308 华南预防医学 2015 年 8 月第 41 卷第 4 期 timert PCR.ThesensitivityandspecificityoftwocommercialMERS CoVRNAfluorescencequantitative PCRdetectionkitsAandBwereev

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炉岑
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1 307 中东呼吸综合征防控中国首例中东呼吸综合征病例的实验室检测与商品化诊断试剂盒的评价邹丽容 1, 徐静 1,2, 武婕 1, 宋颖超 1, 梁丽君 1, 张欣 1 1,2, 柯昌文摘要目的对广东省首例中东呼吸综合征 (MERS) 病例进行实验室快速诊断, 并比较 2 种不同品牌商品化试剂盒对中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS CoV) 的检测效果方法于 2015 年 5 月 28 日采集首例韩国输入疑似 MERS 病例的 3 份咽试子和 1 份血清样本, 以及陆续采集 50 份密切接触者的咽试子样本, 根据 WHO 和国家 MERS 实验室检测技术指南推荐的荧光定量 PCR 方法, 分别使用针对 upe ORF1a ORF1b3 个目的基因的 3 对引物探针开展检测利用首例 MERS 病例的阳性核酸提取物分别对 A B2 种商品化 MERS CoVRNA 荧光定量 PCR 检测试剂盒的灵敏度和特异度进行评估结果疑似 MERS 病例的 3 份咽拭子样本同时检出 upe ORF1a ORF1b3 个目的基因和 1 份血清样本同时检出 upe ORF1a2 个目的基因, 均证实为 MERS CoV 核酸阳性 A B2 种试剂盒检测病例的 3 份咽拭子样本均为 MERS CoV 核酸阳性, 并能检测到经 10 倍稀释的 MERS CoV 核酸提取物, 但均未能检测出病例血清样本阳性使用国家推荐荧光定量 PCR 方法及 A B2 种商品化试剂盒检测 50 份病例密切接触者的咽拭子样本的 MERS CoV 核酸, 结果均为阴性结论首次对 1 例输入性 MERS 病例进行了实验室快速诊断 ;WHO 和国家 MERS 实验室诊断技术指南中的荧光定量 PCR 的病毒检测方法, 以及 A B2 种商品化试剂盒均可用于 MERS CoV 感染的实验室诊断关键词中东呼吸综合征 ; 冠状病毒 ; 实时逆转录聚合酶链式反应 ; 试剂盒, 诊断中图分类号 :R183.3;R511 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) LaboratorydiagnosisofthefirstimportedcaseofMiddleEastrespiratorysyndromeinChinaand evaluationofcommercialkitsformers CoV ZOULi rong 1,XUJing 1,2,WUJie 1,SONGYing chao 1, LIANGLi jun 1,ZHANGXin 1,KEChang wen 1,2.1.KeyLaboratoryforRepositoryandApplicationofPatho genicmicrobiology,researchcenterforpathogensdetectiontechnologyofemerginginfectiousdiseases, GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou511430,China;2.Southern MedicalUniversity Abstract Objective ToconductrapidlaboratorydiagnosisofthefirstimportedcaseoftheMid dleeastrespiratorysyndromecoronavirus(mers CoV)infectioninGuangdongProvinceandcomparethe testingperformanceoftwocommercialkitsformers CoV.Methods Threepharyngealswabsand1serum samplewerecolectedfromthefirstsuspectedmers CoVinfectioncaseimportedfromtheSouthKoreaon May28,2015.And50pharyngealswabswerecolectedfrom closecontactsinsuccesion.accordingto theguidelinesforlaboratorytestingformers CoVbyWHOandChinaCenterforDiseaseControlandPre vention(ccdc),guangdongprovincialcenterfordiseasecontrolandprevention(gdcdc)hadpre paredthreesetsofprimersandprobesformers CoVupE,ORF1a,andORF1bgenestocaryoutReal DOI: /j.scjpm 作者单位 :1. 广东省疾病预防控制中心, 广东省新发传染病病原学检测技术研究中心, 广东省病原微生物菌毒种保藏和利用医学重点实验室, 广东广州 ;2. 南方医科大学第 1 作者 : 邹丽容徐静同为第 1 作者作者简介 : 邹丽容 (1975 ), 女, 硕士研究生, 副主任技师, 研究方向为呼吸道病毒的监测与研究 ; 徐静 (1989 ), 女, 在读硕士研究生, 研究方向为传染病病原体快速分子诊断方法的建立与评估通讯作者 : 柯昌文,E mail:kecw1965@aliyun.com

2 308 华南预防医学 2015 年 8 月第 41 卷第 4 期 timert PCR.ThesensitivityandspecificityoftwocommercialMERS CoVRNAfluorescencequantitative PCRdetectionkitsAandBwereevaluatedbyusingthepositivenucleicacidextractsofthefirstMERS case,respectively.results ThetargetgenesofupE,ORF1a,andORF1bweredetectablein3throat swabs.andupeandorf1a,intheserumsampleofthesuspectedmerscase.therefore,themers CoV nucleicacidwasconfirmedtobepositive.themers CoVwasfoundtobepositiveinthe3throatswab samplesofthecasedetectedbybothcommercialkitsaandb,whichcanalsodetectedthe10timesdiluted extractednucleicacidofmers CoV.Al50samplesfromtheclosecontactswiththecasewereMERS CoV nucleicacidnegativedetectedbythefluorescencequantitativepcrrecommendedbyccdcandthetwo kitsofaandb.conclusion ThefirstimportedsuspectedMERScasewaspositiveforMERS CoVbyrap idlaboratorydiagnosis.theguidelinesforlaboratorytestingformers CoVandthetwocommercialkits canbeusedaslaboratorydiagnosistoolsofmers CoVinfection. Keywords MiddleEastrespiratorysyndrome; Coronavirus; RealtimeRT PCR; Reagent kits,diagnostic 2012 年 9 月, 沙特阿拉伯国从 2 例急性呼吸系统感染病人体内分离到 1 种新型冠状病毒, 被命名为中东呼吸系统综合征冠状病毒 (MERS CoV), 并归属冠状病毒亚科,β 冠状病毒属 C 组 [1] 此后, 以中东地区为主, 世界 26 个国家和地区出现了暴发或散发中东呼吸系统综合征 (MERS) 流行截止 2015 年 6 月 4 日, 全世界确诊 MERS CoV 感染病例 1179 例, 相关死亡病例 442 例, 病死率约 37.5% [2] MERS CoV 感染后主要表现为持久性发热, 双侧肺炎进行性加重有研究者在不同时间不同地点从骆驼中分离出 MERS CoV 病毒, 并且与人类感染 MERS CoV 病毒相似性达 100%, 从而怀疑骆驼可能为中东呼吸综合征冠状病毒传播宿主 [3-4] 目前沙特阿拉伯国塔卡尔约旦阿拉伯联合酋长国为主要感染国家, 其他如英国法国突尼斯意大利阿曼科威特马来西亚希腊埃及美国也门荷兰黎巴嫩伊朗伊斯兰阿尔及利亚奥地利土耳其德国大韩民国等国家均出现过 MERS CoV 感染病例 [5] 2015 年 5 月 26 日韩国 1 名确诊 MERS CoV 感染病例的密切接触者出现发热症状后仍然出境, 经香港入境我国广东省惠州市, 广东省疾病预防控制中心在 27 日晚接到国家和广东省卫生计生委的通知后, 立即对该入境者进行追踪搜寻, 于 28 日凌晨在 1 家酒店找到该名密切接触者, 并立即将此人转到惠州市人民医院进行隔离, 采样送广东省疾病预防控制中心实验室进行检测诊断本文总结了病例实验室诊断结果, 并使用病例的阳性样本和病例密切接触者的阴性样本对 2 种商品化试剂盒进行初步评估, 为未来有效应对 MERS CoV 感染, 指导临床和疾控机构开展实验室筛查提供依据 1 材料和方法 1.1 样本信息病例样本为 5 月 28 日采集自 1 例疑似 MERS 病例的 3 份咽试子和 1 份血清, 该病例为韩国人, 男性,1971 年出生, 系韩国 MERS 确诊病例的密切接触者 5 月 25 日出现发热症状,5 月 26 日经香港从深圳入境我国, 然后乘大巴到惠州市进行公务活动密切接触者样本为采集自 50 名与病例同机同巴士共同参加会议或共同进餐的乘客司乘人员同事和进餐人员, 以及病例入住酒店和餐馆的服务人员等的咽拭子 1.2 试剂与仪器核酸提取试剂 :QIAampViral RNAMiniKit( 德国 Qiagen 公司 ) 荧光定量 PCR 引物和探针 : 根据 WHO 和国家 MERS CoV 实验室检测技术指南中推荐的 3 套引物探针, 详细序列见表 1 用于检测 MERS CoV 的 upe ORF1a ORF1b3 个目的基因片段 [6-8] 试剂 A 和试剂 B 为 2 种商品化试剂盒, 试剂 A 包括 :MERS CoV 核酸荧光定量 PCR 检测混合液 RT PCR 酶 DEPC H 2 O MERS CoV 内部对照品 MERS CoV 品, 选用 FAM HEX/VIJ/JOE ROX3 个通道检测, 同时检测 2 个目的基因试剂 B 包括 :MERS CoVRT PCR 反应液样本稀释液 Taq 酶反转录酶 MERS MERS,FAM 单通道检测, 仅检测单个目的基因扩增设备使用实时荧光定量 PCR 仪 (ABI7500fast 和 Bio radcfx96, 美国 )

3 309 目的基因引物 / 探针名称序列 (5-3 ) 表 1 MERS CoV 实验室检测引物及探针序列 upe upe Fwd 5 GCAACGCGCGATTCAGTT 3 5 GCCTCTACACGGGACCCATA 3 FAM CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG TAMRA3 ORF1b upe Fwd 5 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 3 5 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 3 5 FAM CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT TAMRA3 ORF1a upe Fwd 5 CCACTACTCCCATTTCGTCAG 3 5 CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGC 3 5 FAM TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT TAMRA 方法样本核酸提取样本为采自疑似 MERS 输入病例的 1 份血清和 3 份咽试子 50 名密切接触者咽拭子样本根据试剂盒说明书, 每份样本取 140μL 提取核酸, 最后溶于 60μL 纯水中, 得到核酸样本提取液核酸稀释对疑似病例咽试子样本核酸提取液进行 10 倍梯度稀释, 共设 5 个梯度 10-1 : 吸取 3μL 核酸提取液加入 27μL 纯水中混匀 ;10-2 : 从 10-1 核酸稀释液中吸取 10μL 至 90μL 纯水中 ; 10-3 : 从 10-2 核酸稀释液中吸取 10μL 至 90μL 纯水中 ;10-4 : 从 10-3 核酸稀释液中吸取 10μL 至 90μL 纯水中 ;10-5 : 从 10-4 核酸稀释液中吸取 10μL 至 90μL 纯水中得到 5 个连续 10 倍稀释的核酸稀释液样本荧光定量 PCR 检测按照中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测指南 ( 中国 CDC) 和试剂盒 A B 说明书进行方法一 : 按中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测指南 ( 中国 CDC) 进行 : 反应体系 :2 RT PCR bufer12.5μl,25 RT PCR enzymemix 1μL, 引物 (10μmol/L) 各 1μL, 探针 (5μmol/L) 1μL, 加水至 20μL 分别加入样本核酸提取液 5μL 反应程序:45 10min, 95 10min,95 15s,60 1min, 共 40 个循环, 60 收集荧光结果判断 : : 无扩增 :CT<35 样本 CT 37 即可判断为阳性 37< CT <40 时需重复测试, 若重测仍为 37<CT<40, 则判为阳性, 否则为阴性方法二 : 根据试剂盒 A B 说明书配反应体系试剂盒 A 结果判断 : 质量控制 : :FAM 通道无扩增或 CT 40,HEX 通道无扩增或 CT 40,ROX 内对照在 25~30 :FAM 通道 CT 35, HEX 通道 CT 35 样本检测时 FAM 通道 CT 38 或 HEX 通道 CT 38 判为阳性 38<CT<40 时复检, 若仍为 38<CT<40, 报告为阴性试剂盒 B 结果判断 : 结果为阴性, CT 30, 样本检测 CT 30, 判为阳性 ;30<CT 35 时复检, 根据复检结果判断阴阳性 ; 若 CT>35, 结果判断为阴性商品化试剂盒的灵敏度和特异度检测灵敏度检测 : 分别用 A B2 种实时荧光定量 PCR 试剂盒对 5 个稀释度的核酸稀释液进行检测, 比较 A B 试剂盒能检测的最低稀释倍数特异度检测 : 选用 50 份密切接触者的咽拭子样本, 使用试剂盒 A B 分别对这 50 份病例密切接触者咽拭子样本进行实时荧光定量 PCR 检测这些样本已经使用国家推荐方法检测结果均为阴性, 且 50 名密切接触者经过最长潜伏期后, 均未出现有关中东呼吸综合征感染症状, 判其为阴性样本 2 结果 2.1 疑似 MERS 输入病例的实验室检测结果根据 WHO 和国家 MERS CoV 实验室检测技术指南对疑似 MERS 输入病例的样本进行实时 PCR 检测, 结果 3 个基因同时检出, 根据指南中的判断标准, 确诊为 MERS CoV 感染病例, 详见表 2 同时采用 A 和

4 310 华南预防医学 2015 年 8 月第 41 卷第 4 期 B2 种不同品牌商品化试剂盒对病例样本进行重复检测, 也证实 MERS CoV 核酸阳性, 结果见表 3 表 2 国家 MERS CoV 检测技术指南中的方法对疑似 MERS 输入病例样本病毒核酸检测结果引物探针咽拭子 1 咽拭子 2 咽拭子 3 血清 ORF1a ND 无扩增 ORF1b 无扩增 26 无扩增 upe 无扩增注 :ND 表示未做表 3 A B2 种商品化试剂盒对疑似 MERS 输入病例样本的检测结果试剂盒荧光通道咽拭子 1 咽拭子 2 咽拭子 3 血清 A FAM 无扩增无扩增 HEX 无扩增无扩增无扩增 B FAM 无扩增无扩增 2.2 商品化试剂盒的灵敏度和特异性评估商品化试剂盒 A 和 B 对病例阳性样本核酸液的稀释液检测结果显示,2 种试剂盒均能检测到 10-1 稀释度的核酸, 灵敏度相近见表 4 按照方法一中国家 MERS CoV 检测技术指南对 50 名病例密切接触者的 50 份咽拭子进行 MERS CoV 核酸检测, 结果均为阴性 ; 同时使用试剂盒 A 和 B 对 50 份样本进行重复检测, 结果也均为阴性表 4 A B2 种商品化试剂盒对病例核酸稀释液的检测结果试剂荧光通道 A FAM 阴性阴性阴性阴性阴性阴性 HEX 阴性阴性阴性阴性阴性 B FAM 阴性阴性阴性阴性 3 讨论 MERS CoV 于 2012 年 9 月在沙特阿拉伯首次被发现后, 该病毒引起的 MERS 病例已出现在全球 26 个国家主要分布在中东地区的阿拉伯半岛国家 : 沙特阿联酋卡塔尔埃及阿曼约旦科威特也门黎巴嫩伊朗等, 非洲欧洲亚洲和美洲的一些国家仅报告了一些旅行相关病例我国一直高度关注该病的流行, 国家疾病预防控中心于 2013 年初举办了专门的实验室检测技术培训班, 并下发了技术指南特异性引物探针等, 为应对可能输入的病例提前做好了技术储备虽然过去 2 年半没有发生输入性 MERS 病例, 但作为省级疾病预防控制中心, 一直储备了包括国家技术指南规定的检测方法所需试剂, 也储备了一些商品化的 MERS CoV 诊断试剂盒, 这些技术储备为应对本次突发输入疫情奠定了基础本文报告了我国首例来自韩国的输入 MERS 病例的实验室检测情况, 并对商品化试剂盒进行了评估, 采用 3 对不同的引物探针, 针对不同目的基因复核检测该病例咽试子样本和血清样本, 咽拭子样本低于血清样本, 说明病人发病早期的鼻咽部等

5 311 呼吸道部位的病毒量高于血液实验室后续对病人进行连续采样检测, 随着发病时间延长, 发现病人血液中的病毒持续存在, 但鼻咽拭子样本中的病毒在发病 5d 后转阴 ( 实验数据未列出 ) 输入病例样本进行检测结果中使用国家推荐检测方法中 ORF1a 和 upe2 种引物探针均可检出发病早期血清中病毒核酸, 相较 A B2 种试剂盒, 国家检测方法具有更高的检出率, 更适用于对临床 MERS CoV 感染样本的检测 A B2 种试剂盒均能检测出发病初期病人咽拭子中的病毒核酸, 特异度相同为 100%, 灵敏度相近, 均可用作 MERS CoV 感染的病例初筛为了尽可能早地发现 MERS CoV 感染病例, 在采集出现临床症状病例的样本时, 应在不同的时段采集病例的多种样本 ; 如果是疑似病例, 应采集以下样本送疾控中心实验室开展检测 : 鼻咽拭子口咽拭子痰血清, 以及粪便或直肠拭子本次输入病例的咽拭子样本 MERS CoV 核酸实时 PCR 检测阴性时, 其痰中的 MERS CoV 核酸实时 PCR 检测仍阳性, 因此在条件允许的情况下应采集病例的下呼吸道样本, 如 : 痰和肺泡灌洗液收集样本时, 采样人员应做好个人防护, 穿戴手套防护服护眼镜和口罩等随着现代分子诊断技术的发展, 检测病原体核酸的实时 PCR 技术越来越普及, 一种新发传染病被证实, 病原体被确认后, 国际组织国家级疾控部门都能及时制定实验室诊断技术指南, 推荐标准的实验室检测流程, 供各级临床和疾控机构实验室开展病例诊断使用新发传染病出现时, 由于其流行病学病理学和临床特征尚不明确, 严重影响公共卫生安全和社会稳定, 一些生物科技公司出于社会责任也会开发相应的商品化试剂盒, 为新发传染病的诊断提供有效的手段本文虽然通过实验室确诊病例的实践证明了技术指南和商品化试剂盒在应对已知新发传染病的实验室诊断方面是可行的, 但仍需要国际和国家专业机构协调制备相应的无感染性的阳性标准物质, 开展实验室能力验证考核等外部质量评价活动, 提高全球公共卫生实验室的诊断能力参考文献 : [1] ZakiAM,vanBoheemenS,BestebroerTM,etal.Isolationofa novelcoronavirusfrom amanwithpneumoniainsaudiarabia [J].NEnglJMed,2012,367(19): [2] WHO.MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus(MERS CoV) RepublicofKorea[EB/OL].[ ].htp:// [3] MadaniTA,AzharEI,Hashem AM.Evidenceforcamel to hu mantransmisionofmerscoronavirus[j].nengljmed,2014, 371(14):1360. [4] MemishZA,CotenM,MeyerB,etal.Humaninfectionwith MERScoronavirusafterexposuretoinfectedcamels,SaudiArabi a,2013[j].emerginfectdis,2014,20(6): [5] 世界卫生组织. 突发事件防范和应对 [EB/OL].[ ].htp:// infections/zh/. [6] CormanVM,EckerleI,BleickerT,etal.Detectionofanovel humancoronavirusbyreal timereverse transcriptionpolymerase chainreaction[j].eurosurveil,2012,17(39): [7] LuX,WhitakerB,SakthivelSK,etal.Real timereversetran scription PCRasaypanelforMiddleEastrespiratorysyndrome coronavirus[j].jclinmicrobiol,2014,52(1): [8] ChanJF,LauSK,ToKK,etal.MiddleEastrespiratorysyn drome coronavirus: another zoonotic betacoronavirus causing SARS likedisease[j].clinmicrobiolrev,2015,28(2): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 袁华晖, 江金女 )

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,