150 中华临床医师杂志 ( 电子版 )015 年 6 月第 9 卷第 11 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),June 1,015,Vol.9,No.11 BMP- and FGF- at proper concentrations may displ
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1 中华临床医师杂志 ( 电子版 )015 年 6 月第 9 卷第 11 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),June 1,015,Vol.9,No 骨形成蛋白 - 成纤维细胞生长因子 - 对大鼠触须毛乳头细胞增殖和毛发诱导能力的影响 基础论著 郝建春 1 刘玮 袁小英 马慧敏 3 赵艳爽 摘要 目的探讨骨形成蛋白 -(BMP-), 成纤维细胞生长因子 -(FGF-) 单独及联合作用对毛乳头细胞增殖和毛发诱导能力的影响 方法采用显微机械法分离大鼠触须毛乳头并培养, 行免疫荧光鉴定 CCK-8 法检测毛乳头细胞的增殖活性 毛发诱导能力通过检测碱性磷酸酶 (ALP) 活性确定 采用 ELISA 法检测胰岛素样生长因子 -1(IGF-1) 的含量 结果毛乳头细胞的 ALP 免疫荧光染色阳性, 确定培养的细胞是毛乳头细胞 BMP- 对毛乳头细胞增殖无影响, 但可提高毛乳头细胞的 ALP 活性并呈剂量依赖性 FGF- 促进毛乳头细胞增殖, 但会降低毛乳头细胞的 ALP 活性并呈剂量依赖性 联合 BMP- 和 FGF- 既可以促进毛乳头细胞的增殖, 又可以增强 ALP 活性, 并呈时间依赖性 BMP- 可上调毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 的含量, 并呈剂量依赖性 结论 BMP- 可能通过促进毛乳头细胞分泌 IGF-1 以保持毛乳头细胞的毛发诱导能力, 按适当浓度比例联合 BMP- 和 FGF- 可形成互补作用, 既促进毛乳头细胞的增殖, 又可以保持其毛发诱导能力 关键词 成纤维细胞生长因子 ; 胰岛素样生长因子 Ⅰ; 碱性磷酸酶 ; 毛乳头细胞 ; 骨形成蛋白 - The effect of BMP- and FGF- on the proliferation and hair inductivity of dermal papilla cells Hao Jianchun 1, Liu Wei, Yuan Xiaoying, Ma Huimin 3, Zhao Yanshuang. 1 Department of Dermatology, Chuiyangliu Hospital, Beijing 1000, China; Department of Dermatology, General Hospital of the Air Force PLA, Beijing 10014, China; 3 Department of Dermatology, Electric Power Hospital, Beijing , China Correspondence author: Liu Wei, lw5811@aliyun.com Abstract Objective To investigate the effects of bone morphogenetic protein- (BMP-), fibroblast growth factor- (FGF-) and the combination of BMP- and FGF- on the proliferation and hair inductivity of dermal papilla (DP) cells. Methods Microdissection was employed to isolate rat DP. Identification of cultured DP cells was completed by immunofluore scence staining of alkaline phosphatase (ALP). The proliferative activity of DP cells was determined by cell counting Kit-8 (CCK-8). The hair inductivity of DP cells was determined by ALP activity assay kit using microplate reader. IGF-I was assayed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results DP cells were isolated and cultivated successfully as confirmed by cellular positive staining of ALP. BMP- stimulation showed no effects on DP cells proliferation but increased ALP activity of DP cells in a dose-dependent manner, while FGF- promoted DP cells proliferation but decreased ALP activity of DP cells. Combined stimulation of BMP- and FGF- not only promoted DP cells proliferation but also enhanced ALP activity time-dependently. BMP- upregulated the level of IGF-1 in culture supernates of DP cells in a dose-dependent way. Conclusion BMP- may maintain hair inductivity of DP cells by upregulating IGF-1, and combination of DOI: /cma.j.issn 作者单位 :1000 北京市垂杨柳医院皮肤科 1 ;10014 北京, 空军总医院皮肤科 3 ; 北京电力医院皮肤科 通讯作者 : 刘玮, lw5811@aliyun.com
2 150 中华临床医师杂志 ( 电子版 )015 年 6 月第 9 卷第 11 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),June 1,015,Vol.9,No.11 BMP- and FGF- at proper concentrations may display a mutual complement effect on the proliferation and hair inductivity of cultured DP cells. Key words Fibroblast growth factor ; Insulin-Like growth factor I; Alkaline phosphatase; Dermal papilla cell; Bone morphogenetic protein- 毛乳头细胞 (dermal papilla cell,dpc) 作为毛 囊的真皮组分, 在其复杂的信号联系中起着主导作用, 调节着毛囊的形成 生长发育和周期性生长 但体外培养的毛乳头细胞生长缓慢, 并且其毛发诱导能力也会随着传代次数增多而下降, 这大大限制了毛囊再生的相关研究及临床应用 因毛乳头细胞的生长和毛发诱导能力有赖于所处环境中各种分子的调控, 故推测在体外培养体系中, 外源补给这些因子或增强它们的内源产生有助于促进毛乳头细胞的生长及其毛发诱导能力的保持 本研究拟探讨骨形成蛋白 -(bone morphogenetic proteins-, BMP-) 和成纤维细胞生长因子 -(fibroblast growth factor-,fgf-) 单独及联合作用对毛乳头细胞增殖和毛发诱导能力的影响以及 BMP- 是否通过胰岛素样生长因子 -1(insulin-like growth factor-1, IGF-1) 促进毛发再生 材料与方法 一 材料 1. 标本来源 : 雄性 SD 大鼠 (3~6 月龄 ), 解放军第 304 医院动物实验中心提供. 试剂 :DMEM 培养基 胎牛血清购自澳大利亚 PAA, 小鼠抗碱性磷酸酶 (ALP) 抗体购自美国 Santa Cruz, 山羊血清 FITC 标记的山羊抗小鼠抗体购自北京康为生物技术有限公司,CCK-8 试剂购自日本同仁株式会社,ALP 测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司, 大鼠 IGF-1 ELISA 试剂盒购自美国 R&D, 重组人 BMP- 购自南京金斯瑞生物技术有限公司, 大鼠 FGF- 购自美国 Peprotech 二 方法 1. 大鼠触须毛乳头细胞体外培养 : 采用显微机 [1-] 械分离法分离大鼠触须毛乳头组织 组织块培养法进行毛乳头细胞的原代培养, 即将 8~10 个已分离好的毛乳头置于 35 mm 培养皿中, 内含 1 ml 的 DMEM 和 0% 胎牛血清, 于 37 5% CO 细胞培养箱中培养, 待细胞达到亚融合状态后进行传代. 体外培养毛乳头细胞的鉴定 : 制作大鼠毛乳头细胞和人成纤维细胞 ( 皮肤标本来源于 1 例 6 岁健康男孩包皮环切术切除的包皮 ) 的细胞爬片之 后,0.1% Triton X-100 于室温下透膜 15 min,pbs 漂洗 5 min,37 下,10% 山羊血清封闭盖玻片 90 min, 弃山羊血清, 加入 1 00 小鼠单克隆抗大鼠 ALP 抗体,4 过夜, 对照采用空白对照,PBS 漂洗 3 次, 加入 FITC 标记的山羊抗小鼠二抗,1 50, 室温, 避光, 孵育 1 h, 弃二抗,PBS 漂洗 3 次, 95% 甘油封片 3. 实验分组 : 取 4~6 代毛乳头细胞作为研究对象, 以 个 / 孔接种到 96 孔板中, 每列接种 5 个孔, 放入 37 5% CO 细胞培养箱中培养细胞 1 d 待毛乳头细胞完全贴壁后, 无血清培养基饥饿 4 h BMP- 组分别加入终浓度为 ng/ml 的 BMP-, 内含 3% FBS;FGF- 组分别加入终浓度为 ng/ml 的 FGF-, 内含 3% FBS; 联合组加入 100 ng/ml BMP- 和 10 ng/ml FGF-, 内含 3% FBS, 对照组无 BMP- 和 FGF- 添加 4. 毛乳头细胞增殖活性的检测 : 细胞制备及处理如上述,BMP- 组和 FGF- 组在 48 h 后, 弃各孔的培养液 ; 联合组及对照组分别在 h 后, 弃各孔的培养液, 按 CCK-8 试剂盒说明进行操作 ; 酶联免疫检测仪上选择 450 nm 波长, 读取每孔 OD 值并记录 5. 毛乳头细胞 ALP 活性的检测 : 细胞制备及处理如上述,BMP- 组和 FGF- 组在 48 h 后, 弃各孔的培养液 ; 联合组及对照组分别在 h 后, 弃各孔的培养液 ; 按 ALP 活性测试盒说明进行操作 ; 酶联免疫检测仪上选择 490 nm 波长, 读取每孔 OD 值并记录 6. 毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 含量的检测 : 细胞制备如上述, 每列 3 个孔 ; 饥饿 4 h 后加入无血清的不同浓度 BMP-: ng/ml; 96 h 后, 收集各组细胞培养上清液 ; 离心上清液, r/min,5 min, 以去除颗粒物 上清液中 IGF-1 含量的检测按照试剂盒说明书操作 三 统计学分析数据以均数 ± 标准差 ( x ± s ) 表示, 采用 SPSS 17.0 软件进行分析, 联合组及其对照组采用重复测量方差分析和多重变量方差分析, 其余各组两两之间采用单因素方差分析, 以 P<0.05 有统计学意义
3 中华临床医师杂志 ( 电子版 )015 年 6 月第 9 卷第 11 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),June 1,015,Vol.9,No 结果一 毛乳头细胞分离培养及鉴定结果刚分离出的毛乳头呈梨形, 结构较为密实, 周围有膜包绕, 大小与毛囊大小和触须粗细有关 ( 图 1) 在组织块培养的第 5 天, 可看到细胞的游出, 第 14 天细胞达到亚融合状态 毛乳头细胞集落呈现出特征性的聚集性生长, 集落中央细胞呈多角扁平状, 并聚集成多层, 集落外层细胞呈梭状, 类似皮肤成纤维细胞, 但长轴较短 ( 图 ) 细胞爬片经免疫荧光染色后, 毛乳头细胞的荧光染色结果阳性, 而空白对照和人皮肤成纤维细胞的荧光染色结果阴性 ( 图 3) 二 毛乳头细胞增殖活性检测结果经统计学分析后表明, 与对照组相比,BMP- 对毛乳头细胞增殖无影响 ( 表 1),FGF- 可以促进毛乳头细胞增殖, 并且呈浓度依赖性 ( 表 ),100 ng/ml BMP- 和 10 ng/ml FGF- 的联合组也可以促进毛乳头细胞增殖, 并且呈时间依赖性 ( 表 3) 表 1 BMP- 组毛乳头细胞增殖活性和 ALP 活性检测结果 (OD 值, x ± s ) BMP- 浓度 CCK-8 ALP 活性 0 ng/ml ± ± ng/ml ± ±0.011 a 100 ng/ml 0.79 ± ±0.09 a 00 ng/ml ± ±0.017 a 表 FGF- 组毛乳头细胞增殖活性和 ALP 活性检测结果 (OD 值, x ± s ) FGF- 浓度 CCK-8 ALP 活性 0 ng/ml ± ± ng/ml 0.86 ± ±0.011 a 10 ng/ml ±0.013 a 0.0 4±0.058 a 0 ng/ml ±0.011 a ±0.094 a 三 毛乳头细胞 ALP 活性的检测结果经统计学分析后表明, 与对照组相比,BMP- 可促进毛乳头细胞 ALP 活性, 并呈浓度依赖性 ( 表 1), 但 ALP 活性的增加趋势随着 BMP- 浓度的增加而趋缓,FGF- 则降低毛乳头细胞的 ALP 活性, 也呈浓度依赖性 ( 表 ), 而 100 ng/ml BMP- 和 10 ng/ml FGF- 的联合组可以提高毛乳头细胞的 ALP 活性, 且呈时间依赖性 ( 表 4) 四 毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 水平的检测结果 ELISA 法测得不同浓度 BMP- 处理后的毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 的含量 ( 表 5), 经统计学分析后表明, 毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 的水平随着 BMP- 浓度的增加而增加 (P<0.05) 表 5 毛乳头细胞培养上清液中 IGF-1 的含量 (ng/ml, x ± s ) BMP- 浓度 IGF-1 含量 0 ng/ml ± ng/ml ± ng/ml ±0.846 a 00 ng/ml ±1.18 a 讨论 ALP 是一类分子量为 56 kda 的二聚体蛋白, 可以使底物去磷酸化, 它在毛乳头细胞内高度表达, 已被广泛认为是毛乳头细胞的鉴定指标之一 [3-4] 本次培养细胞的 ALP 免疫荧光染色结果阳性, 而与之对照的空白对照和人成纤维细胞的染色结果为阴性, 故可以确定培养的细胞是毛乳头细胞 除此之外, 在体外培养毛乳头细胞的不断传代过程中,ALP 的活性会伴随着毛发诱导能力下降而下降 [3],ALP 活性的保持有助于毛乳头细胞毛发诱导能力的保持 [4-5], 故 ALP 的活性也是毛乳头细胞毛发诱导能力的评价指标之一 本次研究中,BMP- 可以提高 表 3 联合组与对照组毛乳头细胞增殖活性检测结果 (OD 值, x ± s ) 组别 第 0 天 第 天 第 4 天 第 6 天 对照组 ± ± ± ±0.06 联合组 ± ±0.011 a ±0.03 a ±0.047 a 注 : 与对照组相比, a P<0.05 表 4 联合组与对照组毛乳头细胞 ALP 活性检测结果 (OD 值, x ± s ) 组别 第 0 天 第 天 第 4 天 第 5 天 对照组 ± ± ± ±0.01 联合组 ± ± ±0.017 a ±0.01 a 注 : 与对照组相比, a P<0.05
4 15 中华临床医师杂志 ( 电子版 )015 年 6 月第 9 卷第 11 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),June 1,015,Vol.9,No.11 毛乳头细胞的 ALP 活性, 这与成骨细胞 骨髓间充质细胞和成纤维细胞相关研究结果一致 [6-8] ALP 活性的提高指示着毛乳头细胞毛发诱导能力的提高, 故可以认为 BMP- 可以保持毛乳头细胞的毛发诱导能力, 但我们也发现,BMP- 对毛乳头细胞的增殖活性并没有影响 同时,FGF- 可以促进毛乳头细胞的增殖, 但却减弱 ALP 的活性, 这也与其他一些细胞的相关研究结果一致 [6,8-9], 故 FGF- 促进了毛乳头增殖的同时却抑制了毛乳头细胞的毛发诱导能力 体外培养的毛乳头细胞不仅有数量上的要求, 还需要保持其毛发诱导的能力,BMP- 和 FGF- 的单独作用都难以符合这个要求, 故我们设想在毛乳头细胞的体外培养体系中, 加入合适浓度比例的 BMP- 和 FGF-, 既可以利用 BMP- 保持毛乳头细胞的毛发诱导能力, 又可以利用 FGF- 促进毛乳头细胞增殖, 同时, 二者不适合毛乳头细胞培养的劣势也可以互相弥补, 最终达到二者优缺互补的目的 在本次研究中, 我们发现联合 100 ng/ml BMP- 和 10 ng/ml FGF-, 既可以促进毛乳头细胞的增殖, 又能保持毛乳头细胞的毛发诱导能力, 二者可以形成互补关系 毛乳头细胞可以分泌 IGF-1, 有实验证实, 促进毛乳头细胞分泌 IGF-1 可以达到促进毛发生长的目的 [10-1] 有研究称 Laron 综合征患者体内 IGF-1 生成不足, 他们通常表现为少发, 前额脱发 [13] 本 次研究发现, 在毛乳头细胞的体外培养体系中加入 BMP-, 可以促进毛乳头细胞分泌 IGF-1, 故推测 BMP- 可能通过促进毛乳头细胞分泌 IGF-1 以保持毛乳头细胞的毛发诱导能力 此外,BMP- 增强毛乳头细胞 ALP 活性的同时, 促进 IGF-1 的表达, 二者又均与毛乳头细胞的毛发诱导能力有关, 故也推测二者在毛囊毛发再生机制中可能存在着联系 综上, 在毛囊内, 毛乳头处于一个信号联系相当复杂的微环境内,BMP- FGF- 和 IGF-1 都是其微环境内的分子, 故本次研究通过外源添加 BMP- 和 FGF-, 促进毛乳头细胞内源产生 IGF-1, 从而实现体外培养大量具有毛发诱导能力的毛乳头细胞 参考文献 [1] Jahoda C, Oliver RF. The growth of vibrissa dermal papilla cells in vitro[j]. Br J Dermatol, 1981, 105(6): [] Inamatsu M, Matsuzaki T, Iwanari H, et al. Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin[j]. J Invest Dermatol, 1998, 111(5): [3] Yang CC, Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells[j]. J Dermatol Sci, 010, 57(1): -11. [4] Rendl M, Polak L, Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties[j]. Genes Dev, 008, (4): [5] Chermnykh ES, Vorotelyak EA, Gnedeva KY, et al. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture[j]. Histochem Cell Biol, 010, 133(5): [6] Hughes-Fulford M, Li CF. The role of FGF- and BMP- in regulation of gene induction, cell proliferation and mineralization[j].
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