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捷宏俎
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1 中国农学通报 04,0(9):0-06 Chinese Agricultural Science Bulletin 酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化李聪 ( 辽宁石油化工大学化学化工与环境学部, 辽宁抚顺 00) 摘要 : 为了确定酿酒酵母的最适摇瓶发酵培养条件及最适培养基, 采用单因素试验及 L 9( ) 正交试验研究影响酿酒酵母生长的关键因素, 包括培养温度培养时间及摇床转速 ; 采用单因素试验及 L 9( 4 ) 正交试验优化发酵培养基并进一步筛选出关键因素结果表明 : 优化的培养条件为培养温度 9, 摇床转速 60 r/min, 培养 7 h, 优化的发酵培养基配方为葡萄糖 0 g/l, 酵母粉 0 g/l,kh PO 4. g/l,mgso 4 g/l 结论 : 影响酿酒酵母生长的关键因素为摇瓶培养时间及培养基中葡萄糖浓度关键词 : 酿酒酵母 ; 正交试验法 ; 培养基中图分类号 :Q9- 文献标志码 :A 论文编号 :0-974 Optimization of Culturing Conditions and Fermentation Culture Media of Saccharomy cescerevisiae Li Cong (College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun Liaoning 00) Abstract: In order to determine the optimal conditions of shaking flasks fermentation of Saccharomy cescerevisiae, we conducted the single- factor test, including culture temperature, culture time and rotation speed. The L 9( ) orthogonal test was used to optimize the culture conditions of Saccharomy cescerevisiae, and the L 9( 4 ) orthogonal test was used to optimize the fermentation culture media of Saccharomy cescerevisiae. The results showed that, the optimization fermentation condition was culturing in 9, speed 60 r/min for 7 hours. The optimization fermentation culture media was glucose 0 g/l, yeast powder 0 g/l,kh PO 4. g/l, MgSO 4 g/l. The key factors affecting the growth of Saccharomyces cerevisiae were the culture time and the glucose concentration of the culture medium. Key words: Saccharomy cescerevisiae; orthogonal test; culture media 0 引言酿酒酵母也称出芽酵母或面包酵母, 为革兰氏染色阳性菌, 单细胞, 球形椭圆形 (~8 μm) 或细胞延伸呈退化型假菌丝菌落中等大小, 扁平, 光滑, 湿润, [] 乳酪色到淡棕色, 有酒酿气味其具有繁殖快, 生长周期短, 易进行大规模培养等特点, 并且含有丰富的蛋白质维生素脂肪多糖及各种代谢产物等生理 [-] 活性物质, 因此, 被广泛用于食品发酵工业及饲料 [4-] 行业中近几年来, 酿酒酵母作为模式生物在基因工程领域也发挥了较大作用, 人们利用酿酒酵母生产大量的重组蛋白及生物药品, 并取得一定的进展 [6-8] 这些成果皆是以发酵获得高细胞浓度的酵母为基础进行研究而取得的, 国内外对于酿酒酵母发酵领域的研究已有 [9-0] 较多报道,Elisabeth 等针对碳源氮源缺乏对 S. cerevisiae 的影响进行了连续研究, 结果表明缺氮培养后, 发酵能力依菌株不同减少 70%~9%, 缺碳培养后, 几乎所有供试菌株都丧失了发酵能力, 并指出在工业发酵中, 在厌氧条件下为保持酿酒酵母发酵能力强的菌株数量, 应避免酵母菌株碳源缺乏 Valero [] 定性和定量地分析了两种酿酒酵母发酵前期在不同含氧条件下利用和吸收氮源的差异, 这些差异主要受发酵前期作者简介 : 李聪, 女,984 年出生, 辽宁抚顺人, 助理实验师, 硕士研究生, 研究方向 : 微生物发酵通信地址 :00 辽宁省抚顺市望花区丹东路西段号辽宁石油化工大学化学化工与环境学部实验中心, lcfayewong@6.com 收稿日期 :0-07-8, 修回日期 :0-09-0

2 李聪 : 酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化 0 [] 氧和酿酒酵母的影响王蓬际比较了尿素和硫酸铵两种氮源对酿酒酵母发酵的影响, 发现硫酸铵比尿素效果好, 最终酒精浓度可以达到 9.9 g/l 笔者采用单因素比较试验和正交法试验优化酿酒酵母 GY-7 的培养条件, 开发出一种适合于高密度培养酿酒酵母的发酵培养基旨在通过优化发酵培养条件及培养基成分, 提高酵母细胞密度, 从而提高生产效率, 降低生产成本, 为之后的扩大培养使其进一步发挥其在食品发酵工业及医疗行业的作用提供理论依据, 奠定实践基础材料与方法. 菌株酿酒酵母 (Saccharomy cescerevisiae)gy-7, 辽宁石油化工大学生物工程实验室保藏. 培养基 () 种子培养基葡萄糖 0 g/l, 蛋白胨 g/l, 酵母膏 g/l, 氯化钠 4 g/l,ph 7.0 () 基础发酵培养基葡萄糖 0 g/l, 硫酸铵 8 g/l, KH PO 4. g/l,mgso 4 7H O 0. g/l,ph.. 仪器设备立式压力蒸汽灭菌器 ( 上海申安医疗器械厂 ); 全温振荡器 ( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ); 可见分光光度计 ( 北京瑞利分析仪器公司 ).4 方法.4. 液体种子培养向装有 0 ml 液体种子培养基的 0 ml 三角瓶中接种两环斜面种子,0 0 r/min 振荡培养 4 h, 得到二级种子液将二级种子液以 % 的接种量接入 0 ml 发酵培养基中, 进行单因素及正交法试验.4. 确定酿酒酵母生长的最佳培养时间按.4. 方法将二级种子接种到发酵基础培养基中,0 0 r/min 振荡培养, 培养后每隔一段时间取样 ml, 稀释后在可见分光光度计于 600 nm 处测各管菌液的吸光值, 以空白发酵培养基做参比, 取至 4 h 后, 停止取样, 根据所得的数据做出生长曲线, 找出其生长稳定期 [].4. 确定酿酒酵母生长的最适温度按.4. 方法将二级种子接种到发酵基础培养基中, 分别置于个温度梯度, 转速 0 r/min 振荡培养 0 h, 取 ml 稀释适当倍数, 以空白液体培养基做参比, 用分光光度计测定在 600 nm 处的吸光度.4.4 确定培养酿酒酵母生长的最适转速按.4. 方法将二级种子接种到发酵基础培养基中, 分别置于转速 r/min 下 0 培养 0 h, 取 ml 稀释适当倍数, 以空白液体培养基做参比, 测定其吸光值.4. 摇床培养条件的正交实验设计从上面得出的数据中选出较优的水平进行三因素三水平的正交试验 [4], 对培养条件进一步优化, 选取 L 9( ) 正交表, 三因素即培养时间培养温度摇床转速.4.6 酿酒酵母发酵培养基的正交试验设计由葡萄糖酵母粉 KH PO 4 以及 MgSO 4 组成发酵优化培养基, 根据之前试验数据对每种成分设定种水平, 进行四因素三水平的正交实验, 对培养基成分进一步优化. 数据分析采用 SPSS 软件对正交试验结果进行分析结果与分析. 培养时间对酿酒酵母生长的影响由图可知, 酿酒酵母 GY-7 在 0~6 h 生长缓慢, 处于延滞期,6~ h 为对数生长期,~ h 为稳定生长期, 酵母的生长趋于稳定, 在所测时间段内未出现明显的衰退期测定时间图酿酒酵母 GY-7 生长曲线. 温度对酿酒酵母生长的影响大多数菌的最适生长温度在 ~ 之间 [], 本研究选择 6~4 中的五个温度点进行试验由图可知, 在 8~0 期间酵母繁殖旺盛, 生长迅速, 其中 8 为酵母的最适生长温度而在较低或较高温度下, 酵母受到抑制, 生长缓慢. 摇床转速对酿酒酵母生长的影响摇床培养可以使底物或者代谢产物更好的在菌体内转移和发挥作用, 并且通过空气的流动可以让更多空气中的氧气溶解到发酵液中, 改变发酵液中溶解氧值, 影响菌体生长由图可以看出, 当摇床转速达到 60 r/min 时, 酵母密度最高, 生长迅速, 为培养酿酒酵母的最适转速而转速过低或过高都会抑制酵母菌的

3 04 中国农学通报生长培养温度图温度对酿酒酵母 GY-7 生长的影响.4 正交试验研究酿酒酵母的最适培养条件通过以上单因素试验, 确定三因素的三水平 ( 如表 ), 进行三因素三水平正交试验,L 9( ) 正交表及试验结果见表直接分析 ( 如表 ) 表明, 酿酒酵母 GY-7 的最适摇瓶发酵培养条件为 A B C, 即在 9,60 r/min 条件下培养 7 h 极差大小为 A>B>C, 培养时间对酿酒酵母发酵影响最大, 其次为培养温度, 摇床转速影响最小由表方差分析结果可以看出,F A>F 临界值 (a= 0.0), 即培养时间对酿酒酵母发酵的影响较为显著, 而 F B F C 值均小于 F 临界值, 说明培养温度和摇床转速在所选水平值内对酵母发酵无显著影响摇床转速图摇床转速对酿酒酵母 GY-7 生长的影响表酿酒酵母 GY-7 发酵培养条件优化正交试验结果表 A 培养时间 /h B 培养温度 / C 摇床转速 / (r/min) OD 表酿酒酵母 GY-7 发酵培养条件优化正交试验因素水平表水平 A 培养时间 /h B 培养温度 / C 摇床转速 /(r/min) K K K k k k 正交试验优化酿酒酵母的最适发酵培养基为进一步提高酿酒酵母 GY-7 的摇瓶发酵产量, 本研究对发酵培养基进行优化, 选择葡萄糖作为碳源, 酵母粉作为氮源,KH PO 4 MgSO 4 为无机盐组成发酵培养基, 在之前试验所确定的最佳发酵培养条件下, 进行 S 注 : 试验结果为重复试验次的平均值四因素三水平的正交试验, 各因素的各水平值见表 4, L 9( 4 ) 正交表及试验结果见表表酿酒酵母 GY-7 发酵培养条件优化正交试验方差分析表因素偏差平方和自由度 F 比 F 临界值 (a=0.0) P A 培养时间 <0.0 B 培养温度 C 摇床转速误差 0.00

4 李聪 : 酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化 0 表 4 酿酒酵母 GY-7 发酵培养基优化正交试验因素水平表水平 A 葡萄糖浓度 /(g/l) B 酵母粉浓度 /(g/l) C KHPO4 浓度 /(g/l) D MgSO4 浓度 /(g/l) 表酿酒酵母 GY-7 发酵培养基优化正交试验结果表 A 葡萄糖浓度 /(g/l) B 酵母粉浓度 /(g/l) C KHPO4 浓度 /(g/l) D MgSO4 浓度 /(g/l) OD K K K k k k S 注 : 试验结果为重复试验次的平均值由正交试验直接分析结果 ( 如表 ) 可以看出, 极差大小为 A>D>B>C, 即葡萄糖对酵母发酵的影响最大, 其次是 MgSO 4, 酵母粉对酵母发酵影响较小, 而影响最小的是 KH PO 4 同时试验结果表明酿酒酵母 GY-7 的最适发酵培养基为 A B C D, 即葡萄糖 0 g/l, 酵母粉 0 g/l,kh PO 4. g/l,mgso 4 g/l, 由于该组合并未出现在正交试验表中, 因此, 以此配方配制培养基进行验证试验, 次重复验证试验结果表明该组合确为酿酒酵母 GY-7 的最适发酵培养基为进一步研究正交试验结果, 对试验数据进行了方差分析, 之前极差分析结果表明 KH PO 4 对试验结果影响最小, 因此把 KH PO 4 作为误差项来检验其他因素的显著性方差分析 ( 如表 6) 结果表明 F A>F 临界值 (a= 0.0), 即葡萄糖对酵母的发酵有显著影响, 而其他因素 F 值均小于 F 临界值, 说明酵母粉 KH PO 4 和 MgSO 4 对酵母发酵无显著影响表 6 酿酒酵母 GY-7 发酵培养基优化正交试验方差分析表因素偏差平方和自由度 F 比 F 临界值 (a=0.0) P A 葡萄糖浓度 <0.0 B 酵母粉浓度 C KHPO4 浓度 D MgSO4 浓度误差 0.0

5 06 中国农学通报结论与讨论发酵取得酵母细胞的浓度与发酵目的产物的多少成正比关系, 因此发酵过程的首要任务是研究如何提高细胞密度, 以便提高生产率简化下游加工降低培养容积生产成本及设备投资, 使目的产物产生良好的成本效益 [6] 前人的研究大多通过优化发酵培养基来 [7] 提高酵母浓度, 王颖等以 TB 培养基为基础, 通过正交试验优化培养基组成, 优化后细胞密度较之前提高 [8].0% 汪芳等采用响应面分析, 对碳源氮源用量进行优化, 最终细胞干重达到 0.6 g/l 本研究通过单因素试验及正交试验优化了酿酒酵母的摇瓶发酵培养条件及发酵培养基试验优化后的培养条件为培养温度 9, 摇床转速 60 r/min, 培养 7 h, 优化的发酵培养基配方为葡萄糖 0 g/l, 酵母粉 0 g/l,kh PO 4. g/l,mgso 4 g/l 在此发酵条件下, 酵母菌体生长效果最好, 细胞密度最高实验结果表明, 影响酿酒酵母 GY-7 生长的显著因素为摇瓶培养时间, 最适时间为 7 h, 若培养时间过短会导致细胞浓度低, 而培养时间过长, 则易产生霉菌或菌体老化, 使目的产物产量降低发酵培养基中葡萄糖浓度为影响酿酒酵母 GY-7 的生长的重要因素, 这说明葡萄糖作为碳源对于酵母的生长是至关重要的, 另外, 氮源及无机盐也是酵母生长不可或缺的因素另外, 本研究仅针对于酿酒酵母 GY-7 这一菌株进行试验, 本研究所优化的培养条件及培养基对酒酵母其他型株是否具有普遍适用性, 还需进一步试验验证参考文献 [] 夏晓华, 朱建国. 酿酒酵母的生物学特性 [J]. 浙江检验医学,007, ():7. [] 王定昌, 赖荣婷. 酵母的用途 [J]. 粮油食品,00,0():-6. [] 熊子书. 中国酿酒酵母的研究 [J]. 酿酒科技,00(4):-7. [4] 刘哲, 詹良静, 张新宜, 等. 高产谷胱甘肽酿酒酵母的选育及发酵工艺的研究 [J]. 微生物学杂志,0,():-9. [] 李永霞, 曾海英, 秦礼康. 酵母细胞破碎条件优化及高肽酶菌株筛选 [J]. 食品科学,00,(7):0-08. [6] Steen E J, Chan R, Prasad N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n- butanol[j]. Microbial Cell Factories,008(7):6-7. [7] 张晓阳, 杜风光, 池小琴, 等. 代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株 [J]. 中国生物工程杂志,0,(7):9-97. [8] 张伟, 余传信, 杨建良, 等. 酿酒酵母表达 SjHD-HSA 融合蛋白与免疫反应性分析 [J]. 中国血吸虫病防治杂志,0,(6):6-68. [9] Elisabeth T, Christer L, Eva A, et a. Carbon starvation can induce energy deprivation and loss of fermentative capacity in Saceharomyces cerevisiae[j]. Applied And Environmental Microbiology,00(7):-7. [0] Elisabeth T, Lena G, Christer L. Starvation response of Saccharomyces cerevisiae grown in anaerobic nitrogen- or carbonlimited Chemostat Cultures[J]. Applied And Environmental Microbiology,00(7): [] Valero E, Mill C, Ortega M, et a. Amino acids in wine after fermentation[j]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 00,8(8):80-8. [] 王蓬际. 氮源及无机盐对酒精发酵的影响 [J]. 酿酒,00,(4):l-. [] 郭春叶, 龚月生, 刘林丽, 等. 酵母菌生长曲线的测定及其转葡萄芪合酶基因重组菌遗传稳定性的检测 [J]. 安徽农业科学,007,(7): [4] 李春喜, 王志和, 王文林. 生物统计学 ( 第版 )[M]. 北京 : 科学出版社, 000:49-6. [] 周德庆. 微生物学教程 [M]. 北京 : 高等教育出版社,00:60-6. [6] Lu Y H, Knol J C, Linskens K, et a. Cultivation of immobilized dictyostelius for the producdon of soluble human fas ligand[j]. Appl. Microbiol. Biotechnol,004(6):47-. [7] 王颖, 何宁, 李清彪, 等. 酿酒酵母 S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究 [J]. 工业微生物,007,7():4-8. [8] 汪芳, 吴晖, 余以刚, 等. 酿酒酵母 S.cerevisiaeYQ-7 的高密度发酵 [J]. 中国酿造,00(0):-7.

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖