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1 第 8 卷第 期 生命科学研究 灾燥造援员 8 晕燥援 圆园 4 年 4 月 蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Apr. 圆园 4 LAMP 技术在食源性病原微生物检测中的应用 陈传 * 袁凌霄 袁郭震 袁邵筱 袁张如胜 袁魏泉德 (. 广东医学院, 中国广东湛江 540;. 广东医学院第二附属医院, 中国广东湛江 540;. 珠海市疾病预防与控制中心, 中国广东珠海 59000) 摘要院针对常见引起食物中毒细菌的特异保守基因设计环介导恒等温扩增 (LAMP) 引物袁并以此套引物建立食源性病原微生物的检测方法遥特异性及灵敏性试验显示袁 LAMP 法最低检出限为 0-5 袁 Real-time LAMP 最低检出限为 0-7 袁而普通 PCR 的检出下限仅为 0 - 曰且 LAMP 全部反应在 h 内完成曰 LAMP 反应结果可通过肉眼直接观测判定结果遥 LAMP 快速检测常见食物中毒菌的方法初步建立袁同时结合 Real-time LAMP 袁可提供更准确的检测结果并可实现仪器在线式实时监测遥关键词院食源性微生物曰 LAMP 曰奇异变形杆菌曰 Real-time LAMP 中图分类号院 R78. 文献标识码院 A 文章编号院 渊 04 冤 The Application of LAMP Technology in Detection for Forborne Pathogenic Microorganisms CHEN Chuan *,LING Xiao,GUO Zhen,SHAO Xiao, ZHANG Ru-sheng,WEI Quan-de (. Guangdong Medical College, Zhanjiang 540, Guangdong,China;. nd Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 540, Guangdong,China;. Zhuhai Center for Disease Control&Prevention, Zhuhai 59000, Guangdong,China) Abstract:This experiment target gene primers were designed for common food poisoning bacteria, and thus sets the primers create apathogenic microorganism diagnosis technology based on LAMP method. The sensi 原 tivity and specificity of experiments showed that the method had high sensitivity and specificity. The mini 原 mum sensitivity detection limit of LAMP was 0-5,while the lowest detection limit of Real-time LAMP was 0-7.All reactions can be completed within h, and the reaction results can be directly judged by the naked eye observation. Initial method which based on the LAMP for rapid detection of common food poisoning bacteria was established, Real-time LAMP results was more sensitive than LAMP. Key words: forborne microorganisms; oop-mediated isothermal amplification(lamp)technology; Proteus 原 bacillus vulgaris; Real-time LAMP (Life Science Research,04,8():40 耀 44) 食源性病原微生物经常引起食源性疾病, 这类微生物在食品加工生产过程中污染食品或者经由动物宿主传播给人类 如果食用前, 未有效处理被污染的食品, 则易致食源性疾病的爆发 因此, 加强病原微生物在食品加工过程中的控制和检测, 对保障人类健康和食品安全具有十分重要的意义 随着分子生物学和分子化学的发展, 对病原微生物的检测和鉴定不再局限于对其外部形态结构及生理特性等一般检验, 而是从分子生物学水平上研究生物大分子, 特别是核酸结构及特异基因的检验 相对于传统方法,PCR 技术具有特异性好 灵敏度高的特点, 但因 PCR 技术需要高质 收稿日期院 ; 修回日期院 0--7 基金项目院 0 年湛江市科技攻关计划项目 (0C0005) 作者简介院 * 通讯作者 : 陈传 (969 -), 男, 广东茂名电白县人, 实验师, 主要从事病原生物学的研究, chench@gdmc.edu.cn

2 第 期陈传等 :LAMP 技术在食源性病原微生物检测中的应用 4 量模板 DNA, 所需仪器价格昂贵而很难实现现场 [] 应用 Notomi T 等于 000 年建立了一种新型核酸扩增技术 : 环介导恒等温扩增 (oop-mediated isothermal amplification,lamp) 技术 其特点是针对被检测靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物, 在等温条件 (6 益左右 ) 下, 利用链置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 恒等温几十分钟便可完成反应 该技术不需模板的热变性 长时间热循环 繁琐的电泳和紫外观察等过程, 适合在条件较差的实验室 战时野外或现场快速进行病原微生物的检测 LAMP 技术近年来发展迅速, 现已应用于病 [ 耀 5] 毒 微生物等基因水平的检测分析 该方法具有特异性强 灵敏度高 扩增高效 快速简单 鉴定方便等优点 此外, 利用荧光定量 PCR 仪在该技术的基础上加入通用型的荧光染料建立实时定量 LAMP(Real-time LAMP) 技术 该方法的优点是 : 无需另外设计荧光探针 无需特别优化条件 简便易行 成本较低 结果直观 避免人为判断, 特异性 [6] 更强 本研究依据 LAMP 原理, 建立一种快速 有效, 适用于现场 战时野外及基层引起食物中毒常见细菌的检测体系 ; 同时结合 Real-time PCR, 可提供更准确的检测结果并实现仪器在线式实时监测 材料与方法. 材料菌种 : 鼠伤寒沙门菌 (CMCC-505) 伤寒沙门菌 (CMCC-7) 肠炎沙门菌(ATCC-076) 金黄色葡萄球菌标准株 (CMCC-600-5) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 A 菌株 (ATCC-565) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 B 菌株 (ATCC-4458) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 C 菌株 (ATCC-9095) 大肠杆菌 O57:H7(CMCC ) 奇异变形杆菌 (CMCC-49005) 痢疾志贺菌 (CMCC-55) 副溶血性弧菌 (VPL 4-90) 霍乱弧菌(569B) 上述供试菌株均为标准菌株, 购自中国医学微生物菌种保藏管理中心 Bst DNA 聚合酶购自 New England BioLabs 公司 ;Betaine 购自 Sigma 公司,SYBR Green 玉 dntp DNA Marker 00 6 伊 Loding buffer DNA 抽提液等购于宝生物 ( 大连 ) 有限公司. 引物设计本实验针对食物中毒常见的细菌的目的基因设计引物, 每种细菌均设计数对引物, 经实验筛选最佳的引物序列和涉及的目基因 ( 表 ) 所有引 物均由上海英骏生物技术有限公司合成. DNA 模板的制备将菌株划线接种于普通营养琼脂平板上培养 耀 6 h, 在平板上挑取单个菌落加入相应增菌液培养 8 耀 h 取待测样品的增菌液 ml 加到.5 ml 无菌离心管,8 000 r/min 离心 5min, 尽量吸弃上清 ; 加入 50 滋 LDNA 提取液, 混匀后沸水浴 5min, 000 r/min 离心 5min, 吸取上清液保存于 -0 益以待检测 食品 水等相关食源性标本按照 [GB/ ] 方法进行分离 培养后检测.4 扩增反应体系.4. LAMP 反应体系 [7,8] 按文献分别对 Mg + dntps 引物浓度等进化优化 初步确立 LAMP 反应体系为 5 滋 L: 内引物 FIP 和 BIP 各.6 滋 mol/l, 外引物 F 和 B 各 0. 滋 mol/l ( 需要时添加环引物 LF LB 各 0.8 滋 mol/l,.4 mmol/l dntps, mol/l betaine,.6 mmol/l Mg 原 SO 4,8UBst DNA 聚合酶,0 伊 Bst DNA 聚合酶缓冲液.5 滋 L,ddH O 补加至 5 滋 L 反应 0 耀 60 min 进行基因扩增, 在 0 min 时即可检测到核酸, 扩增 60 min 时稳定性和重复性最好, 因此确定反应时间 60 min 混匀后,6 益水浴孵育 60 min,80 益 [] min 灭活酶结束反应.4. Real-time LAMP 反应体系在普通 LAMP 反应的基础上, 加入 000 伊 SYBR Green 玉 滋 L 反应条件:6 益 :40 s,6 益 : 40 s( 收集荧光信号 ),40 个循环 ;80 益 min 灭活酶结束反应.5 特异性和灵敏度分析以变形杆菌为例, 用其引物 ( 上下游引物分别为 F B) 对所有菌株的 DNA 模板进行 LAMP 扩增,% 琼脂糖凝胶电泳检测结果并分析特异性 ; 将待检菌液 ( 变形杆菌 ) 做 0 n 倍稀释, 取各稀释度 DNA 提取液分别进行 LAMP 普通 PCR 和荧光定量 PCR 实验, 验证方法的灵敏度 结果与分析. LAMP 反应扩增结果的判定有 种判定方法 :) 反应液里已加入 MgSO 4, 副产物焦磷酸镁沉淀可肉眼观测, 管内液体浑浊则呈阳性反应, 离心有白色沉淀集于管底, 阴性反应则无此现象 ( 图 A);) 产物中加入 000 伊 SYBR Green 玉 滋 L, 橙红色为阴性反应, 绿色的为阳性反应 ( 图 B);) 电泳检测 : 电压 70 V,% 琼脂糖

3 4 生命科学研究圆园 4 年 Table 表员食源性病原微生物特异性基因的 LAMP 引物表 The specific primers of pathogenic microorganisms for LAMP Bacteria strains Primers Sequence (5 忆 - 忆 ) Gene (accession number) Salmonella F GAACGTGTCGCGGAAGTC inva(dq6446) B CGGCAATAGCGTCACCTT FIP GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG BIP GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA Staphylococcus F GTCAACCAATGACATTCAGAC nuc(v08) aureus B AACTTTAGCCAAGCCTTGA FIP ATGCACTTGCTTCAGGACCACACCTGAAACAAAGCATCC BIP GAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAACGTTTACCATTTTTCCATCAGC E.coli F GTACATTGGCATCGTGTG rfbe(ae00549) 057:H7 B CGAAAACGTGAAATTGCTGA FIP GAGAGGAATTAAGGAATCACCTTGCGACAGGGTAAAAAACTGGC BIP TCTGCGGTCCTAGTTAGAATTGAAACAGTCTTGTACAAGTCCA Proteus F GGTGAGATTTGTATTAATGGGC urer(z875) mirabilis B ATAATCTGGAAGATGACGAGTA FIP TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA BIP TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC Shigella F ATACCGTCTCTGCACGCA ipah(m06) dysenteriae B TCGAAAAGGCCTTCTGATGC FIP GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT BIP TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT LF GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT LB CGCTCACATGGAACAATCTCCGG Vibrio F GGCACAAGCGATGTACTACA tlh(ay57848) parahaemolyticus B GACGCTGCACACTCAGAG FIP GCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC BIP GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC Vibrio cholerae F CGGGTACTAATAATGCATTGA ompw(af00009) B CGATCATAAATACCCAAGGATT FIP GGAACCAGCTATCATTGAGCATATAGTGATTTAAAACTGGACGACT BIP GCTTATGTGTGGTATGCCAATATTGGATTTCAACATCCGTGGATT LF GTTAGCAGCAAGTCCCCATG LB TACAAAGCAGGTGCAGATGC 凝胶电泳约 60 耀 00 min,lamp 电泳结果显示特征性梯状条带 ( 图 C), 最小片段在 80 左右, 如无任何条带则结果为阴性 (A) (B) (C) 图 LAMP 扩增奇异变形杆菌的观察结果渊 A 冤 LAMP 扩增后的肉眼观察图遥 : 阳性扩增结果曰 : 阴性扩增结果遥 (B) 加染料 SYBRGreenI 后的观察图遥 : 阴性扩增结果曰 袁 : 阳性扩增结果曰 (C) 电泳结果图遥 :DNAmarker 曰 : 奇异变形杆菌曰 : 阴性对照遥 (A) 尧 (B) 和 (C) 中阴性对照未加模板遥 Fig. The detection of Proteusmirabilis by LAMP amplification results (A) The Proteusmirabilis LAMPdetectionbynakedeye. : Positiveresults; : Negativeresults.(B) LAMPdetectionof vibrio cholerae added SYBRGreen 玉 dye observed results. : Negative results;, : Positive results; (C) The electrophoresis test results. :DNAmarker;: Proteus mirabilis;:negativecontrol. Negativecontrolsofpicture(A),(B)and(C)werewithouttemplate.

4 第 期 陈 传等 :LAMP 技术在食源性病原微生物检测中的应用 4. LAMP 扩增特异性分析以鼠伤寒沙门菌 (CMCC-505) 伤寒沙门菌 (CMCC-7) 肠炎沙门菌(ATCC-076) 金黄色葡萄球菌标准株 (CMCC-600-5) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 A 菌株 (ATCC-565) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 B 菌株 (ATCC-4458) 金黄色葡萄球菌产肠毒素 C 菌株 (ATCC-9095) 大肠杆菌 O57:H7(CMCC ) 痢疾志贺菌 (CMCC-55) 副溶血性弧菌(VPL 4-90) 霍乱弧菌 (569B) 作为对照 DNA, 利用奇异变形杆菌引物做 LAMP 反应体系, 同时检测对照 DNA 和奇异变形杆菌 (CMCC-49005)DNA, 然后对扩增产物进行电泳分析, 结果显示 : 奇异变形杆菌有 LAMP 特有的阶梯状扩增条带 ( 图 ), 而其他菌株均未见, 表明 LAMP 方法特异性强. LAMP 扩增敏感性分析将 伊 0 的变形杆菌做 0 ~0 0 倍稀释, 分别用 LAMP 法 普通 PCR 法和 Real-timeLAMP 法 ( 上下游引物分别为 F B) 来检测 检测结果显示 : 普通 PCR 在稀释度为 0 - 时就没有扩增产物 ( 图 A), LAMP 为 0-5 ( 图 B), 而 Real-timeLAMP 在稀释度为 0-7 后才不发生反应 ( 图 4) 说明 LAMP 反应敏感性是普通 PCR 的 00 倍,Real-time LAMP 是 LAMP 反应的 00 倍 表明 LAMP 具有较高的敏感性, 结合荧光定量后的 LAMP 敏感性更高 讨论同 PCR 技术一样 LAMP 能够检测整合到样本中的病毒基因序列, 在恒等温条件下, 它在具有链置换活性的 DNA 聚合酶作用下进行核酸扩增, 该技术利用特异的引物只能扩增目的基因的片段具有很高的特异性 虽然 LAMP 技术原理相对比较复杂, 尤其引物设计更需要专业人士设计, 但引物设计可以找专业研究单位或找生物公司来帮忙设计完成, 然而操作对应用人员来说非常的简便, 只需简单的加样, 不需要特别的仪器, 用肉眼就可以判别检测结果 在简陋环境条件下对病原体进行简单快速检测非常重要, 本研究建立了 LAMP 快速简便检测食源性病原微生物的体系, 能在简陋的环境和无特殊仪器设备的条件下 ( 如 : 现场 战时野外或条件较差的实验室等 ) 可以简便 快速 特异 敏感地完成检测任务 另外本研究在 LAMP 技术的基础上加入通用型的荧光染料建立了 Real-timeLAMP, 图 LAMP 扩增特异性分析 院 000 DNA Marker 曰 院奇异变形杆菌曰 耀 4 分别为金黄色葡萄球菌尧金黄色葡萄球菌产肠毒素 A 菌株尧金黄色葡萄球菌产肠毒素 B 菌株尧金黄色葡萄球菌产肠毒素 C 菌株尧鼠伤寒沙门氏菌尧伤寒沙门氏菌尧肠炎沙门氏菌尧痢疾志贺氏杆菌尧大肠杆菌 O57:H7 尧副溶血弧菌尧霍乱弧菌及空白对照遥 Fig. The specificity of LAMP : 000 DNA Marker; : Proteus mirabilis; 耀 4: Staphy 鄄 lococcus aureus, Staphylococcus aureus enterotoxigenic A strains, Staphylococcus aureus enterotoxigenic B strains, Staphylococcus aureus enterotoxigenic C strains, salmonella typhimurium, salmonella typh, salmonella enteritidis, shigella dysenteriae, E.coli O57: H7, vibrio parahaemolyticus, vibrio cholerae, negative control, respectively, and these bacteria were standard strains (A) (B) 图 LAMP 和普通 PCR 扩增变形杆菌的敏感性对比 (A) LAMP 电泳结果 ;(B) 为普通 PCR 电泳结果遥 : 000 DNA marker 曰 : 空白对照曰 耀 : 0 耀 0 0 倍稀释菌液曰 : 阴性对照遥 Fig. The sensitivity of LAMP and PCR (A) LAMP amplification results; (B) Ordinary PCR amplifica 鄄 tion results. : DNA marker; : control; 耀 : The bacterium of Proteus mirabilis diluted 0,0,0,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 0 times, respectively;: negative control. 该技术不仅具有简便 快速 特异 敏感的特点, 而 且还可实现仪器在线式实时监测 LAMP 整个反 应过程, 结果更直观, 无须后处理和电泳检测, 这 也避免了人为因素带来结果判断产生的差异 此 外,Real-timeLAMP 引入熔解曲线使其特异性更强 总之,LAMP 是一种简便 快速 特异 敏感的 基因扩增方法, 且不需要特殊的仪器和设备, 为广 大基层医疗卫生单位 现场和战时野外及时检测 病原微生物提供了可能性, 也为大范围全面开展

5 44 生命科学研究圆园 4 年 Cycle number 图 4 Real-time LAMP 扩增变形杆菌的反应曲线曲线 ~7 对应 DNA 模版的稀释倍数分别为 0 ~0 7 遥 Fig.4 The amplification curve of Proteusmirabilis by Real-time LAMP 耀 7: The bacterium of Proteus mirabilis diluted 0,0,0,0 4,0 5,0 6,0 7. 病原微生物的检测和防控提供了有效的方法 参考文献渊 References 冤院 [] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-me 原 diated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Re 原 search, 000, 8():e6. [] KARGAR M, ASKARI A, DOOSTI A, et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Hepatitis Cvirus[J]. Indian Journal of Virology, 0, ():8-. [] SHAO Y, ZHU S, JIN C, et al. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-rflp(mlamp-rflp) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk[j]. International Journal of Food Microbiology, 0, 48(): [4] BHAT A I, SILJO A, DEESHMA K P. Rapid detection of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum) by loop-mediated isothermal am 原 plification (LAMP)[J]. Journal of Virological Methods, 0, 9(): [5] 彭宜, 谢芝勋, 郭捷, 等. 利用 RT-LAMP 可视化检测技术检 测 H 亚型禽流感病毒及 N N 亚型的分型 [J]. 病毒学报 (PENG Yi, XIE Zhi-xun, GUO Jian, et al. Visual detection of H subtype and identification of N, N subtype of avian in 原 fluenza virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationassay[j].bingduxuebao),0,9():54-6. [6] WANG Q, ZHOU Y, LI S, et al. Real-time fluorescence loop mediated isothermal amplification for the detection of acineto 原 bacter baumannii[j]. PLoS One,0, 8(7):e [7] 陈传, 凌霄, 郭震, 等.LAMP 技术用于霍乱弧菌检测的研究 [J]. 生命科学研究 (CHEN Chuan,LING Xiao,GUO Zhen, et al. Study on the LAMP technology applied to the detection of vibriocholerae[j].lifescienceresearch),0,6(5):4-46 [8] 陈传, 郭震, 张如胜, 等. 环介导等温扩增法在食物中毒快速 检测中的应用 [J]. 实用医技杂志 (CHEN Chuan, GUO Zhen, ZHANG Ru-Sheng, et al. Application of LAMP in food poi 原 soning [J].Journal of Practical Medical Techniques),0,0(): 50-5.

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