中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):89~98 沼泽红假单胞菌 J001 产辅酶 Q 10 摇瓶发酵条件优化 1,2 蒋世云 1 余龙江简 1 艳 (1 华中科技大学生命科学与技术学院武汉广西工学院生物与化学工程系柳州 ) 摘

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漱忧壹濮
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):89~98 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化,2 蒋世云余龙江简艳 ( 华中科技大学生命科学与技术学院武汉广西工学院生物与化学工程系柳州 4006) 摘要对沼泽红假单胞菌 J00 菌株 20ml 摇瓶发酵辅酶 Q 0 条件进行了优化结果表明其最佳初始 ph 值为 6.~7., 温度为 28~3, 摇床转速 00r/min, 摇瓶装液量为 200ml, 接种量达 0% 时可直接进入对数生长期 ; 碳源以 NaAc 较好, 氮源以 (NH 4 和 NH 4 Cl 较好, 磷源用量对考察指标影响不明显 ; 用中心组合设计响应曲面法对碳氮源用量进行了优化, 当 NaAc 浓度为.39(g/L),(NH 4 浓度为 0.38(g/L) 即碳氮比为 4/ 时, 对菌胞生长最有利 ; 当 NaAc 浓度为.70(g/L),(NH 4 浓度为 0.36(g/L) 即碳氮比为.6/ 时, 对辅酶 Q 0 产量最有利关键词辅酶 Q 0 沼泽红假单胞菌发酵条件优化中图分类号 TQ920 辅酶 Q 0 用于治疗心脏病已有 30 多年的历史 [,2] 近年来国际上, 它不仅用作药物也作食品添加剂使用这是基于其主要的两方面功能 : 线粒体呼吸链电子传递者和脂溶性的抗氧化剂它具有许多生理功效 ( 如激发能量提高免疫力因具有清除过氧化物自由基和还原 α 生育酚基而能预防低密度脂蛋白的过氧化 ) 而用于一些疾病的治疗, 诸如高血压脑血管损伤贫血症肌肉萎缩症及牙槽脓溢等 [~] 目前生产辅酶 Q 0 的方法有三种 : 动植物组织提取法化学合成法和微生物发酵法 [6~8] 微生物发酵法生产 CoQ 0 始于上世纪 70 年代, 但仅限于日本 ; 由于上世纪 90 年代以来产品需求强劲而旺销, 近年中国大陆及台湾, 韩国等投入了较大的研发力度, 成为开发的热点由于微生物细胞易于大规模培养生长, 产品完全为天然的全反式构型, 生物利用度高而且相对于化学合成法要安全高效, 产品中几乎无毒害化学物质残留, 易于分离纯化, 临床疗效较好, 因此是最有开发前景的生产方法, 也是目前生产辅酶 Q 0 采用较多的方法本研究对沼泽红假单胞菌 J00 的主要发酵条件进行了优化收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :yulongjiang@hust.edu.cn 材料与方法. 菌株沼泽红假单胞菌 J00(Rhodopseudomonaspalustris J00), 由本课题选育得到.2 培养基.2. 斜面和平板培养基三水醋酸钠 4.98g, 氯化钠 g, 硫酸铵 0.3g, 磷酸二氢钾 0.g, 三水磷酸一氢钾 0.4g, 七水硫酸镁 0.4g, 氯化钙 0mg, 一水硫酸锰 2.8mg, 七水硫酸亚铁 mg, 酵母膏 0.g, 蛋白胨 0.g, 琼脂 20g,000ml 去离子水, 将 ph 值调至 7.0, 灭菌.2.2 种子培养基和发酵培养基三水醋酸钠 4.98g, 氯化钠 g, 硫酸铵 0.3g, 磷酸二氢钾 0.g, 三水磷酸一氢钾 0.4g, 七水硫酸镁 0.4g, 氯化钙 0mg, 一水硫酸锰 2.8mg, 七水硫酸亚铁 mg, 酵母膏 0.g, 蛋白胨 0.g, 000ml 去离子水, 将 ph 值调至 7.0,2,20min 灭菌.2.3 发酵基本培养基氯化钠 g, 七水硫酸镁 0.4g, 氯化钙 0mg, 一水硫酸锰 2.8mg, 七水硫酸亚铁 mg, 酵母膏 0.g, 蛋白胨 0.g,000ml 去离子水, 将 ph 值调至 7.0,2,20min 灭菌.3 实验方法.3. 菌种活化及液体种子培养将斜面保藏试管

2 90 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 中的菌体刮下少许或吸取蜡封保存的菌液少许, 转入装有 ml 种子培养基的试管中, 于 28,2000lx 光照下以 00r/min 振荡条件下培养至微红色, 再转入装有 200ml 种子培养基的 20ml 摇瓶中于同样条件下继续培养 30~40h, 至 OD 660 值约 2.(OD=0.8g 干菌体 /L), 此时菌胞处于对数生长期, 用于发酵接种.3.2 沼泽红假单胞菌生长曲线及 CoQ 0 合成曲线的测定将上述培养至对数生长期的种子培养液按 % 接于发酵培养基中,28,2000lx 光照下以 00r/min 振荡条件下培养, 每隔 3~6 小时测定细胞生物量和菌体辅酶 Q 0 的含量以发酵时间 (h) 为横坐标, 生物量 (g/l) 辅酶 Q0 含量 (mg/g) 及产量 (mg/l) 三者为纵坐标, 绘制该菌株的生长曲线及 CoQ 0 合成曲线.3.3 发酵初始 ph 值的确定 200ml 发酵培养基装入 20ml 三角瓶中, 调节初始 ph 值为 4.,.,6.0, 6.,7.0,7.,8.0,9.0, 于 2,20min 灭菌, 按 % 的接种量接种, 在 2000lx 光照,28 下以 00r/min 振荡培养 60h, 测定 ph 值对沼泽红假单胞菌细胞生长和 CoQ 0 产量的影响.3.4 发酵温度的确定 200ml 发酵培养基装入 20ml 三角瓶中,2,20min 灭菌, 按 % 的接种量接种, 分别在 22,2,28,3,34,37,40 下以 2000lx 光照,00r/min 振荡培养 60h, 测定温度对沼泽红假单胞菌细胞生长和 CoQ 0 产量的影响.3. 接种量的确定 200ml 种子培养基装入 20ml 三角瓶中,2,20min 灭菌, 分别按 3%,%,7%, 9%,% 的接种量接种, 在 2000lx 光照,28 下以 00r/min 振荡培养 60h, 测定接种量对沼泽红假单胞菌细胞生长的影响.3.6 摇床转速的确定 200ml 发酵培养基装入 20ml 三角瓶中,2,20min 灭菌, 按 % 的接种量接种, 在 2000lx 光照,28 下分别以 0,0,00,0,200, 20r/min 振荡培养 60h, 分别测定细胞生物量, 确定最佳振荡速度.3.7 装液量的确定取 20ml 三角瓶分别装入 209,90,7,2,33,4,9ml 发酵培养基,2, 20min 灭菌, 按 % 的接种量接种, 在 2000lx 光照,28 下分别以 0,0,00,0,200,20r/min 振荡培养 60h, 分别测定细胞生物量和辅酶 Q 0, 确定最佳摇瓶装液量.3.8 碳源的确定碳源选择 : 乙酸钠苹果酸乙醇甘油于 000ml 发酵基本培养基中, 加入硫酸铵 0.3g 磷酸二氢钾 0.g 三水磷酸一氢钾 0.4g; 再分别加入不同的碳源, 添加量均为 0.%, 将 ph 值调至 7.0,2,20min 灭菌, 按 % 的接种量接种在 2000lx 光照,28 下以 00r/min 振荡培养 60h, 考擦不同碳源对沼泽红假单胞菌生长和辅酶 Q 0 产量的影响.3.9 氮源的确定氮源选择 : 酵母膏, 蛋白胨, 蛋白胨 + 酵母膏 (:), 玉米浆, 氯化按, 硫酸铵于 000ml 发酵基本培养基中, 加入 4.98g 三水醋酸钠 0.g 磷酸二氢钾和 0.4g 三水磷酸一氢钾, 再分别加入不同的氮源, 其中有机氮源添加量为 %, 无机氮添加量为 0.%; 用氢氧化钠溶液将 ph 值调至 7.0, 装瓶, 2,20min 灭菌在 2000lx 光照,28 下以 00r/ min 振荡培养 60h, 测定不同氮源对沼泽红假单胞菌生长和辅酶 Q 0 产量的影响.3.0 磷源的确定于 000ml 发酵基本培养基中, 加入 4.98g 三水醋酸钠,0.3g 硫酸铵 ; 再分别加入 0.8 不同质量浓度的三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾 :0%, 0.%,0.2%,0.3%,0.4%,0.%; 将 ph 值调至 7.0, 取 200ml 装入 20ml 摇瓶,2,20min 灭菌, 按 % 的接种量接种在 2000lx 光照,28 下以 00r/min 振荡培养 60h, 测定磷酸盐对细胞生长和辅酶 Q 0 合成的影响.3. 培养基碳源氮源响应曲面法优化采用中心组合设计及响应曲面分析法对碳源氮源二因素进行优化, 培养基其它成分为发酵基本培养基, 培养条件 :2000lx 光照,pH 温度装液量接种量摇床转速为上述测定获得的最佳条件.3.2 生物量及 CoQ 0 测定方法重量法测生物量 : 取 0ml 发酵液于 0ml 离心管中离心 ( 离心力 000g) 得湿菌体, 于 0 下干燥至恒重高效液相色谱法测辅酶 Q 0 : 先用丙酮破碎细胞再用正己烷萃取辅酶 Q 0, 萃取液依次经硅胶柱净化 C 8 柱固相萃取, 再进行高效液相色谱分析色谱条件 : 色谱柱为 Diamonsil TM ODS 2 柱 (μm,20mm 4.6mmid), 以异丙醇一甲醇 ( 体积比为 4 ) 溶液作流动相, 流速 ml/min; 标准辅酶 Q 0 作标准曲线, 检测波长为 27nm 2 结果与讨论 2. 沼泽红假单胞菌生长曲线及 CoQ 0 合成曲线在初始 ph 值 7.0,% 接种量,2000lx 光照,28 下以 00r/min 振荡条件下培养, 测定了试验菌沼泽红假单胞 J00 细胞生长曲线与辅酶 Q 0 随时间的积累曲线, 以便了解该菌株的生长特性和产物辅 Q 0 的合成规

3 2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 9 图沼泽红假单胞菌 J00 生长曲线及 CoQ 0 合成曲线 Fig. TheRhodopseudomonaspalustrisJ00gorowth curveanditscoq 0 yieldcurve :Growthcurve(biomas/g/L); :CoQ0yield curve(mg/l); :CoQ 0 contentcurve(mg/g) 律, 也为研究取样的选定提供依据, 结果如图所示结果表明, 在该培养条件下菌株 J00 有 2h 的迟缓期, 然后依次进入对数生长期和稳定生长期, 当发酵至第 h 时, 生物量为最大, 达 0.90±0.04g/L, 之后进入菌胞稳定生长期 h 左右比生长率最大为 0.06, 代时为 6.6h; 同时还可看出细胞生长在对数期时, 胞内辅酶 Q 0 含量并未达到最高, 从辅酶 Q 0 的含量曲线可见, 菌胞生长停止后, 产物的合成继续进行, 在第 60h 细胞内辅酶 Q 0 的积累量最高达到 9.3 ±.0mg/g, 同时辅酶 Q 0 产量也最高为 7.3±.0mg/L; 因此该菌株辅酶 Q 0 产物形成与菌胞生长属部分偶联型 2.2 培养条件对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 产量的影响 2.2. ph 值温度摇床转速装液量对菌株 J00 生长及 CoQ 0 产量的影响 ph 值温度摇床转速装液量对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响如图 2~4 所示结果表明, 该菌发酵 CoQ 0 最佳 ph 值为 6.~7., 温度为 28~3, 摇床转速 00r/min, 摇瓶装液量为 200ml 一般来说, 摇床转速主要影响发酵液传质 ( 均质度 ) 和溶氧量, 在本试验条件下, 由于摇瓶装液量较大, 又是实棉塞塞口, 因此转速对溶氧量影响较小, 主要是对传质产生影响进而影响该菌株的生长及产物的合成试验结果表明 ( 图 4), 摇瓶装液量较低时对试验结果影响较大当装液量小于 00ml 时随着装液量的增加辅酶 Q 0 产量增加, 当装液量大于 00ml 后辅酶 Q 0 产量相对较稳定, 以大于 80ml 装液量的辅酶 Q 0 产量较好 ;200ml 装液量处理的辅酶 Q 0 产量为 8.8±0.7mg/L 在本试验条件下, 摇瓶装液量主要影响发酵液溶氧量沼泽红假单胞菌是兼性好氧菌该菌分布于暴露光照下的泥和水中, 是较常见的紫色非硫细菌 ; 从其生境来说, 对氧要求不高, 因此过高的氧对其并非有利辅酶 Q 0 的合成需要氧的参与, 但是辅酶 Q 0 是一强的还原性化合物, 氧多或氧化还原电位高不利于其稳定性和在细胞内的积累, 因此为了提高菌胞辅酶 Q 0 产量, 在不影响辅酶 Q 0 合成对氧需要量的前 [2,4,,9] 提下尽可能地降低供氧一些研究资料表明发酵液中的溶解氧水平对菌株辅酶 Q 0 产量有重要影响 ;Sakato [2] 等研究结果认为氧化还原电位对光合细菌类球红假单胞菌辅酶 Q 0 的合成有重要影响, 发酵末期保持 200mv 有利于辅酶 Q 0 的积累图 2 ph 值温度对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.2 EfectsofpH andtemperatureonthegrowthandcoq 0 biosynthesisofrhodopseudomonaspalustrisj00 :Biomas(g/L); :CoQ 0 production(mg/l); :CoQ 0 content(mg/g)

92 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No.92008 图 3 摇床转速对沼泽红假单胞菌 J00 细胞生长及辅酶 Q 0 合成的影响 Fig.

4 92 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 图 3 摇床转速对沼泽红假单胞菌 J00 细胞生长及辅酶 Q 0 合成的影响 Fig.3 Efectofrpm ofrotaryshakeronthegrowthandcoq 0 biosynthesisofrhodopseudomonaspalustrisj00 图 4 摇瓶装液量对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.4 Efectsofliquidvolumeina20mlflaskonthe growthandcoq 0 biosynthesisofrhodopseudomonas palustrisj00 :Biomas(g/L); :CoQ 0 production(mg/l); :CoQ 0 content(mg/g) 接种量对菌株 J00 细胞生长的影响接种量对沼泽红假单胞菌 J00 细胞生长的影响如图所示结果表明, 接种量低于 7.% 时, 该菌株有约 2h 的迟缓期, 培养至 h 生物量达最大值 ; 当接种量达 0% 时 ( 接种后 OD 660 值约 0.2) 便可直接进入对数生长期, 培养至 4h 生物量便达最大值, 生物量高于其它较低接种量的处理生产上可采用 >0% 的接种量来缩短发酵周期和提高产量 2.3 不同碳源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响资料表明, 作为沼泽红假单胞菌碳源 ( 光合同化 ) 或光合作用电子供体所利用的基质有醇类脂肪酸 C 4 二羧酸氨基酸, 苯甲酸盐环己烷羧酸等 [20] 只有在补加少量酵母膏的情况下, 才可利用分子氢和硫代硫图接种量对沼泽红假单胞菌 J00 细胞生长的影响 Fig. Efectsofinoculationwithdiferentamount ofseedcultureonthegrowthofrhodopseudomonas palustrisj00 酸盐不能利用单糖糖醇和硫化物醋酸钠苹果酸乙醇甘油四种碳源都是该菌株可利用的碳源, 易于获得, 可用于生产上 ; 它们对该菌株生长和辅酶 Q 0 合成的影响如图 6 所示结果表明, 不论是生物量还是辅酶 Q 0 产量, 醋酸钠 > 苹果酸 > 乙醇 > 甘油 2.4 不同氮源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响资料表明, 沼泽红假单胞菌可利用的氮源为铵盐 [20] NH 4 Cl (NH 4 酵母膏蛋白胨酵母膏 + 蛋白胨, 玉米浆等几种氮源对沼泽红假单胞菌 J00 菌胞生长和辅酶 Q 0 合成的影响如图 7 所示结果表明, NH 4 Cl 与 (NH 4 的效果相当, 都远好于其它氮源

2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 93 图 6 不同碳源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.

磷源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响磷源对沼泽红假单胞菌 J00 菌胞生长和辅酶 Q 0 合成的影响如图 8 所示结果表明, 不同量磷源之间效果的差异不明显, 略好于未加磷源的对照, 说明培养图 7 不同氮源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.

production,mg/l;coq 0 content,mg/g 基中其它材料所带的少量磷源已基本够菌胞生长需要, 再加入少量磷源已足够 ; 通过测定培养后发酵液的 ph 值, 显示为 7.2~7., 说明该菌体发酵过程中对 ph 值影响不大, 这也是造成磷源效果不明显的原因之一图 8 磷源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.

5 2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 93 图 6 不同碳源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.6 Efectsofcarbonsourcesonthegrowthand CoQ 0 biosynthesisofrhodopseudomonas palustrisj00 A:NaAc;B:Malicacid;C:Ethanol;D:GlycerolCoQ 0 production,mg/l;coq 0 content,mg/g 2. 磷源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响磷源对沼泽红假单胞菌 J00 菌胞生长和辅酶 Q 0 合成的影响如图 8 所示结果表明, 不同量磷源之间效果的差异不明显, 略好于未加磷源的对照, 说明培养图 7 不同氮源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.7 Efectsofnitrogensourcesonthegrowthand CoQ 0 biosynthesisofrhodopseudomonas palustrisj00 A:Yeastextract;B:Peptone;C:Yeastextract+peptone; D:Cornsteepliquor;E:NH 4 Cl;F:(NH 4 CoQ 0 production,mg/l;coq 0 content,mg/g 基中其它材料所带的少量磷源已基本够菌胞生长需要, 再加入少量磷源已足够 ; 通过测定培养后发酵液的 ph 值, 显示为 7.2~7., 说明该菌体发酵过程中对 ph 值影响不大, 这也是造成磷源效果不明显的原因之一图 8 磷源对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.8 EfectsofphosphorussourcesonthegrowthandCoQ 0 biosynthesisofrhodopseudomonaspalustrisj00 Phosphorussources:(K 2 HPO 4 3H 2 O:KH 2 PO 4 =0.8 )%;CoQ 0 production,mg/l;coq0content,mg/g 2.6 对碳源氮源响应曲面法优化通过上述试验结果, 菌株 J00 的发酵培养基碳源应以 NaAc 较理想, 氮源以 (NH 4 和 NH 4 Cl 较好, 本试验选用 (NH 4 作氮源, 为此对这二因素进一步采用了响应曲面法来优化 2.6. NaAc 与 (NH 4 单因素试验结果 NaAc 与 (NH 4 单因素对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响试验结果如图 9 所示试验时, 首先固定培养基中 (NH 4 的量为 0.3g/L, 将 NaAc 的量从 0 逐步增至 8g/L, 测定结果表明当 NaAc 由 0 增至 4g/L 时, 辅酶 Q 0 产量增加较快, 之后趋于稳定 ; 第二步固定培养基中 NaAc 的量为 g/l, 将 (NH 4 的量从 0 逐步增至 0.4g/L, 测定结果表明当 (NH 4 增至 0.3g/L 时, 辅酶 Q 0 产量达最大, 之后有所下降根据上述试验结果, 进行中心组合设计各因素水平值,NaAc 与 (NH 4 两因素在中心组合设计中的各水平值如表所示

6 94 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 图 9 NaAc 与 (NH 4 对沼泽红假单胞菌 J00 生长及 CoQ 0 合成的影响 Fig.9 EfectsofNaAcor(NH 4 levelsonthegrowthandcoq 0 biosynthesisofrhodopseudomonaspalustrisj00 :Biomas(g/L); :CoQ 0 production(mg/l); :CoQ 0 content(mg/g) 表中心组合设计试验及其生物量辅酶 Q 0 含量 Table FactorialcentralcompositedesignmatrixandresponsesforCoQ 0 productionandbiomasofrhodopseudomonaspalustrisj00 Run Factors X (g/l) (g/l) Experimentalresults BiomasY (g/l) CoQ 0 productiony 2 (mg/l) Predictedresults BiomasY (g/l) CoQ 0 productiony 2 (mg/l) X :NaAc; :(NH 中心组合设计试验结果及响应曲面分析采用中心组合设计响应曲面法对 NaAc 与 (NH 4 两因素进行优化以获得沼泽红假单胞菌 J00 最大生物量或最大辅酶 Q 0 产量同时也可考察出上述两因素的交互作用试验设计及各试验处理生物量与辅酶 Q 0 产量测定值如表 2 所示通过 SASSystemforWindows 软件计算机运行, 得到反映生物量 (Y ) 或辅酶 Q 0 产量 (Y 2 ) 与 NaAc(X ) 和 (NH 4 ( ) 两因素浓度之间函数关系的回归方程 : 生物量回归方程 : Y = X X X 辅酶 Q 0 产量回归方程 : Y 2 = X X X 上述回归方程既表达了单个因素对生物量 (Y ) 或辅酶 Q 0 产量 (Y 2 ) 的作用也再现了两因素的交互作用对生物量回归方程的统计分析结果如表 2 所示, 结果表明回归模型 F 值为达到极显著水平 (P <0.0), 决定系数 R 2 为 ( 查 R 值表 :R 0 0, = 0.74,R 0.0, =0.874), 也说明回归关系极显著 ; 两因素对生物量都有极显著的正效应 (P<0.0), 其交互作用项和二次项为极显著的负效应 (P<0.0) 将设计表中两因素水平值代入回归方程得各处理生物量预测值如表 2 所列, 拟合性较好根据该回归方程所作响应曲面图和等高线图如图 0 所示同时根据计算机处理结果表明当 X =.39(g/L), =0.38(g/L) 时, 生物量 Y 有极大值 0.984(g/L) 对 X =.39(g/ L), =0.38(g/L) 进行试验验证, 生物量为.02 ± 0.04(g/L), 与预测值非常接近, 说明该回归模型优化效果较好

2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 9 表 2 沼泽红假单胞菌 J00 生物量响应面回归模型的统计分析 Table2 StatisticalanalysisoftheresponsesurfacequadraticmodelforthebiomasofRhodopseudomonas palustrisj00obtainedfrom

7 2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 9 表 2 沼泽红假单胞菌 J00 生物量响应面回归模型的统计分析 Table2 StatisticalanalysisoftheresponsesurfacequadraticmodelforthebiomasofRhodopseudomonas palustrisj00obtainedfrom experimentaldesigns Regresion DF SumofSquares R Square FValue P value TotalModel <0.000 Residual DF SumofSquares MeanSquare FValue P value LackofFit PureEror TotalEror Parameter Intercept X 2 X X 2 DF Estimatefrom Actualvalue Codeddata StandardEror tvalue P value < <0.000 图 0 碳氮源对沼泽红假单胞菌 J00 生物量影响的响应曲面及等高线分析图 Fig.0 Responsesurfaceandcontourplotsshowingtheefectoftheamountofcarbonsource NaAc 3H 2 O X (g/l)andnitrogensource(nh 4 (g/l)ontheresponsebiomasy [(gdriedbiomas)/l].theyareplotsoftheregresionequation 对辅酶 Q 0 产量回归方程的统计分析结果如表 3 所示, 结果表明回归模型 F 值为达到极显著水平 (P<0.0), 决定系数 R 2 为 ( 查 R 值表 : R 0.0, =0.74,R 0.0, =0.874), 也说明回归关系极显著 ; 两因素对辅酶 Q 0 产量都有极显著的正效应 (P< 0.0), 其交互作用不显著 (P>0.0), 二次项为极显著的负效应 (P<0.0) 将设计表中两因素水平值代入回归方程得各处理辅酶 Q 0 产量预测值如表 2 所列, 拟合性较好根据该回归方程所作响应曲面图和等高线图如图所示同时根据计算机处理结果表明当 X =.70(g/L), =0.36(g/L) 时, 辅酶 Q 0 产量 Y 2 有极大值 9.2(mg/L) 对 X =.70(g/L), =0.36 (g/l) 进行试验验证, 辅酶 Q 0 产量为 9.8 ±0.6(mg/ L), 与预测值非常接近, 说明该回归模型优化效果较好培养基中各营养物质不仅要求有适宜的浓度来满足微生物需要, 过高过低都不利, 而且之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和 ( 或 ) 代谢产物的形成和积累, 其中碳氮比影响较大本试验的碳源不仅是微生物生长所需也是产物辅酶 Q 0 的原料物质, 因此显得尤为重要从优化结果来看, 该菌株生物量最大时的碳氮比为 4/, 该菌株辅酶 Q 0 产量最高时的碳氮比为.6/

8 96 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 表 3 沼泽红假单胞菌 J00 辅酶 Q 0 产量响应面回归模型的统计分析 Table3 StatisticalanalysisoftheresponsesurfacequadraticmodelforCoQ 0 productionof RhodopseudomonaspalustrisJ00obtainedfrom experimentaldesigns Regresion DF SumofSquares R?Square FValue P?value TotalModel <0.000 Residual DF SumofSquares MeanSquare FValue P value LackofFit PureEror TotalEror Parameter Intercept X X2 X 2 DF Estimatefrom Actualvalue Codeddata StandardEror tvalue P value < <0.000 图碳氮源对沼泽红假单胞菌 J00 辅酶 Q 0 产量影响的响应曲面及等高线分析图 Fig. Responsesurfaceandcontourplotsshowingtheefectoftheamountofcarbonsource NaAc 3H 2 O X (g/l)andnitrogensource(nh 4 (g/l)ontheresponsecoq 0 productiony 2 [(mgcoq 0 )/L].Theyareplotsoftheregresionequation 3 结论通过以生物量及辅酶 Q 0 产量为考察指标对沼泽红假单胞菌 J0020ml 摇瓶发酵条件进行了优化, 结果表明其发酵最佳 ph 值为 6.~7., 温度为 28~ 3, 摇床转速 00r/min, 摇瓶装液量为 200ml, 接种量达 0% 时 ( 接种后 OD 660 值约 0.2) 可直接进入对数生长期 ; 碳源以 NaAc 较好, 氮源以 (NH 4 和 NH 4 Cl 较好, 磷源用量对考察指标影响不明显 ; 用中心组合设计响应曲面法对碳氮源用量进行了优化, 得生物量 (Y ) 与 NaAc(X ) 浓度 (NH 4 浓度 ( ) 关系的回归方程 :Y = X X , 决定系数 R 2 为 ; 和辅酶 Q 0 产量 (Y 2 ) 与 NaAc 浓度 (X ) (NH 4 浓度 ( ) 关系的回归方程 :Y 2 = X X , 决定系数 R 2 为当 X =.39 (g/l), =0.38(g/L) 即碳氮比为 4/ 时, 生物量 Y 有极大值 :0.984(mg/L), 经试验验证生物量为. 02 ±0.04(g/L), 与预测值非常接近, 说明生物量与碳氮源回归模型优化效果较好 ; 当 X =.70(g/L), =0.36(g/L) 即碳氮比为.6/ 时, 辅酶 Q 0 产量 Y 2 有极大值 9.2(mg/L), 经试验验证辅酶 Q 0 产量为 9.8 ±0.6(mg/L), 与预测值非常接近, 说明辅酶 Q 0 产量与碳氮源回归模型优化效果也较好

9 2008,28(9) 蒋世云等 : 沼泽红假单胞菌 J00 产辅酶 Q 0 摇瓶发酵条件优化 97 参考文献 []KatagiriT. AppraisalofcoenzymeQ 0 asadrugforthe managementofcardiacfailure.kisotorinshyo,996,30: 9~67 [2] Ken S, MasanoriW, Yoshito S, etal. Applicationsof photosyntheticbacteriaformedicalfields. JBiosciBioeng (Japan),,200,00:48~488 [3]CraneFL.BiochemicalFunctionsofCoenzymeQ 0.JAmCol Nutr,200,20:9~98 [4]MikaelT,JerkerO,GustavD.Metabolism andfunctionof coenzymeq.biochimicaetbiophysicaacta,2004,660:7 ~99 []ThomasSR,NeuziLJ,StockerR.Cosupplementationwith coenzymeqpreventstheprooxidantefectofalpha tocopherol and increases the resistance ofldl to transition metal dependentoxidationinitiation.arteriosclthrombvascbiol, 996,6:687~696 [6]EernD,KeinanE.Totaloflinearpolyprenoids3Synthesisof ubiquinones via paladium Catalyzed oligomerization of monoterpenemonomers.jamchemsoc,988,0:436~ 4362 [7] WestD D. Synthesisofcoenzyme Q 0 ubiquinone. US: A,2003 [8]WestD D.SynthesisofcoenzymeQ 0, ubiquinone. US: 07A,2004 [9] 刘萍, 邱卫华, 郑亚安, 等. 前体物质对辅酶 Q0 生物合成的影响. 食品与发酵工业,200,3:~ LiuP,QiuW H,ZhengYA,etal.FoodandFermentation Ind,200,3: ~ [0] 吴祖芳, 堵国成, 陈坚. 放射型根瘤菌 WSH260 生产辅酶 Q0 的摇瓶发酵条件. 无锡轻工大学学报,2003,22:6~ 69 WuZF,DuGC,ChenJ.JWuxiUnivLightInd,2003,22: 6~69 []ChoiGS,KimYS,SeoJH,etal.Restrictedelectronflux increases coenzyme Q 0 production in Agrobacterium tumefaciensatcc442.procesbiochem,200,40:322~ 3229 [2]SakatoK,TanakaH,ShibataS,etal.Agitation~aeration studiesoncoenzymeq0productionusingrhodopseudomonas sphaeroides.biotechnolapplbiochem,992,6:9~28 [3]SasakiK,TanakaT,NagaiS,Useofphotosyntheticbacteria forproductionofscpandchemicalsfrom organicwastes.in: BioconversionofWasteMaterialstoIndustrialProducts(Martin AM,Ed);2ndedNew York,USA:BlackieAcademicand Profesionals, ~29 [4]WuZ F, DuG C, Chen J. Efectsofdisolved oxygen concentrationanddo statfeedingstrategyoncoq 0 production withrhizobium radiobacter.worldjmicrobiolbiotechnol, 2003,9:92~928 []YenH,ChiuC.Theinfluencesofaerobic darkandanaerobic light cultivation on CoQ 0 production by Rhodobacter sphaeroidesinthesubmergedfermenter.enzymeandmicrobial Technology,2007,4:600~604 [6]HaS,KimS,SeoJ,etal.Optimizationofcultureconditions andscale up to pilotand plantscalesforcoenzyme Q 0 production by Agrobacterium tumefaciens. ApplMicrobiol Biotechnol,2007,74:974~980 [7] Ha S, Kim S, Seo J, etal. Controling the sucrose concentrationincreasescoenzymeq 0 productioninfed batch culture of Agrobacterium tumefaciens. Appl Microbiol Biotechnol,2007,76:09~6 [8] 袁静, 魏泓. 光合细菌产辅酶 Q 0 发酵条件的研究. 氨基酸和生物资源,2003,2:24~26 YuanJ,WeiH.AminoAcids&BioticResources,2003,2: 24~26 [9] Yoshida H, KotaniY, OchiaiK, etal. Production of ubiquinone 0usingbacteria.JGenApplMicrobiol,998, 44:9~26 [20] 刘如林, 刁虎欣, 梁风来. 光合细菌及其应用. 北京 : 中国农业科学技术出版社,99 Liu R L, Diao H X, Liang F L. China Agricultural Science&TechnologyPres,Beijing,99

10 98 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No OptimizationofShaking FlaskCultureConditionsforCoQ 0 Production byrhodopseudomonaspalutrisj00 JIANGShi yun,2 YULong jiang JIANYan (ColegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan ,China) (2DepartmentofBiologicalandChemicalEngineering,GuangxiUniversityofTechnology,Liuzhou 4006,China) Abstract Thecultureconditionsin20mlflaskfortheproductionofCoQ 0 byrhodopseudomonaspalutris J00wereinvestigated.TheresultsshowedthattheoptimalinitialpH,temperature,rpm ofrotaryshaker, mediumvolumeintheflaskandinoculum ssizewere6.~7.,28~3,00r/min,200mland0%, respectively.thesuitablecarbonsourcewasnaacandsuitablenitrogensourceswere(nh 4 andnh 4 Cl. ButtheefectsofphosphorussourceonthecelgrowthandCoQ 0 productionwereinsignificant.withtheaidof responsesurfacemethod,theoptimumconcentrationsofnaacand(nh 4 were.39(g/l)and0.38(g/ L)forthegrowthofbiomas,respectively,whichtheratioofC/Nwas4/;andtheoptimumconcentrationsof NaAcand(NH 4 were.70(g/l)and0.36(g/l)fortheproductionofcoq 0,respectively,whichthe ratioofc/nwas.6/. Keywords CoQ 0 Rhodopseudomonaspalutris Cultureconditions Optimization

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):89~98 沼泽红假单胞菌 J001 产辅酶 Q 10 摇瓶发酵条件优化 1,2 蒋世云 1 余龙江 简 1 艳 (1 华中科技大学生命科学与技术学院武汉 广西工学院生物与化学工程系柳州 ) 摘

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):89~98 沼泽红假单胞菌 J001 产辅酶 Q 10 摇瓶发酵条件优化 1,2 蒋世云 1 余龙江简 1 艳 (1 华中科技大学生命科学与技术学院武汉广西工学院生物与化学工程系柳州 ) 摘