高 : 每扩增一个特异产物只释放一个分子 的荧光染料, 实时检测特异扩增片断, 非特异产物对检测 信号没有影响, 有效提高检测的专一性 2. 有多种不同波长的荧光基团对可供选择, 可以实现在同一管内检测多重 PCR, 降低成本也提高效率和准确性 3. 避免了荧光染料对 PCR 反应的影响 4. 探针设计有一定难度, 需要验证效果 5. 探针合成质量对试验结果有较大影响 6. 荧光标记成本较高

29 Ct 值 扩增反应中, 当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数, 即 PCR 增长信号与 Threshold 发生交汇的循环数, 也是 FQ-PCR 判断阴阳性和进行定量分析的依据

30 实验操作注意事项 实验室分区 : 样品处理区 PCR 反应制备区 扩增区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 ; 标准品的稀释液中最好含有 Carrier RNA; 移液器使用带滤芯的吸头 ; 加样时, 不能用移液器混匀样品, 应使用涡旋振荡器来混匀 ; 先加阴性对照样, 后加样品, 再加低浓度标准品, 最后加阳性对照 ; PCR 管上不可用记号笔标记 ; PCR 管使用平盖或光膜, 不要裸手触摸光盖或光膜表面 ; PCR 管或 8 联排管要平衡放置 ; 反应后的 PCR 管应当直接废弃, 切不可在实验区域内开启 ; 采用 UNG 防污染系统, 消除前次扩增产物的污染影响

31 结果判断 1. 探针 / 引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线, 应无 CT 值或为 CT 值为零 如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性, 则样品可能已经被污染 那么整个实验过程是无效的, 严格的按照步骤规则重新实验 2. 在 40 个循环之前, 阳性对照反应应出现阳性结果, 且 CT 值在 之间 如果没产生预期的阳性结果则视为无效, 应严格遵照操作程序进行重复实验 确定 PTC 反应失败原因, 订正并记录错误原因及更改方案 不再使用没产生预期结果的 PTC 试剂 3. 当所有对照成立, 检测标本在 35 个循环内出现荧光信号, 则相应引物和探针阳性 ; 若 CT 值在 间, 应重复确认, 如 CT 值还在 40 内可判断为阳性 ;CT 值超过 40, 视该样本为阴性 (A 型引物探针以 35 为阈值, 其他分亚型引物探针以 38 为阈值 )

32 结果判断 4. 所有的临床标本 RNA 检测都必须为阳性, 且 CT 值在 35.0 以内才足可以证明样品的质量是可接受的 如果临床标本 RNA 检测为阴性, 则可能是以下原因 : 4.1 临床样本核酸提取不正确导致 RNA 的丢失或临床标本里存在大量的 RT-PCR 反应抑制剂 4.2 样品中人细胞成分太少, 以至于不能检测到 4.3 反应液配制错误或程序设置错误

33 实验操作注意事项 - 避免污染 应特别注意假阳性产生 推荐以下预防污染的方法 : (a) 实验准备与核酸提取使用独立区域 ; (b) 实验准备与核酸提取使用专用设备 ( 如移液器, 微量离心机 ) 和耗材 ( 如微量离心管, 吸头 ); (c) 实验开始后穿清洁工作服, 并使用新的一次性无粉手套 ; (d) 不同样本操作之间, 以及怀疑可能污染的情况下均更换手套 ; (e) 试剂和反应管的盖子应尽量关闭

34 阳性标本送检要求 p 若当地流感监测网络实验室检测结果为 H7 亚型禽流感病毒核酸阳性时, 应当于 48 小时内将其中 2 管呼吸道相关原始标本送省级疾控中心网络实验室 p 省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验室送检的 H7 和 H5 亚型阳性的呼吸道标本时, 未能开展病毒分离的省级疾控中心网络实验室将阳性病例的原始标本 48 小时内送国家流感中心开展病毒分离 p 各医疗机构采集的双份血清标本 48 小时内送当地流感监测网络实验室, 由当地网络实验室 48 小时内将血清标本分别送省级疾控中心和国家流感中心开展相关抗体检测, 进行病例诊断 p 对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳性标本要求在 48 小时内送至国家流感中心

35 环境标本检测送检要求 p 对人感染 H7N9 禽流感确诊病例可能暴露的禽类饲养或交易等场所, 采集禽类粪便 笼具涂拭标本和环境污水等标本 2 周内开展甲型流感通用引物 H5 H7 和 H9 亚型检测 没有条件开展病毒分离的实验室在 2 周内将阳性标本送国家流感中心 具体技术要求可参考 职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案 (2011 年版 )

36 呼吸道标本无条件开展检测 或甲型抗原检测阳性 24h 内 医疗机构 核酸检测 H7 阳性,48h 内 送当地 CDC 网络实验室, 进一步送省 CDC 疑似病例双份血清样本 H7N9 禽流感病毒实验室检测策略流程图 阴性 甲型快速抗原检测阳性的标本 H5,H7 季节性流感检测 当地 CDC 流感网络实验室 医疗机构未进行过检测的疑似病例标本 24h 内 24h 内 48h 内 甲 乙型通用及 H5,H7 H5/H7 阳性 强化监测采集的 ILI 和 SARI 病例标本 阴性 甲通阳性 H7/H5 阴性 检测结束停止 季节性流感检测 病毒分离 血清 标本 及 医疗 机构 检测 H7 阳性 标本 省级 CDC 实验室 血清 具备条件开展病毒分离 阳性 2 周内完成 未能开展病毒分离 标本 毒株 48h 内 毒株和标本 48h 内 国家流感中心 2 周内完成检测

37 具体方案 l 人感染 H7N9 禽流感疫情防控方案 ( 第 3 版 ) l 人感染 H7N9 禽流感诊疗方案 (2014 年版 ) l 人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及实验室检测策略 l 职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案 (2011 年版 ) l 全国流感监测方案 (2010 年版 )

38

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<C8ABD2B3D5D5C6AC> 附件 新型冠状病毒实验室检测技术指南 为指导全国新型冠状病毒的实验室检测工作, 特制定本指南 一 标本采集 1 采集对象: 新型冠状病毒疑似病例 临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例 ; 其它需要进行新型冠状病毒诊断或排除者 2 标本采集要求 2.1 从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训 ( 培训合格 ) 和具备相应的实验技能 在标本采集过程中, 采样人员可参照人感染高致病禽流感

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