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1 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 第 47 卷第 5 期 2018 年 9 月两亲性光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌的抗菌机理收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ꎬU ꎬ ). 刘大锋 1ꎬ2 ꎬ 袁彩 3 ꎬ 陈静怡 3 ꎬ 陈卓 2 2ꎬ3 ꎬ 黄明东 (1. 福建农林大学生命科学学院 ꎻ2. 中国科学院福建物质结构研究所结构化学国家重点实验室 ꎻ3. 福州大学化学学院 ꎬ 福建福州 ) 摘要 : 测定了光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌分别被大肠杆菌 ( ATCC25922) 和金黄色葡萄球菌 ( ATCC6538) 吸附的量对其表面电荷和细胞壁的影响 ꎬ 以及与两种消毒剂 ( 聚六亚甲基双胍盐酸盐和过氧化氢 ) 的联合抑菌作用 ꎬ 试验结果表明 ꎬ 随着光敏剂浓度的增加 ꎬ 菌体表面的电荷数增大菌体壁的损伤程度增加. 关键词 : 五聚赖氨酸酞菁锌 ( 光汰净 )ꎻ 最低抑菌浓度 ꎻ 细胞吸附 ꎻ 电动电位 ꎻ 部分抑菌浓度中图分类号 : Q936 文献标识码 : A 文章编号 : (2018) DOI: / j.cnki.j.fafu( nat.sci.) Antimicrobial mechanism of amphiphilic photosensitizer pentalysine β Carbonylphthalocyanine zinc against bacteria LIU Dafeng 1ꎬ2 ꎬ YUAN Cai 3 ꎬ CHEN Jingyi 3 ꎬ CHEN Zhuo 2 ꎬ HUNAG Mingdong 2ꎬ3 (1.School of Life Sciencesꎬ Fujian Agriculture and Forestry Universityꎻ 2.State Key Laboratory of Structural Chemistryꎬ Fujian Institute of Research on the Structure of Matterꎬ Chinese Academy of Sciencesꎻ 3.College of ChemistryꎬFuzhou Universityꎬ Fuzhouꎬ Fujian ꎬ China) Abstract: We measured the amount of PS pentalysine β Carbonylphthalocyanine zinc bound to Escherichia coli ( ATCC25922) and Staphylococcus aureus ( ATCC6538) ꎬ the zeta potential of bacterial surface in the presence of PSꎬ the damage of bacterial cell wallꎬ the joint antimicrobial effects of the PS together with polyhexamethylene biguanidine hydrochloride ( PHMB) or hydrogen peroxide ( H 2 ). The results showed that the charges of bacterial surface and the damage of bacterial cell wall increased with PS concentra tion. Key words: pentalysine β Carbonylphthalocyanine zincꎻ minimum inhibitory concentrationꎻ cellar uptakeꎻ zeta potentialꎻ fractional inhibitory concentration 人们对抗生素的滥用 ꎬ 导致了耐药菌的出现 ꎬ 特别是超级细菌的出现 ꎬ 引起了全球的恐慌 ꎬ 寻找和研发新的抗菌药物已迫在眉睫 [1ꎬ2]. 光动力抗菌疗法 (photodynamic antibacterial chemotherapyꎬ PACT) 以具有杀菌速度快多靶标性和不易产生耐药菌等优点 ꎬ 而成为一种新型的抗菌方法 [3ꎬ4].PACT 以光敏剂 (pho tosensitizerꎬ PS) 光源和氧为基本要素 [2ꎬ4]. 在光照下 ꎬPS 吸收光子能量 ꎬ 并将其传递给氧分子 ꎬ 发生光氧化反应 ꎬ 通过 Ⅰ 型和 Ⅱ 型两种反应机制而产生活性氧 (reactive oxygen speciesꎬ ROS) [5-7]. 活性氧与细胞生物膜大分子物质 ( 蛋白质脂质和核酸等 ) 和各种亚细胞器等细胞物质发生反应 ꎬ 从而引起细菌坏死或凋亡 [4-9].PACT 在一些牛皮癣和硬皮病等局部感染区逐步得到了应用 ꎬ 但 PACT 仍然不是现阶段主要的治疗手段 ꎬ 抗菌光敏剂的开发依然如火如荼. 抗菌光敏剂的开发受制于对光敏剂抗菌机理的研究 ꎬ 例如光敏剂如何影响菌体表面电荷 ꎬ 损伤菌体壁 ꎬ 被菌体吸附的速度和定量等. 对于这些机理的探索能够为光敏剂的发展提供指导. 本研究测定了一种新型光敏剂 ZnPc(Lys) 5 的抗菌机理 ꎬ 及其分别与过氧化氢 (H 2 ) 和聚六亚甲基双胍盐酸盐 (polyhexam ethylene biguanidine hydrochlorideꎬ PHMB) 的联合抗菌效果. 试验结果表明 ꎬ 该光敏剂能中和菌体表面负电作者简介 : 刘大锋 (1984-)ꎬ 男 ꎬ 硕士研究生. 研究方向 : 光敏剂抗菌机理. liudafeng2017@ qq.com. 通信作者黄明东 (1963-)ꎬ 男 ꎬ 教授 ꎬ 博士. 研究方向 : 光敏剂的合成及光动力治疗结构生物学. HMD_lab@ fzu.edu.cn.

2 第 5 期刘大锋等 : 两亲性光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌的抗菌机理 627 荷而且破坏菌体壁. 1 材料与方法 1.1 材料菌株 : 大肠杆菌 (ATCC25922) 和金黄色葡萄球菌 (ATCC6538). 培养基 :LB 培养基. 试剂 : 氨苄霉素 ( 碧云天生物技术公司 )ꎬ 卡那霉素 ( 碧云天生物技术公司 )ꎬ 聚六亚甲基双胍盐酸盐 (PHMBꎬ BEPHARM)ꎬ 过氧化氢 (H 2 ꎬ 西陇科学股份有限公司 )ꎬ 流式细胞仪 ( BECKMANCOULTER)ꎬ8 苯胺基 1 萘磺酸 (ANSꎬ Aladdin). 仪器 : 酶标仪 (BioTekꎬ USA)ꎬ24 孔 LED 平面红光光源 ( 波长 660 nm±25 nmꎬ 光剂量为 2.55 J cm -2 min -1 ). 1.2 光敏剂的合成与表征光敏剂 ZnPc(Lys) 5 的合成纯化和特性表征的方法参考本课题组的文献 [3ꎬ10-12]. 1.3 细菌对光敏剂吸附动力学的测定使用流式细胞仪荧光通道 (APC A750 Aꎬ ex = 638 nmꎬ em = 780 nm±60 nm)ꎬ 测定菌体对光敏剂的吸附动力学曲线 [13]. 分别向大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 (10 8 CFU ml -1 ) 液中加入光敏剂 (1 μmol L -1 ) 后 ꎬ 离心洗涤 ꎬ 重悬稀释 50 倍 ꎬ 用 FSC SSC 使丢弃率小于 2%. 再利用 SSC H 和 APC A750 A 每隔 30 s 检测荧光信号 1 次. 所有试验均设置 3 个独立的平行组. 1.4 抗菌活性的测定采用试管二倍稀释法 ꎬ 用 LB 培养液梯度稀释光敏剂 ꎬ 测定其抑制细菌生长时的最低抑菌浓度 ( mini mal inhibitory concentrationꎬ MIC) [14-16] ꎬ 分别稀释为 125 ~ μg ml -1 的一系列梯度浓度. 取 900 μl 含光敏剂的 LB 培养液 ꎬ 分别加入菌液 100 μl( 终浓度为 CFU ml -1 )ꎬ 以不加菌液和无光敏剂为阴性对照组 ꎬ 以加菌液而无光敏剂为阳性对照. 在洗涤组 ꎬ 洗去溶液中未被菌体吸附的光敏剂 ꎻ 在未洗涤组 ꎬ 不做洗涤处理. 各组均设置 3 个平行试验 ꎬ 孵育 ꎬ 光照 (5 minꎬ12.75 J cm -2 )ꎬ37 条件下培养 16 ~ 18 h 观察有无菌体生长. 在抗生素抑制细菌生长的组 ꎬ 方法如上 ꎬ 没有光照. 以能够完全抑制细菌生长的最低抑菌光敏剂浓度为 MIC. 1.5 生长曲线的测定分别向生长至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌溶液中 ( 终浓度为 CFU ml -1 ) 加入不同浓度的光敏剂 ( 终浓度分别为 1 / 8 1 / 4 1 / 2 和 1 倍的 MIC 浓度 )ꎬ 以不加光敏剂的菌液为对照组. 各组均设置 3 个平行试验 ꎬ 孵育 ꎬ 光照 (5 minꎬ12.75 J cm -2 )ꎬ37 和 150 r min -1 条件下培养 ꎬ 每隔 1 h 测定 600 nm 处光密度 (D) 值 1 次 ꎬ 每次取 100 μl 菌液 ꎬ 连续测定 12 h [10]. 1.6 细菌对光敏剂吸附量的测定菌液 (10 8 CFU ml -1 ) 经 PBS 洗涤和重悬后 ꎬ 与不同浓度的光敏剂 ( 和 3.2 μmol L -1 ) 孵育后 ꎬ 洗去溶液中未被菌体吸附的光敏剂 ꎬ 于裂解液 (0. 1 mol L -1 NaOH / 1% SDS) 中裂解 60 min [3ꎬ10ꎬ11]. 测定裂解后溶液的荧光值 (ex = 610 nmꎬ em = 680 nm). 所有试验都设置 3 个独立的平行组. 以光敏剂完全裂解的已知浓度与荧光值间的关系制定标准曲线 ꎬ 测定结果以每个细菌吸附光敏剂的分子个数表示. 1.7 电动电位测定菌液 (10 8 CFU ml -1 ) 经 1mmol L -1 KNO 3 (ph 6.2) 洗涤和重悬后 ꎬ 与不同浓度的光敏剂 ( 和 12 μmol L -1 ) 孵育 ꎬ 洗去溶液中未被吸附的光敏剂 ꎬ 得含有光敏剂的菌液 1 ml 后 ꎬ 即刻在室温下测定菌体表面的电动电位 [17ꎬ18] ꎬ 每组试验共有 10 个平行组. 1.8 细菌细胞壁受光敏剂影响的测定用 PBS 将生长至对数期细菌洗涤 ꎬ 并重悬至 D 600 nm = 0.1 ~ 0.3 后 ꎬ 与不同浓度光敏剂 (

3 628 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ) 第 47 卷和 4.0 μmol L -1 ) 混匀并孵育. 对照组光照组和暗处理组均加入终浓度为 5.65 mmol L -1 的荧光探针 8 苯胺基 1 萘磺酸 (ANS). 在光照组里 ꎬ 光照 (5 minꎬ J cm -2 ) 后加入 ANSꎻ 在暗处理组 ꎬ 加入 ANS 和光敏剂 ꎬ 而仅无光照 ꎻ 在对照组里 ꎬ 无光照无光敏剂. 每组都有 3 个独立的平行试验. 连续测定 ANS 荧光值 (ex = 380 nmꎬ em = 520 nm) 至稳定. 1.9 单用抗菌剂时最低抑菌浓度的测定采用试管二倍稀释法 ꎬ 用 LB 培养液梯度稀释抗菌药物. 对于光敏剂分别稀释为 125 ~ μg ml -1 的系列梯度浓度 ꎻ 对于 H 2 分别稀释为 2.6 g L -1 至 5.1 μg ml -1 ꎻ 对于 PHMB 分别稀释为 125 ~ μg ml -1 的系列梯度浓度. 测定方法同 1.4 试验部分 ꎬ 以能够完全抑制细菌生长的最低药物浓度为其 MIC [14-16ꎬ19] 抗菌剂联合抑菌效果的评价在 96 微孔板中 ꎬ 采用微量稀释法测定光敏剂和 PHMB 对细菌的联合抑菌效果 ꎬ 向微孔中分别依次加入 50 μl 光敏剂和 50 μl PHMBꎬ 保持从上至下每一横行 PHMB 浓度分别为 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1 / 2 MIC 1 / 4 MIC 1 / 8 MICꎻ 从左至右每一纵列光敏剂浓度分别为 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1 / 2 MIC 1 / 4 MIC 1 / 8 MICꎬ 向每一微孔中加入菌液 100 μl( 终浓度为 CFU ml -1 ). 以不加菌液 PHMB 和光敏剂为阴性对照 ꎻ 以加菌液而不加光敏剂和 PHMB 为阳性对照 ꎬ 各组试验均重复 5 次. 混匀 ꎬ 孵育 ꎬ 光照 (5 minꎬ12.75 J cm -2 )ꎬ 于 37 条件下培养 16 ~ 18 h 观察结果 ꎬ 分别检测光敏剂和 PHMB 对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低联合抑菌浓度 ꎬ 以能够完全抑制细菌生长的最低联合用药浓度为其联合 MIC. 联合抑菌的部分抑菌浓度 ( fractional inhibitory concentrationꎬ FIC) 的效果评价 :FIC = MIC 甲药联用 / MIC 甲药单用 +MIC 乙药联用 / MIC 乙药单用. 判断两抗菌剂联合抑菌效果的标准为 :FIC 0.5 时 ꎬ 具有协同作用 ꎻ0.5< FIC 1 时 ꎬ 具有相加作用 ꎻ1<FIC 2 时 ꎬ 具有无关作用 ꎻ2<FIC 时 ꎬ 具有拮抗作用 [9ꎬ20]. 此外 ꎬ 光敏剂和 H 2 的联合抑菌实验评价方法同上数据处理所有试验至少有 3 个平行组 ꎬ 所得数据使用 mean±sd 方法处理 ꎬ 且使用 Origin 8.5 和 Microsoft Excel 2013 软件处理. 利用软件 DPS v7.0 和 SPSS 19.0 做差异显著性分析 ꎬP<0.05 表示显著相关性 ꎬP<0.01 表示极显著相关性. 2 结果与分析 2.1 ZnPc(Lys) 5 合成与表征结果光敏剂 ZnPc(Lys) 5 分子因有 1 条五聚赖氨酸链 ( 图 1a)ꎬ 而在中性溶液中带有 5 个正电荷 ꎬ 利用反相柱 C 18 高效液相色谱纯化 ꎬ 由 100% MeOH / TFA 所筛选 ꎬ 得到高纯度的光敏剂 ( 图 1b) [12]. 在 DMSO 溶液中 ꎬ 该光敏剂的 UV / Vis 吸收波普在 678 nm 处有 1 条 Q 带 ꎬ 而在 610 nm 处有一条弱带 ( 图 1c) [3]. 光敏剂单线态氧的量子产率值为 0.63±0.02 [12]. a: 分子结构 ꎻb: 在 C 18 HPLC 反向柱中纯化 ( 纯度 >95%)ꎻc:1 μmol L -1 ZnPc(Lys) 5 在 DMSO 溶液中的 UV / Vis 吸收波普. 图 1 ZnPc(Lys) 5 的表征 2.2 细菌对光敏剂吸附动力学结果 Fig.1 Characteristics of ZnPc(Lys) 5 由细菌对 ZnPc(Lys) 5 的吸附动力学曲线 ( 图 2) 发现 : 大肠杆菌在第 3 min 时即可达到对光敏剂的饱

4 第 5 期刘大锋等 : 两亲性光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌的抗菌机理 629 和吸附 ꎬ 而金黄色葡萄球菌却在第 5.5 min 达到对光敏剂的饱和吸附 ( 图 2). 因此 ꎬ 与金黄色葡萄球菌相比 ꎬ 大肠杆菌对该光敏剂的吸附速率更快. 在以下试验中 ꎬZnPc( Lys) 5 与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的孵育时间分别是 3.0 和 5.5 minꎬ 以达到对该光敏剂的饱和吸附效果. 2.3 抗菌活性结果通过对光敏剂抑制菌体生长时 MIC 值的测定 ꎬ 来检测光敏剂抗菌活力的大小. 向菌液中加入不同浓度的光敏剂 ꎬ 孵育 ꎬ 在洗涤组 ꎬ 洗去未被菌体吸附中的光敏剂 ꎻ 在非洗涤组 ꎬ 保留未被吸附的光敏剂. 经光照 P<0.01 具有极显著相关性. 图 2 细菌对光敏剂 ZnPc(Lys) 5 的吸附动力学曲线 Fig.2 Binding kinetics of ZnPc(Lys) 5 on bacteria 后 ꎬ 温育培养. 在洗涤组中 ꎬ 光敏剂抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的 MIC 值分别为和 6.33 μmol L -1 ꎬ 在非洗涤组 ꎬMIC 值分别为 1.58 和 0.79 μmol L -1. 而对于抗生素抑制细菌生长组 ꎬ 氨苄霉素抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长时的 MIC 值分别为 7.57 和 μmol L -1 ꎬ 卡那霉素对金黄色葡萄球菌和金大肠杆菌生长抑制的 MIC 值分别为和 μmol L -1. 结果表明 ꎬ 与抗生素相比 ꎬ 光敏剂对细菌生长时的抑制能力更强. 此外 ꎬ 与未洗涤组相比 ꎬ 洗涤组光敏剂抑制细菌生长时的 MIC 值明显增大 ꎬ 其原因可能是 :(1) 溶液中的光敏剂而后又被吸附到菌体表面 ꎻ(2) 活性氧在菌体表面破坏而产生一些孔洞 ꎬ 被菌体吸附或未被菌体吸附的光敏剂通过这些空洞进入细菌内部 ꎬ 造成对细菌更大的损伤作用. 2.4 生长曲线测定的结果测定没有光敏剂和含有不同浓度光敏剂菌液的 D 600 nm 值 ꎬ 比较细菌的生长曲线. 向菌液中加入不同浓度的光敏剂 ꎬ 孵育 ꎬ 光照 ꎬ 每隔 1 h 取 100 μl 菌液测定. 结果显示 : 抑制细菌的生长曲线具有光敏剂的浓度依赖性 ( 图 3). 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 ꎬ 在相同的时间时 ꎬ 随着光敏剂浓度的增加 ( 从 0 至 1 倍的 MIC)ꎬ 测得的 D 600 nm 值减小. 并且与光敏剂浓度 1 / 8 MIC 和 1 / 4 MIC 1 / 4 MIC 和 1 / 2 MIC 的 D 600 nm 之间的差值相比较 ꎬ 没有光敏剂和光敏剂浓度 1 / 8 MIC 浓度 1 / 2 MIC 和 MIC 时的差值更大 ꎬ 表明光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌具有理想的抗菌效果. Fig.3 a: 金黄色葡萄球菌 ꎻb: 大肠杆菌.P<0.01 具有极显著相关性. 图 3 不同浓度光敏剂处理时细菌的生长曲线 S.aureus ( a) and E.coli ( b) growth curve at different concentrations of PS 2.5 不同细菌对光敏剂的吸附量向菌液中加入不同浓度光敏剂 ꎬ 温育 ꎬ 洗涤 ꎬ 裂解于 0.1 mol L -1 NaOH / 1% SDS 中 60 min 后 ꎬ 测定每个细菌吸附光敏剂分子数. 试验结果显示 : 随着光敏剂浓度从 0.20 μmol L -1 增加到 3.16 μmol L -1 ꎬ 每个细菌所吸附的光敏剂数量也逐步增加 ( 图 4). 每个金黄色葡萄球菌所吸附的光敏剂分子数从 (0.64±0.05) 10 5 个升至 (8.66±0.44) 10 5 个 ꎻ 而对于大肠杆菌 ꎬ 光敏剂的分子数则从 (0.41±0.05) 10 5 个升至 (5.36± 0.21) 10 5 个. 试验结果表明 : 在光敏剂浓度相同时 ꎬ 对于每个细菌而言 ꎬ 金黄色葡萄球菌吸附的光敏剂分子数量比大肠杆菌的多. 可能因为 ꎬ 与大肠杆菌表面的脂多糖相比 ꎬ 金黄色葡萄球菌表面的磷壁酸具有更

5 630 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ) 第 47 卷多的负电荷数量 ꎬ 从而能够吸附更多带有正电荷的光敏剂分子. 试验结果与光敏剂抗菌活性的测定结果相符合 ꎬ 也与陈卓等的试验结果 ( 每个金黄色葡萄球菌吸附大约 105 个光敏剂分子 ) 相一致 [3]. 2.6 光敏剂增加细菌表面正电荷在中性溶液中 ꎬ 菌体表面带有负电荷 ꎬ 而 1 个 ZnPc(Lys) 5 分子则带有 5 个正电荷 ꎬ 因此可以通过静电作用而被吸附到菌体表面. 菌液 ( 10 8 CFU ml -1 ) 与不同浓度光敏剂混匀 ꎬ 孵育 ꎬ 洗涤 ꎬ 测定菌液的电动电位. 结果显示 : 没有加入光敏剂时 ꎬ 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面的电荷量分别为 ( ± 1.02) 和 ( ± 0.51) mvꎻ 随着光敏剂浓度的增加 ꎬ 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面的电荷数也逐步增大 ( 图 5). 因而 ꎬ 结果表明 ꎬ 光敏剂能有效地中和菌体表面的负电荷数 ꎬ 此结果与细菌对光敏剂吸附量的试验结果相吻合. 2.7 光敏剂对菌体细胞壁的影响借助荧光探针 8 苯胺基 1 萘磺酸 ( ANS) 测定菌体壁的受损程度.ANS 的荧光在水溶液中被猝灭 ꎬ 而在疏水环境中则表现出较强的荧光强度 (ex = 380 nmꎬ em = 520 nm). 当菌体的细胞壁受损后 ꎬ 荧光探针 ANS 会进入细胞膜磷脂双分子层的疏水环境中 ꎬ 而表现出荧光增大的现象. 向菌液中加入不同浓度 P<0.05 具有显著相关性. 图 4 细菌对 ZnPc(Lys) 5 的吸附 Fig.4 Adsorption of ZnPc (Lys) 5 by bacteria P<0.05 具有显著相关性. 图 5 ZnPc(Lys) 5 在洗涤之后对菌体表面电动电位的影响 Fig.5 ZnPc (Lys) 5 influence on the electric potential of the bacteria after washing 的光敏剂后 ꎬ 再加入 ANS 荧光探针 ꎬ 孵育. 在光照组 ꎬ 需要光照后 ꎬ 再加入 ANSꎬ 以避免其被活性氧所破坏而导致荧光降低. 通过荧光值的测定 ꎬ 试验结果表明 : 随着 PS 浓度从 0.40 至 4.00 μmol L -1 的升高 ꎬ 在光照组的荧光值也逐步增大. 对于金黄色葡萄球菌 ꎬ 荧光值从 a. u. ± 23 a. u. 逐步升高到 a. u. ± 31 a.u.ꎻ 而对于大肠杆菌 ꎬ 荧光值则由 1554 a.u.±35 a.u. 升高到 2587 a.u.±67 a.u.( 图 6). 研究结果显示随着光敏剂浓度的增加 ꎬ 细菌细胞壁的受损程度也增加. 图 6 Fig.6 P<0.01 具有极显著相关性. 在光照时 ꎬZnPc(Lys) 5 对金黄色葡萄球菌 (a) 和大肠杆菌 (b) 细胞壁的影响 Effect of ZnPc (Lys) 5 on the cell wall of S.aureus (a) and E.coli (b) during illumination 2.8 抗菌剂单用测定结果在抗菌剂单用时 ꎬH 2 和 PHMB 抑制大肠杆菌生长的 MIC 值分别为和 7.81 μg ml -1 ꎻ 抑制金黄色葡萄球菌生长的 MIC 值分别为和 7.80 μg ml -1. 与阳性菌株 ( 金黄色葡萄球菌 ) 相比 ꎬ 阴性菌株 ( 大肠杆菌 ) 具有由肽聚糖组成的外膜 ꎬ 而此外膜可减少抗菌药物对细菌的伤害. 因此 ꎬ 大肠杆菌比金黄

6 第 5 期刘大锋等 : 两亲性光敏剂五聚赖氨酸酞菁锌的抗菌机理 631 色葡萄球菌对抗菌剂表现出更强的耐药性. 2.9 抗菌剂联合抑菌测定结果因为 ZnPc(Lys) 5 带有正电荷 ꎬ 且是借助 ROS 达到杀菌目的 ꎬ 所以评价光敏剂分别与 H 2 和 PHMB 的联合抗菌效果 ꎬ 以确定活性氧或正电荷在 PS 抗菌中的分别作用. 测得光敏剂分别与 H 2 或 PHMB 的联合抗菌作用结果 ( 表 1)ꎬ 发现光敏剂和 PHMB 对大肠杆菌的最低联合抑菌浓度分别是 0.98 和 3.91 μg ml -1 ꎬ 对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别是 0.24 和 1.95 μg ml -1 ( 表 1). 从而可知 ꎬ 对于大肠杆菌 ꎬ1 FIC = 1<2ꎬ 光敏剂和 PHMB 表现出相加抗菌作用 ꎻ 对于金黄色葡萄球菌 ꎬFIC = ꎬ 光敏剂和 PHMB 表现出协同抗菌作用. 结果表明正电荷的引入没有促进光敏剂对大肠杆菌的抑制作用 ꎬ 却促进了对金黄色葡萄球菌的抑制作用. 表 1 药物最低联合抑菌浓度 Table 1 Minimum combined bacteriostasis of the drugs μg ml -1 组合药物大肠杆菌金黄色葡萄球菌 ZnPc(Lys) 5 和 PHMB ZnPc(Lys) PHMB ZnPc(Lys) 5 和 H 2 ZnPc(Lys) H 同理可知 ꎬ 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 ꎬ 光敏剂和 H 2 均表现出协同抗菌作用 ꎬ 因而 H 2 能够增强光敏剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制生长作用. 3 讨论本研究表明 ꎬ 随着光敏剂浓度的增加 ꎬ 菌体对光敏剂的吸附量增大 ꎬ 菌体表面的电动电位也增大 ꎬ 从而对菌体壁的破坏程度也逐步增加. 通过对联合抗菌效果的评价 ꎬH 2 与光敏剂具有协同抗菌作用 ꎻPHMB 和光敏剂金黄色葡萄球菌具有协同抗菌效果 ꎬ 而对大肠杆菌具有相加抗菌效果. 在 ZnPc(Lys) 5 的杀菌过程中 ꎬ 通过静电作用被吸附到菌体表面. 光敏剂经光照后产生 ROSꎬ 在细菌表面破坏细胞壁和细胞膜 ꎬ 可能会破坏菌体表面而形成一些孔洞 ꎻ 此外 ꎬ 光敏剂也可能穿过这些孔洞 ꎬ 进入细菌内部 ꎬ 从而增强了对细菌的灭活作用. 根据文献报道 PHMB 因富含正电荷而具有高度表面活性作用 ꎬ 易通过静电吸附作用而粘附于带有负电荷的细菌表面 ꎬ 损伤细菌细胞膜 ꎬ 改变细菌渗透性 ꎬ 最终使细菌破裂而死亡. 在 PHMB 和 ZnPc(Lys) 5 的联合抑菌中 ꎬ 对大肠杆菌具有相加抗菌作用 ꎬ 而对金黄色葡萄球菌具有协同抗菌作用. 因生物膜具有流动性 ꎬ 所以大肠杆菌的外膜的可能会使 ZnPc(Lys) 5 分子快速地进入或者通过外膜 ꎬ 与 PHMB 不能相互影响抗菌效果 ꎬ 使 ZnPc(Lys) 5 和 PHMB 相互独立地发挥抑菌作用 [21ꎬ22] ꎬ 从而表现出对大肠杆菌的相加抗菌效果. 金黄色葡萄球菌的细胞壁较厚 ( 15 ~ 80 nm) [23] ꎬ 使得 ZnPc ( Lys) 5 和 PHMB 可能都聚集在菌体表面 [24] ꎬ 发挥协同的抗菌作用 [20-22]. 参考文献 [1] MARINHO Cꎬ SANTOS Tꎬ GONCALVES Aꎬ et al. A decade long commitment to antimicrobial resistance surveillance in portu gal[ J]. Frontiers in Microbiologyꎬ 2016ꎬ7:1-14. [2] WAINWRIGHT Mꎬ MAISCH Tꎬ NONELL Sꎬ et al. Photoantimicrobials are we afraid of the light? [ J].The Lancet Infec tious Diseasesꎬ 2017ꎬ17:e49-e55. [3] CHEN Zꎬ ZHANG Yꎬ WANG Dꎬ et al. Photodynamic antimicrobial chemotherapy using zinc phthalocyanine derivatives in treatment of bacterial skin infection[ J]. Journal of Biomedical Opticsꎬ 2016ꎬ21: [4] HAMBLIN R. Antimicrobial photosensitizers: drug discovery under the spotlight[ J]. Current Medicinal Chemistryꎬ 2015ꎬ22: [5] HAMBLIN M R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbe [ J]. Current Opin ion in Microbiologyꎬ 2016ꎬ33: [6] TOPALOGLU Nꎬ GUNEY Mꎬ AYSAN Nꎬ et al. The role of reactive oxygen species in the antibacterial photodynamic treat

7 632 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ) 第 47 卷 ment: photoinactivation vs proliferation[ J]. Letters in Applied Microbiologyꎬ 2016ꎬ62: [7] ALMEIDA Aꎬ FAUSTINO M Aꎬ TOME J P. Photodynamic inactivation of bacteria: finding the effective targets[ J]. Future Me dicinal Chemistryꎬ 2015ꎬ 26: [8] DOSSELLI Rꎬ MILLONI Rꎬ PURICELLI Lꎬ et al. Molecular targets of antimicrobial photodynamic therapy identified by a pro teomic approach[ J]. Journal of Proteomicsꎬ 2012ꎬ77: [9] CAI Xꎬ ZHANG Bꎬ LIANG Yꎬ et al. Study on the antibacterial mechanism of copper ion and neodymium ion modified alpha zirconium phosphate with better antibacterial activity and lower cytotoxicity[ J]. Colloids and Surfaces Bꎬ Biointerfacesꎬ 2015ꎬ 132: [10] YULAN Wꎬ JIANGSHAN Wꎬ RICHARD J Mꎬ et al. Antibacterial properties and mechanism of gold silver nanocages[ J]. Nanoscaleꎬ 2016ꎬ8: [ 11] CHEN Zꎬ ZHOU Sꎬ CHEN Jꎬ et al. Pentalysine beta carbonylphthalocyanine zinc: an effective tumor targeting photosensitizer for photodynamic therapy[ J]. ChemMedChemꎬ 2010ꎬ5: [12] CHEN Zꎬ ZHOU Sꎬ CHEN Jꎬ et al. An effective zinc phthalocyanine derivative for photodynamic antimicrobial chemotherapy [ J]. Journal of Luminescence. 2014ꎬ152: [13] LI Lꎬ LUO Zꎬ CHEN Zꎬ et al. Enhanced photodynamic efficacy of zinc phthalocyanine by conjugating to heptalysine[j]. Bio conjugate Chemistryꎬ 2012ꎬ23: [14] ZHANG Yꎬ ZHENG Kꎬ CHEN Zꎬ et al. Rapid killing of bacteria by a new type of photosensitizer[j]. Applied Microbiology and Biotechnologyꎬ 2017ꎬ101: [15] XU Zꎬ GAO Yꎬ MENG Sꎬ et al. Mechanism and in vivo evaluation: Photodynamic antibacterial chemotherapy of lysine por phyrin conjugate[ J]. Frontiers in Microbiologyꎬ 2016ꎬ7: [16] YAN Fꎬ DANG Qꎬ LIU Cꎬ et al. 3ꎬ6 O [ N (2 Aminoethyl) acetamide yl] chitosan exerts antibacterial activity by a mem brane damage mechanism[ J]. Carbohydrate Polymersꎬ 2016ꎬ149: [17] DEPAN Dꎬ MISRA R D. On the determining role of network structure titania in silicone against bacterial colonization: mecha nism and disruption of biofilm[ J]. Materials Science & Engineering Cꎬ Materials for Biological Applicationsꎬ 2014ꎬ34: [ 18] FANG Yꎬ LIU Tꎬ ZOU Qꎬ et al. Water soluble benzylidene cyclopentanone based photosensitizers for in vitro and in vivo anti microbial photodynamic therapy[ J]. Scientific Reportsꎬ 2016ꎬ6: [ 19] SUN Yꎬ DONG Wꎬ SUN Lꎬ et al. Insights into the membrane interaction mechanism and antibacterial properties of chensinin 1b[ J]. Biomaterialsꎬ 2015ꎬ37: [20] DIXON R Aꎬ AL NAZAWI Mꎬ ALDERSON G. Permeabilising effects of sub inhibitory concentrations of microcystin on the growth of Escherichia coli[ J]. FEMS Microbiology Lettersꎬ 2004ꎬ230: [21] OUYANG Yꎬ CAI Xꎬ SHI Qꎬ et al. Poly L lysine modified reduced graphene oxide stabilizes the copper nanoparticles with higher water solubility and long term additively antibacterial activity[ J]. Colloids and Surfaces Bꎬ Biointerfacesꎬ 2013ꎬ107: [22] WU Tꎬ XIE A Gꎬ TAN S Zꎬ et al. Antimicrobial effects of quaternary phosphonium salt intercalated clay minerals on Esche richia coli and Staphylococci aureus[ J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfacesꎬ 2011ꎬ86: [23] XIE A Gꎬ CAI Xꎬ LIN M Sꎬ et al. Long acting antibacterial activity of quaternary phosphonium salts functionalized few lay ered graphite[ J]. Materials Science and Engineering: Bꎬ 2011ꎬ176: [24] MAISCH Tꎬ SZEIMIES R Mꎬ JORI Gꎬ et al. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology[ J]. Photochemical & Photo biological Scienceꎬ 2004ꎬ3: ( 责任编辑 : 吴显达 )

5期xin

5期xin 中国农学通报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定喻华英, 李启峰 ( 塔里木大学动物科学学院, 新疆阿拉尔 843300) 摘要 : 为探究犊牛腹泻病中大肠杆菌生物膜的形成