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规树秋
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1 中国组织工程研究第 18 卷第 43 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 15, 2014 Vol.18, No.43 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒的制备及其特征高烽, 董勤, 崔杰, 陈培, 王少良 ( 武警上海总队医院肾脏内科, 上海市 ) 文章亮点 : 1 国内外不少研究已表明,CXCR4 在肾癌细胞中存在过度表达, 阻断 CXCR4 的表达可以明显减少肾癌细胞的增殖及转移能力目前抑制基因表达的方法多种多样, 而 mirna 技术是目前较为热门的方法之一, 已被用于多种肿瘤的基因治疗而过去常用的 mirna 载体包括病毒载体脂质体载体等, 不同的载体各有利弊, 如脂质体的传递效率较低, 也易产生炎症反应, 而病毒载体引起机体产生免疫反应的现象则较为突出, 因此寻找一种更为合适的 RNA 传递系统值得研究 2 为延长 CXCR4-miRNA 在体内的作用时间, 并较好地保护其不被酶的破坏, 实验以聚乳酸羟基乙酸为药物载体, 采用二次超声乳化溶剂挥发法制备出了表面光滑分布性好并具有较好包封率及缓释性的聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 为下一步开展纳米微粒抗肾癌的系列研究奠定基础关键词 : 生物材料 ; 纳米材料 ; 聚乳酸羟基乙酸 ;CXCR4;miRNA; 包封率 ; 载药量 ; 缓释微球主题词 : 乳酸 ; 受体,CXCR4; 微 RNAs; 微球体基金资助 : 上海市卫生局青年课题项目 (2011Y126), 项目名称 : 不同载体介导 CXCR4-miRNA 抑制肾癌转移及其机制研究摘要背景 : 有关研究表明聚乳酸羟基乙酸能够有效包裹反义寡核苷酸小的干扰 RNA 微小 RNA 等, 可以较好地保护其在体内不受各种酶的破坏, 并可以起到缓慢释放药物的作用, 从而可以减少药物的给药次数, 达到长期有效的治疗效果目的 : 制备聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 并研究纳米微粒的特性方法 : 运用二次超声乳化溶剂挥发法制备聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 采用紫外分光光度法测定纳米微粒的载药量及包封率, 透射电镜观察微粒形态, 激光粒径仪测定纳米微粒的大小和分布 ; 将纳米微粒悬浮于磷酸盐缓冲液中观察其缓释特性结果与结论 : 制备的纳米微粒形态呈圆形, 表面光滑, 分散性好, 不粘连, 其粒径分布在 nm, 平均粒径为 280 nm, 平均载药量为 (0.515±0.023)%, 平均包封率为 50.2%, 批间差异小纳米微球在体外可以缓慢释放, 经过前几天的快速释放后, 在第 14 天进入平台期结果充分表明运用二次超声乳化溶剂挥发法制备聚乳酸 - 羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒的工艺过程简单, 粒子性状符合要求且具有缓释性高烽, 男,1982 年生, 江苏省启东市人, 汉族,2005 年扬州大学医学院毕业, 主治医师, 主要从事慢性肾脏病诊治及纳米技术在肾脏疾病中的运用研究通讯作者 : 董勤, 主治医师, 武警上海总队医院肾内科, 上海市 doi: /j.issn [ 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2014) 稿件接受 : 高烽, 董勤, 崔杰, 陈培, 王少良. 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒的制备及其特征 [J]. 中国组织工程研究,2014,18(43): Preparation and characterization of poly D,L-lactide-co-glycolide CXCR4-miRNA nanoparticles Gao Feng, Dong Qin, Cui Jie, Chen Pei, Wang Shao-liang (Department of Nephrology, Armed Police Hospital of Shanghai, Shanghai , China) Abstract BACKGROUND: Related studies have showed that poly D,L-lactide-co-glycolide can effectively package antisense oligonucleotides, small interfering RNA, microrna. Poly D,L-lactide-co-glycolide can better protect them against the destruction of the enzymes in vivo and have slow the drug release. Therefore, the number of drug administration can be reduced to achieve a long-term and effective therapeutic effect. OBJECTIVE: To prepare poly D,L-lactide -co-glycolide-cxcr4-mirna-nano-particles and to research the characteristics of the prepared nanoparticles. METHODS: Poly D,L-lactide-co-glycolide-CXCR4-miRNA nanoparticles were prepared by double emulsion-evaporation process. Ultraviolet spectrophotometry was utilized for measurement of encapsulation efficiency and drug-loading rate, observing the shape of nanoparticles by transmission electron microscope, and measuring the size and distribution of nanoparticles by laser particle size analyzer. Sustained-release characteristics of nanoparticle suspension were observed in phosphate buffer. RESULTS AND CONCLUSION: The prepared nanoparticles were spherical-shaped, smooth, evently distributed and inadhesive. The particle size was mainly distributed within nm, with an average diameter of 280 nm. The average drug loading was (0.515±0.023)%, the average encapsulation ratio was 50.2% and difference Gao Feng, Attending physician, Department of Nephrology, Armed Police Hospital of Shanghai, Shanghai , China Corresponding author: Dong Qin, Attending physician, Department of Nephrology, Armed Police Hospital of Shanghai, Shanghai , China Accepted: P.O. Box 10002, Shenyang

2 between batches was small. The nanoparticles could slowly release in vitro and the process initially experienced the fast-release stage, and then reached a basically stable platform stage at day 14. These finding indicate that the process to prepare poly D,L-lactide-co-glycolide CXCR4-miRNA-nanoparticles by double emulsion-evaporation is simple. The prepared nanoparticles are well targeted and exhibit sustained-release effects. Subject headings: lactic acid; receptors, CXCR4; micrornas; microspheres Funding: the Youth Fund of Shanghai Health Bureau, No. 2011Y126 Gao F, Dong Q, Cui J, Chen P, Wang SL. Preparation and characterization of poly D,L-lactide-co-glycolide CXCR4-miRNA nanoparticles. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(43): 引言 Introduction 以白细胞介素 2 和肿瘤坏死因子 α 为基础的免疫治疗是目前进展期肾癌最常用的治疗方式, 但有效率仅 15%-20% 基质细胞衍生因子 1/CXCR4 信号通路是指由基质细胞衍生因子 1 与其特异性受体 CXCR4 相互作用而构成的一个与细胞间信息传递细胞迁移有密切关系的偶联分子对, 其实质在于 CXCR4 对其配体基质细胞衍生因子 1 的高度亲和力和绝对特异性, 即 CXCR4 作为基质细胞衍生因子 1 的专属受体而存在 [1-2] 近几年来国内外有关研究表明,CXCR4 是肿瘤中表达最广泛的受体, 迄今为止已在 23 种不同器官癌症中发现 CXCR4 的表达 [3-6] 肾细胞癌表达 CXCR4 的水平明显高于其他正常组织, 而且其与肾癌细胞的转移凋亡等情况存在密切相关性 CXCR4 的过度表达可以促进肾癌细胞的增殖, 而抑制 CXCR4 的表达则可以起到诱导肾癌细胞凋亡的效果, 并对肾癌的转移起到抑制作用 [7-8] RNA 干扰技术是一种新型的基因治疗技术, 被广泛用于各类肿瘤的治疗研究, 尤其是 mirna 技术是目前最为热门的基因治疗技术之一, 通过与靶 RNA 碱基配对, 可以抑制后者的翻译过程, 从而调控基因的表达国内外研究表明某些 mirna 可以起到靶向调节癌基因的表达, 抑制肿瘤生长和进展的作用, 其作用于肿瘤细胞的增殖和血管生成等多种关键性生物学过程 [9-10] 一种好的 mirna 递送系统需要具备多种能力, 如保护 mirna 不被酶降解, 靶向递送至靶细胞, 增强靶细胞的胞内摄取等随着纳米技术的蓬勃发展, 将纳米技术与基因载药系统相结合, 产生了多种新型的靶向载药系统 [11-13] 纳米载体材料主要包括无机非金属生物降解型高分子和生物大分子等, 而聚乳酸羟基乙酸是近年来发展起来的一种典型的 α- 羟基酸聚合而成的一种无毒无刺激性的完全生物降解性材料聚乳酸羟基乙酸是由乳酸和羟基乙酸按不同比例聚合而成的, 而乳酸是以玉米甘薯大米等物质为原材料发酵而成的聚乳酸羟基乙酸的生物相容性较好, 在体内不引起免疫应答反应, 代谢产物为乳酸与羟基乙酸, 再经三羧酸循环转化成二氧化碳和水或直接排除体外 [14], 对人体完全无毒副作用, 故该物质作为一种安全可靠的聚合物被广泛运用于生物医药领域聚乳酸羟基乙酸在临床中主要运用于下列几个领域 : 手术缝合线的制备, 药物缓释制剂的合成, 骨折固定材料的运用等由于聚乳酸羟基乙酸具有可生物降解的特性, 最早在 1975 年就应用于外科手术缝线的制备, 随着伤口的愈合, 聚乳酸羟基乙酸缓慢降解并被组织吸收, 无需拆线二次手术等, 极大减轻了患者的痛苦目前不少学者正在研究合成具有抗炎作用的聚乳酸, 在手术缝合线中加入抗炎药物来抑制局部炎症反应在骨科领域中, 运用聚乳酸制成的内固定材料正受到广大骨科医生的重视目前骨折患者常常选用金属内固定材料或不可吸收的聚合物复合材料做为骨骼固定件, 在骨折愈合之后尚需进行二次手术取出内固定, 给患者造成了不必要的痛苦和经济负担而聚乳酸制备的内固定材料, 在早期具有较大的初始强度和承载能力, 并在一定时间内能够保持其强度, 然后再逐渐降解, 最后被活性组织吸收, 病患无需再次手术治疗在药物缓释制剂合成方面, 可以说将聚乳酸羟基乙酸作为抗肿瘤药物载体是目前聚乳酸羟基乙酸在药物制剂运用中的热点之一聚乳酸羟基乙酸纳米微粒常见的制备方法包括乳化溶剂挥发法纳米粒沉淀法喷雾干燥法, 每种方法各有利弊 [15-17], 主要根据包裹药物的不同, 所需药物粒径的不同, 从而选择相对合适的制备方法研究表明聚乳酸羟基乙酸纳米载药系统之所以能够加强化疗药物的抗肿瘤效果, 主要集中在以下几个方面 : 首先, 聚乳酸羟基乙酸纳米微粒可以发挥缓释作用, 在体内缓慢释放化疗药物, 从而减少高浓度化疗药物对人体的不良反应, 同时也可以保证化疗药物在体内较长一段时间内维持有效的 [18] 药物浓度, 增加治疗效果 Amjadi 等成功制备了包裹阿霉素的聚乳酸羟基乙酸纳米微粒, 该纳米微粒粒径约 360 nm, 在体外释放实验中, 第 1 天的释放率为 7.91%,20 d 后累积释放率达到 70.98%, 充分证明了聚乳酸羟基乙酸纳米微粒的缓释效果, 避免了阿霉素突释所导致的不良反应其次, 聚乳酸羟基乙酸纳米微粒可以提高肿瘤细胞对化疗药物的摄取量有关研究表明, 与常规使用姜黄素相比, 以聚乳酸羟基乙酸包裹姜黄素可以明显增加人宫颈癌细胞对姜黄素的摄取量, 更好地抑制宫颈癌细胞的增殖, 促进肿瘤细胞的凋亡 [19-20] 第三, 目前不少学者正在研究对聚乳酸羟基乙酸纳米微球表面进行修饰, 增加纳米微球对某些靶细胞的结合力, 或在纳米微粒表明结合某些肿瘤细胞特异性配体, 通过受体 - 配体的特异性结合, 起到主动靶向的抗肿瘤治疗效果 [21-25] 此外, 由于肿瘤组织内的血管与正常组织相比具有形态不规则易渗漏血管扩张有缺损等特点, 导致纳米微粒渗漏后返回血管较慢, 容易在肿瘤组织中聚集, 从而起到了被动靶向的作用本实验采用二次超声乳化溶剂挥发法, 以聚乳酸羟基乙酸为载体, 运 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6991

3 用纳米技术制备聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 同时对该纳米微粒的形态大小粒径分布及体外释放情况进行研究, 为下一步开展纳米微粒抗肾癌的系列研究奠定基础 1 材料和方法 Materials and methods 设计 : 材料观察实验时间及地点 : 实验于 2013 年 1 至 8 月在武警上海总队医院完成材料 : 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒制备及特性实验的试剂与仪器 : 试剂与仪器来源聚乳酸羟基乙酸山东医疗器械研究所 CXCR4 特异性 mirna 序列上海生工生物工程技术服务有限公司二氯甲烷聚乙烯醇上海国药集团化学试剂有限公司透射电镜 Hitachi-6000, 日本日立公司激光粒径仪 LS230 美国贝克曼库尔特仪器公司冷冻高速离心机 Thermo 美国磁力搅拌器威海景达化工机械有限公司紫外分光光度仪上海天美科学仪器有限公司实验方法 : CXCR4-miRNA 纳米复合微粒的制备 : 将 50 mg 聚乳酸羟基乙酸共聚物完全溶解在 2 ml 二氯甲烷中构成有机相, 取适量 CXCR4-miRNA 水溶液为内水相, 在冰水浴中超声下将内水相分散到有机相中形成初乳 (W/O 型 ) 将 3 ml 浓度为 3% 的聚乙烯醇溶液倒入初乳中, 继续超声乳化 3 min 后得到复乳 (W/O/W 型 ), 加入 30 ml 0.3% 聚乙烯醇溶液中,37 水浴下持续搅拌 5 h(400 r/min) 搅拌结束后高速离心 ( r/min), 收集沉淀, 用超纯水洗涤 3 次, 将所得沉淀物冷冻干燥真空干燥灭菌, 即得聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒纳米复合微粒载药量及包封率的测定 : 本实验采用紫外分光光度法测定 CXCR4-miRNA 纳米复合微粒的载药量及包封率取适当稀释的 CXCR4-miRNA 溶液, 在 nm 范围内进行紫外扫描, 在 260 nm 处获得最大吸收峰, 聚乳酸羟基乙酸无干扰精确称取适量冻干 CXCR4-miRNA 纳米复合微粒, 加入氯仿中溶解, 并用 Tris-HCl 缓冲液提取 CXCR4-miRNA, 高速离心 ( r/min) 后, 取上清液, 在 260 nm 处测定吸光度, 计算纳米微粒中 mirna 的含量, 同时计算载药量和包封率载药量 = 纳米微粒中 mirna 的质量 / 纳米微粒的总质量 100% ; 包封率 = 纳米微粒中 mirna 的实际质量 / 所用 mirna 的质量 100% 纳米复合微粒形态粒径及其分布的观察 : 滴一两滴纳米复合微球混悬液于铜网上,2% 磷钨酸溶液染色, 室温 6992 晾干, 于透射电镜下观察纳米微球的形态并拍照, 并通过激光粒径仪测定纳米微粒的大小和分布纳米复合微粒体外释放实验 : 称取适量聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 悬浮于 5 ml 磷酸盐缓冲液中 ( 缓冲液 ph=7.4, 含 0.02%Tween20,0.02%NaN 3 ), 于 37 水浴恒温振荡器上振荡 ( 频率为 100 次 /min) 在设定时间点取出, r/min 离心 10 min, 取上清液, 用上述紫外分光光度法于 260 nm 处检测, 计算释放百分率, 同时补充新鲜溶出介质, 继续释放实验 2 结果 Results 2.1 纳米复合微粒包封率和载药量的测定分别对不同时间制备的 3 批次纳米微球进行 CXCR4-miRNA 含量测定, 其平均载药量为 (0.515±0.023)%, 平均包封率为 50.2%, 批间差异小, 制备工艺简单, 充分说明本方法工艺稳定, 重现性好与国内外其他研究相比 [26-27], 纳米微粒的载药量包封率类似 2.2 纳米微粒的形态粒径和分布观察结果表明, 本实验所制备的纳米微球形态呈圆形, 表面光滑, 分布性好, 微球之间无粘连 ( 图 1A), 其粒径分布在 nm, 平均粒径为 280 nm( 图 1B), 处于纳米水平 2.3 纳米微粒体外释放实验由聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒体外释放实验结果 ( 图 2) 可以看出, 纳米微粒具有缓慢释放 CXCR4 特异性 mirna 的功能, 在经过前几天的快速释放后, 逐渐进入缓释阶段, 在第 14 天进入平台期, 在第 20 天 CXCR4-miRNA 的累积释放率可以达到 82.6% 3 讨论 Discussion 肾细胞癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤, 不少患者在发现时已经出现远处转移, 甚至在部分手术后患者中亦有复发转移的现象发生, 直接影响患者的预后, 因此针对转移性肾癌的研究是目前泌尿系统恶性肿瘤的研究热点之一国内外不少研究已经表明,CXCR4 在肾癌细胞中存在过度表达, 阻断 CXCR4 的表达可以明显减少肾癌细胞的增殖及转移能力目前抑制基因表达的方法多种多样, 而 mirna 技术是目前较为热门的方法之一, 已被用于多种肿瘤的基因治疗而过去常用的 mirna 载体包括病毒载体脂质体载体等, 不同的载体各有利弊, 如脂质体的传递效率较低, 也易产生炎症反应, 而病毒载体引起机体产生免疫反应的现象则较为突出, 因此寻找一种更为合适的 RNA 传递系统值得研究随着纳米技术的蓬勃发展, 将其与生物医学相结合, 对医学界各方各面都产生了巨大的影响, 特别是在肿瘤的基因治疗方面, 纳米载体的出现越来越受到广大医务工作者的重视 [28-29] 这些纳米载体多具有携带药物剂量较大生物相容性好药物缓释性强在人体内可降解成无害物质等多方面的优点, 受到国内外学者的一 P.O. Box 10002, Shenyang

A B 粒径 (µm) 图 1 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒 Figure 1 Poly D,L-lactide-co-glycolide-CXCR4-miRNA nanoparticles 图注 : 图中 A 为纳米微粒透射电镜图片 ( 40 000), 纳米微球形态呈圆形, 表面光滑, 分布性好, 微球之间无粘连 ;B 为纳米微粒的粒径分布, 其粒径分布在 143-502

4 A B 粒径 (µm) 图 1 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒 Figure 1 Poly D,L-lactide-co-glycolide-CXCR4-miRNA nanoparticles 图注 : 图中 A 为纳米微粒透射电镜图片 ( ), 纳米微球形态呈圆形, 表面光滑, 分布性好, 微球之间无粘连 ;B 为纳米微粒的粒径分布, 其粒径分布在 nm, 平均粒径为 280 nm, 处于纳米水平累计释放量 (%) 释药天数 (d) 图 2 聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米粒体外释放实验 Figure 2 Cumulative release in vitro of poly D,L-lactide-coglycolide-CXCR4-miRNA nanoparticles 图注 : 纳米微粒具有缓慢释放 CXCR4 特异性 mirna 的功能, 在经过前几天的快速释放后, 逐渐进入缓释阶段, 在第 14 天进入平台期, 在第 20 天 CXCR4-miRNA 的累积释放率可以达到 82.6% 致认可 [30-31] 聚乳酸羟基乙酸是目前临床运用较多的纳米材料 [32-33], 有关研究表明聚乳酸羟基乙酸能够有效包裹反义寡核苷酸 sirna mirna 等, 可以较好保护其在体内不受各种酶的破坏, 并可以起到缓慢释放药物的作用, 可以减少药物的给药次数, 达到长期有效的治疗效果 [34-35], 已被美国食品药品监督管理局批准可广泛在医疗材料方面使用聚乳酸羟基乙酸微球的制备常常采用乳化溶剂挥发法纳米粒沉淀法和喷雾干燥法等, 根据溶剂去除工艺又可分成超声乳化溶剂挥发法和乳化溶剂萃取法, 按照操作过程又可分为连续干燥法间歇干燥法和复乳法, 前二者应用 O/W 型 W/O 型或 O/O 型乳状液 [36], 复乳法则应用 W/O/W 型或 O/W/O 型复乳, 具体制备的方法通常需要根据药物和载体的性质临床要求产品成本等来进行选择, 而本试验采用的 W/O/W 型乳化溶剂挥发法更适宜制备包裹 mirna 的药物微球, 其优点是工艺简单重复性好众所周知, 理想的纳米微球应具有下列优点 : 含药量和包封率高, 最终制剂的流动性好, 分散性佳, 具有生物可降解性, 在血中滞留时间长等优点本实验采用二次超声乳化溶剂挥发法成功制备了聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米微粒, 该微粒具有上述的较多优点, 纳米微粒表面光滑, 分布均匀, 不粘连, 粒径分布范围窄, 批间差异小等, 而且制作工艺简单, 容易批量生产超声乳化溶剂挥发法制备微球时最常用的挥发溶剂为二氯甲烷, 其在水中溶解度约为 2%, 在微球制备过程中可使聚合物在 O/W 界面迅速沉积, 对乳滴成囊具有重要作用同时聚乳酸羟基乙酸在二氯甲烷中具有较大的溶解度, 可以较好地制备有机相亲水性乳化剂对维持 O/W 乳状液的稳定性及除去挥发性有机相后所得微球是否满意均有重大作用, 本试验选用聚乙烯醇作为乳化剂有关研究表明在制备纳米微粒过程中, 聚乙烯醇具有降低表面张力乳化成乳助悬的作用, 而且能够增加水相黏度, 对于形成之中和形成之后的粒子微球具有助悬稳定的作用 [37] 一定浓度的聚乙烯醇水溶液具有一定的黏度, 能够使微球在逐渐固化过程中充分混悬, 防止微粒沉积粘连但聚乙烯醇浓度过低可能导致聚乳酸无法成球, 而浓度过高则会导致微粒粒径过大, 圆整度不够等问题, 对于聚乙烯醇浓度的选择非常重要因此本实验分别使用 3% 和 0.3% 的聚乙烯醇作为分散介质, 根据要求分阶段进行分散, 从而获得了满意的纳米微粒纳米微粒的载药量和包封率是检验微粒的两个重要指标, 载药量表示的是单位质量内所含药物的多少, 而包封率则是指包封在纳米微粒中的药物与所用的药物质量之比, 通常情况下载药量与包封率越高越好载药量越高可以减少载体的需要量, 提高组织对药物的摄入, 包封率越高, 体系中游离的药物就越少, 制备过程中药物的利用度越高影响微粒的载药量与包封率的因素较多, 主要包括药物敷料比聚乳酸羟基乙酸浓度聚乙烯醇溶度油水比例搅拌温度聚合物分子量和组成等本实验中由于聚乳酸羟基乙酸较易获得, 价格便宜, 而 CXCR4-miRNA 质量较小, 较难提高载药量且其价格较贵, 所以虽然本试验获得的药物载药量较低, 主要是希望提高包封率, 减少 CXCR4-miRNA 用量, 且不影响 CXCR4-miRNA 的实际治 [38] 疗效果, 这与郑延波等的相关研究结果类似聚乳酸羟基乙酸作为药物载体, 对药物的包封率及微球粒径都具有一定的作用针对聚乳酸羟基乙酸的研究表明, 微球制备 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6993

5 中聚乳酸羟基乙酸含量越大, 所得药物的包封率越高, 但聚乳酸羟基乙酸的黏稠性较大, 如浓度过大则会影响纳米微粒的粒径而且本实验发现, 由于聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米粒的载药量偏低 (0.515±0.023)%, 如过多使用聚乳酸羟基乙酸虽然可以提高包封率, 但是必然会导致载药量的进一步下降, 不利于纳米微粒用于抗肾癌的进一步研究此外, 纳米微球的外观形态粒径大小也是考察纳米微粒工艺的一个重要指标, 而且可以影响最后药物的使用情况和二氯甲烷的残留量等本实验制备的纳米微粒表面光滑, 呈圆形, 分散性好, 不粘连, 可以保证药物的流动性, 不易于在体内聚集, 不会导致血管堵塞等不良事件的发生, 而且纳米微粒粒径分布在 nm, 平均粒径为 280 nm, 完全可以静脉注射使用, 制备的纳米微粒粒径大小与 Amjadi 等制备的微粒相似纳米微粒粒径的选择主要根据给药途径和降解时间来定, 一般情况下, 静脉给药的微粒最好为纳米级, 皮下给药的微粒多为微米级聚乳酸羟基乙酸纳米微球的缓释性是提高其抗肿瘤效果的关键环节之一, 在经过早期的突释阶段后, 纳米微粒缓慢进入一个稳定的释放期, 从而实现长期有效的抗肿瘤效果突释现象是目前药物制备行业中的难题之一, 对于减少突释现象的研究较多, 但尚没有一种方法可以很好的解决这一问题突释现象的产生是由通过吸附或以弱键结合在纳米微粒表面的药物溶解或解吸附而导致的早期药物突然大量释放的情况 [39], 这种现象常常发生在纳米药物释放的前 24 h 内突释量的多少与纳米微粒表面吸附及近表面孔道中存在的药物比例有关, 微粒的表面积与体积比例越大, 突释的严重程度将相应增加此外, 由于纳米微粒对药物不能完全包裹, 有些药物松散地吸附在纳米微球表面也是造成突释量增高的重要原因之一为减少药物的不良反应, 延长药物的作用时间, 一般情况下需要控制突释量在一个合适的程度突释量过大可能导致较大的药物不良反应, 减少药物作用时间, 但早期药物的释放量过小也可能不能在体内快速达到有效药物浓度, 因此药物具体释放情况应该根据所用药物的要求来决定通常情况下, 在微球制备过程中, 乳滴随溶剂的挥发逐渐固化成微球, 溶剂从乳滴的内部向外迁移时, 同时携带着药物从微球内部向 O/W 界面移动, 使药物在微球的表面或表面浅层富集, 造成初始释放较高, 药物在微球中的分布状态可直接影响微球释放特性, 减少表面吸附或降低表面浅层的药量是减少突释的重要途径药物从聚乳酸羟基乙酸微球中的释放过程主要有以下几个途径 [40-41] : 以弱键结合在纳米微粒表面的药物出现解吸附, 从而释放到周围组织 ; 药物通过微球中的孔道向外扩散 ; 通过水溶解聚合物载体导致药物释放 ; 聚合物微球表面或本体蚀解, 导致药物释放在微球实际释放药物的过程中, 上述几种途径可能按顺序逐步进行, 也可能同时进行, 这主要是由微球不同的载药量微球粒径释药期和聚合物分子量等参数来决定微球中药物释放是通过扩散作用进行的, 因此 6994 微球内部与外部介质之间药物溶度梯度起到了主要的作用, 梯度越大释放药物的速度越快同时介质对药物的溶解度也可直接影响药物的扩散速度, 从而影响微球释放速率从体外释放实验中可以看出本实验制备的纳米微粒具有较好的缓释性, 在经过早期的快速释放后, 缓慢进入一个稳定的平台期在平台期,CXCR4-miRNA 的释放主要通过两个途径 : 一是通过纳米微球中的孔径逐步扩散 ; 二是聚乳酸羟基乙酸缓慢溶解导致药物稳定释出, 整个过程主要由聚乳酸羟基乙酸的水解溶蚀降解和药物的扩散来控制, 从而达到缓慢释放药物的作用, 避免了 CXCR4-miRNA 快速释放而导致药物有效时间缩短的现象发生, 从而起到减少给药次数, 延长药物作用时间的效果本实验成功制备了聚乳酸羟基乙酸 CXCR4-miRNA 纳米粒, 该纳米微粒具有分布性好, 不粘连等优点, 为下一步纳米微粒的抗肾癌研究打下了基础但不难发现, 纳米微粒作为基因治疗的载体, 固然具有较多的优点, 如缓释安全无毒保护基因片段不被破坏等, 但纳米微粒也存在载药量偏低内含体逃逸缺陷等问题在今后的研究中还将继续进行聚乳酸羟基乙酸微球的结构修饰及使用聚酰胺 - 胺型树枝状分子等物质作为载体的研究, 以期待克服上述缺陷作者贡献 : 第一二作者为实验设计者, 第三作者为实验评估者, 第四五作者为实验实施者, 第一作者成文, 第二作者审校利益冲突 : 文章及内容不涉及相关利益冲突伦理要求 : 实验未涉及与伦理冲突的内容学术术语 :mirna- 是一类大小为 22 个核苷酸左右的非编码 RNA, 其对真核细胞的增殖发育凋亡基因表达等多个方面具有调控的作用国内外研究表明部分 mirna 可以起到靶向调节癌基因的表达, 可作用于肿瘤细胞的增殖和血管生成等多种关键性生物学过程作者声明 : 文章为原创作品, 无抄袭剽窃, 无泄密及署名和专利争议, 内容及数据真实, 文责自负 4 参考文献 References [1] Wei F,Moore DC,Li Y,et al.attenuation of osteoarthritis via blockade of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway.arthritis Res Ther.2012;14(4):R177. [2] Bikash D,Shili X,Fedora G,et al.small Molecule Inhibitors of CXCR4.Theranostics.2013;3(1): [3] Jin F,Brockmeier U,Otterbach F,et al.new insight into the SDF-1/CXCR4 axis in a breast carcinoma model: hypoxia-induced endothelial SDF-1 and tumor cell CXCR4 are required for tumor cell intravasation.mol Cancer Res. 2012;10(8): [4] Heckmann D,Maier P,Laufs S,et al.the disparate twins: a comparative study of CXCR4 and CXCR7 in SDF-1α-induced gene expression, invasion and chemosensitivity of colon cancer.clin Cancer Res.2014;20(3): [5] Sekuła M,Miekus K,Majka M.Downregulation of the CXCR4 receptor inhibits cervical carcinoma metastatic behavior in vitro and in vivo.int J Oncol.2014;44(6): P.O. Box 10002, Shenyang

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Microsoft Word - 7469-7474张斌6.0最终版.DOC 中国组织工程研究第 17 卷第 42 期 2013 10 15 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 15, 2013 Vol.17, No.42 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.020 [http://www.crter.org] 张斌, 王兵济, 李