32 27, Vol. 28, No. 1 食品科学生物工程 Key words:glutathione;saccharomyces cerevisiae;biomass;fermentation 中图分类号 :TS21.3 文献标识码 :A 文章编号 :-663(27) (gluta

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易陶
7 years ago
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1 生物工程食品科学 27, Vol. 28, No 郑丽雪 1, 胡耀辉 1, 齐斌 2, * (1. 吉林农业大学食品工程学院, 吉林长春 138; 2. 常熟理工学院生物与食品工程系, 江苏常熟 2155) : 本实验对酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)cs1515 产的培养条件进行了初步研究, 确定了其最佳培养基组成为 : 葡萄糖为 5% 酵母膏 1.2% 硫酸铵.6% 硫酸镁.2% 磷酸二氢钾.1%; 当发酵液初始 ph 为 6. 装液量 5%~6% 振荡速度 3r/min 时, 经过 24h 振荡培养后, 的产量为.2mg/L : ; 酿酒酵母 ; ; 发酵 Optimization of Culture Conditions for Glutathione by Saccharomyces cerevisiae ZHENG Li-xue 1,HU Yao-hui 1,QI Bin 2, * (1.School of Food Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 138, China; 2.Department of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 2155, China) Abstract :The production condition for glutathione by Saccharomyces cerevisiae CS1515 was investigated. The results showed that the medium composition was that, glucose 5%, yeast extract 1.2%, (NH4)2SO4.6%, MgSO4.2%, K2HPO4.1%. The optimal conditions for producing glutathione occured at initial ph6., broth volume 5%~6% and rotational speed 3 r/min. After 24 hours fermentation, the glutathione produced by Saccharomyces cerevisiae was.2 mg/l. 收稿日期 : * 通讯作者作者简介 : 郑丽雪 (182-), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品生物技术酒精度 (V/V, %) 发酵枣酒的最佳工艺参数为 : 主发酵的枣汁 SSC 含量为 2%, 主发酵时 ph 值为 4.5; 葡萄酒酵母最佳接种量是 1 6 个 /ml; 控制主发酵温度为 22~28, 添加 mol/l 的 SO2 可达最佳发酵状态发酵产品酒精度为.4% 总糖为 56g/L 总酸为 7. 5 / L, 色泽鲜红, 有枣香味参考文献 : Fig.8 经主发酵后的和田玉枣醪液, 再经后发酵和调配后配制成的和田玉枣酒酒精度.4% 总糖 56g/L 总酸 7. 5 g / L, 色泽呈鲜红色, 有枣香味 3 结论主发酵时间 (d) 图 8 不同 SO2 添加量的酒精度变化 Changes of alcohol content with different SO2 content 通过对和田玉枣发酵的研究后发现, 新疆和田玉枣 [1] LACHAT C, 马兆端. 苹果酒酿造技术 [M]. 北京 : 中国轻工业出版社, 24: [2] 李华. 现代葡萄酒工艺学 [M]. 西安 : 陕西科学技术出版社, 15: [3] 何国庆. 食品发酵与酿造工艺学 [M]. 北京 : 中国农业出版社, 23: [4] 国家标准局信息分类编码研究所. GB/T 食品中还原糖的测定 [S]. 北京 : 中国标准出版社, 23: [5] 国家标准局信息分类编码研究所. GB/T 葡萄酒果酒通用试验方法 [S]. 北京 : 中国标准出版社, 14: [6] 郑佩, 林勤保. 枣酒发酵过程中不同加糖方式的研究 [J]. 食品工业科技, 27, 28(1): [7] 张宝善, 陈锦屏, 杨莉, 等. 红枣酒发酵工艺研究 [J]. 中国农业科学, 24, 37(1): 2-8.

2 32 27, Vol. 28, No. 1 食品科学生物工程 Key words:glutathione;saccharomyces cerevisiae;biomass;fermentation 中图分类号 :TS21.3 文献标识码 :A 文章编号 :-663(27) (glutathione,gsh) 是一种由 L- 谷氨酸 L- 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽物 [1] 质, 广泛存在于动植物体内作为生物机体内重要的活性巯基物质, 对于维持生物体内合适的氧化还原环境起着至关重要的作用临床上, 可以迅速提高机体免疫力, 在抗氧化抗辐射清除自由基解毒促进铁质吸收等方面具有良好的效果 ; 在食品加工领域, 具有增强食品营养价值和强 [2-3] 化食品风味等功能目前 GSH 的生产方法主要有提取法化学合成法酶法和直接发酵法提取法由于原料不易获得且 GSH 在组织中的含量极低, 制取的 G S H 纯度和收率不高, 因此该法的实际应用价值不大化学合成法反应步骤多反应时间长分离困难操作过程复杂, 极易造成环境污染自 2 世纪六十年代起, 采用生物法进行 G S H 的合成引起广泛的关注生物合成法主要包括微生物酶法和直接发酵法, 其中微生物直接发酵法只需供给微生物生长代谢所需的营养物质 ( 碳源氮源和无机盐等 ) 即可实现 GSH 在胞内的积累国内外学者已开展了利用细 [4] [5-8] 菌和酵母生产 GSH 的研究, 其中酵母由于具有容易培养生长速度快和 G S H 含量高等优点, 已日渐成为 GSH 工业化生产的首选菌株, 被认为是最具潜力的生产 [] 方法之一本实验对一株高产的酿酒酵母变异菌株的培养条件进行了初步研究 1 材料与方法 1.1 材料菌种酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)cs1515 本实验室保存培养基 PDA 培养基 : 马铃薯 2g 葡萄糖 2g 琼脂 2g 蒸馏水 1ml 马铃薯去皮, 切块煮沸 3min, 纱布过滤, 加入葡萄糖和琼脂, 熔化后补足水至 1 m l, 1 灭菌 3min 基础培养基 : 葡萄糖 4 g 蛋白胨 1 g 硫酸铵 5g 磷酸二氢钾 2g 硫酸镁.2g 硫酸锌.1g 蒸馏水 1ml 发酵培养基 : 葡萄糖 5 g 酵母膏 1 2 g 硫酸铵 6g 磷酸二氢钾 1g 硫酸镁.2g 蒸馏水 1ml 试剂标准品购于美国 Sigma 公司, 其余均为国产分析纯试剂 1.2 方法种子培养从斜面试管中挑取一环菌种在斜面培养上划线, 置于 28 的培养箱中活化培养 48h, 然后用接种环挑取一环活化菌种接入种子培养液中,2 8 摇床转速 25r/min 装液量为 1ml/5ml 条件下振荡培养 2h 后备用分析方法测量用移液管吸取 1ml 发酵液于 4r/min 离心 15min, 弃上清液, 洗涤菌体 3 次后得菌体, 置于烘箱中, 于 1 5 烘干至恒重, 称量 G S H 含量的测定发酵液离心 (4r/min 15min) 洗涤除去上清液后得到湿菌体, 然后加入 4% 乙醇溶液于 3 振荡抽提 2h, 离心,H P L C 法分析上清液中的 G S H 含量 H P L C 条件色谱仪器为美国 Waters 公司 6 型高效液相色谱仪, 色谱柱为 Inertsil ODS-3 15mm 4.6mm 5μm, 流速 1ml/min, 柱温 3, 进样量 1μl, 流动相.5mol/L 磷酸二氢钾的溶液 ( 用磷酸调节 ph 至 3.)- 甲醇 (7:3, V/V) 2 结果与分析 2.1 培养基组成的优化碳源对酵母合成的影响碳源是构成菌体碳架及微生物生长的主要能量来源, 是细胞内的贮藏物质, 在微生物生长和代谢过程中的作用比较复杂本实验研究了几种碳源对酿酒酵母产 G S H 的影响在基础培养基中分别加入不同的碳源,28 下培养 2h, 测定酵母中的含量, 结果见图 1 由图 1 可以看出酵母 CS1515 能够利用各种碳源合成 G S H, 其中葡萄糖为最佳碳源, 随着葡萄糖的浓度的提高 GSH 生物合成能力增强, 当葡萄糖的添加量为 5% 时, 产量最高为 72.7mg/L, 继续提高葡萄糖浓度, 酿酒酵母的下降,G S H 的产量降 [1] 低, 表明过多的葡萄糖会引起葡萄糖效应氮源对酵母合成的影响有机氮源对酵母合成的影响在 5 % 的初始葡萄糖浓度时, 以不加氮源的基础培

3 (mg/ml) 生物工程食品科学 27, Vol. 28, No 葡萄糖果糖木糖蔗糖乳糖麦芽糖硫酸铵氯化铵磷酸氢二铵碳源的浓度 (%) 无机氮源浓度 (%) Fig.1 图 1 碳源对酵母合成的影响 Effects of carbon sources on production of GSH Fig.3 图 3 无机氮源对酵母合成的影响 Effects of inorganic nitrogen on production of GSH 养基为对照, 考察了有机氮源酵母膏蛋白胨酵母膏与蛋白胨混合物对 GSH 合成的影响, 结果如图 2 所示从图 2 中可以看出, 氮源对 GSH 生物合成的影响较大酵母膏为酿酒酵母 CS1515 合成的最佳氮源, 当添加量为 1.2%, 达最高产量为 77.8mg/L 因为酵母膏中不但含有菌体生长繁殖所需的氮素, 还含有 GSH 合成所需的调节剂及前体物质等表 1 不同金属离子对酵母合成的影响 Table 1 Effects of various cations on production of GSH 金属离子金属离子 Mg K Cu Li Fe Ca Zn Pb Na 对照酵母膏蛋白胨酵母膏 : 蛋白胨 =1:1 对照验结果表明 Mg 2+ 和 K + 能够促进酿酒酵母 CS1515 的生长及的合成,F e 2+ Z n 2+ C a 2+ N a + 对菌体产影响不大, 而 Li + Cu 2+ 和 Pb + 对的合成具有抑制作用金属离子及相对应的阴离子是微生物生长必不可少的营养物质, 它们在机体中不仅维持细胞结构的稳定并调节细胞渗透压, 还参与多种酶的组 [] 成, 激活或抑制酶的活性 Mg 2+ 和 K + 的最佳浓度分别为.2% 和.1% 2.2 发酵条件的确定有机氮源浓度 (%) 图 2 有机氮源对酵母合成的影响 Fig.2 Effects of organic nitrogen on production of GSH 无机氮源对酵母合成的影响在 5% 的初始葡萄糖浓度, 酵母膏 1.2% 时, 考察了三种无机氮源 (NH 4) 2SO4 NH 4Cl (NH4) 2HPO4 对酿酒酵母合成的影响, 实验结果如图 3 所示结果表明,(NH4) 2SO4 对的合成具有明显的促进作用, 当 (NH 4) 2SO4 的添加量为.6% 时, 的产量达 7.8mg/L 微生物对无机氮源的吸收一般比有机氮源快, 对稳定和调节发酵过程中的 ph 具有重要作用金属离子对酵母合成的影响本实验以葡萄糖酵母膏和硫酸铵为培养基的基本成分, 分别加入.5% 的金属离子, 测定金属离子对酿酒酵母合成的影响, 实验结果如表 1 所示实初始 ph 对酵母合成的影响培养基的 ph 值影响细胞膜表面带电基团的解离及其微观结构, 进而影响营养物的吸收及代谢物的分泌, 导致微生物的生长和代谢发生变化, 以致影响菌 ph 图 4 初始 ph 对酵母合成的影响 Fig.4 Effects of initial ph on production of GSH

4 (mg/ml) (mg/ml) 34 27, Vol. 28, No. 1 食品科学生物工程体的生长和目的产物的合成调节发酵培养基的初始 ph5.~6.5,28 下培养 24h, 观察初始 ph 对微生物生长和产酶影响, 结果如图 4 从图 4 可以看出, 偏酸 (5.5~6.) 环境有利于的合成,pH6. 最佳, 在整个发酵过程中控制 ph 在 5.5~6. 时, 的产量明显提高装液量对酵母合成的影响装液量 (%) 图 5 装液量对酵母合成的影响 Fig.5 Effects of broth volume on production of GSH 从图 5 中可以看出, 随着装液量的增加,G S H 的产量减小, 这主要是由于在低装液量时, 供氧情况较好, 因而菌体生长旺盛, 在相同的发酵时间内所获得的细胞干重较大由于 4% 到 6% 的 GSH 产量变化较小, 为了提高设备利用率, 最佳装液量可在 5%~6% 之间选择振荡速度对酵母合成的影响溶氧是好氧微生物生长必需的营养物质之一, 更是影响其进行物质生产和能量代谢的关键环境因素之一, 在发酵过程中受通气量和振荡速度以及发酵液性质等诸多因素的限制通常在空气流量一定的情况下, 振荡速度的变化直接影响氧在发酵液中的传质效率, 进而影响正常的细胞生长和代谢产物的形成本实验在上述确定的发酵条件的基础上, 考察了不同振荡速度对谷胱甘肽产量的影响, 结果如表 2 所示结果表明,G S H 产量随着振荡速度增加而提高, 因为振荡速度增加, 培养液中的溶氧增加, 有利于菌体生长振荡速度超过 3r/min 时, 发酵液中的产量不再发生明显变表 2 振荡速度对酵母合成 GSH 产量的影响 Table 2 Effects of rotational speed on production of GSH 转速 (r/min) 发酵液中 GSH 含量 (mg/l) (mg/ml) 化, 表明酿酒酵母 CS1515 生物合成 GSH 所需要的溶氧水平较高发酵时间对酵母合成的影响据资料报道,G S H 为微生物的次级代谢产物, 是微生物生长到稳定期后所形成的复杂化合物, 因此, 发酵 [13] 时间对 GSH 累积尤为重要在优化的发酵条件基础上, 考察发酵时间对产量的影响, 结果如图 6 所示, 试验结果表明, 酵母培养 2 2 h 后, 达最高, 然后随着发酵时间延长, 增长缓慢, 而发酵液中的产量最高出现在 24h, 表明 GSH 为酿酒酵母稳定期产生并大量积累, 继续延长发酵时间,G S H 反而降低, 表明 G S H 又参与了其他代谢反应而被消耗时间 (h) 图 6 时间对酵母合成的影响 Fig.6 Effects of culture time on production of GSH 3 结论以酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)cs1515 作为研究对象, 通过单因素试验初步确定了有利于生产的培养基组成实验结果表明 : 酿酒酵母 CS1515 能够较好地利用葡萄糖作为碳源, 且葡萄糖的初始浓度为 5% 时 GSH 的产量较高 ; 混合氮源有利于 GSH 积累 ; 金属离子对 G S H 的产生影响较大,M g 2+ 和 K + 能够促进酿酒酵母 CS1515 的生长及的合成, 最适添加量分别为.2% 和.1%, 而 Li + Cu 2+ 和 Pb + 对的合成具有抑制作用利用上述优化的培养基对酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)cs1515 合成的培养条件进行了初步探讨, 确定了最适发酵条件为 : 在 2 8 条件下, 当发酵液的初始 ph 为 6. 装液量 5%~6% 振荡速度为 3r/min 时, 经过 24h 的培养, 的产量为.2mg/L 参考文献 : [1] 陈金永, 李朕杰. 一种新型饲用添加剂 [J]. 中国动物保

5 生物工程食品科学 27, Vol. 28, No 易弋 1, 伍时华 1, 蒋常德 1,2, 黄翠姬 1, 黎娅 1 (1. 广西工学院生物与化学工程系, 广西柳州 5456; 2. 广西大学化学化工学院, 广西南宁 534) : 利用木薯粉进行柠檬酸发酵, 研究了发酵温度起始糖浓度起始 ph 值摇瓶发酵的装液体积对柠檬酸发酵的影响, 确定了柠檬酸批式发酵的优化条件, 即 :35 的发酵温度,5ml 的摇瓶发酵装液体积,5. 的发酵起始 ph 值,% 的起始糖浓度在此优化条件下进行了木薯粉与糖蜜混合配比的发酵实验, 最终确定了木薯粉与糖蜜混合的最佳配比为 :1 : 木薯粉 ; 糖蜜 ; 混合发酵 ; 柠檬酸 Study on Mixed Fermentation of Citric Acid with Manioc Flour and Sugarcane Molasses YI Yi 1,WU Shi-hua 1,JIANG Chang-de 1,2,HUANG Cui-ji 1,LI Ya 1 (1.Department of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Technology, Liuzhou 5456, China; 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 534, China) Abstract :The manioc flour was fermented to produce citric acid. The effects of fermenting temperature, initial sugar concentration, initial ph and liquid volume on the fermentation to produce citric acid were detected. The optimum fermenting conditions were: fermentation temperature 35, initial ph5., initial sugar concentration % and 5 ml of fermentation liquid volume. Under these conditions, the manioc flour and sugarcane molasses were mixed according to different proportions to ferment citric acid. The results showed the rate of :1 of manioc flour and sugarcane molasses was the best condition for mixed fermentation of citric acid. Key words:manioc flour;sugarcane molasses;mixed fermentation;citric acid 中图分类号 :TS21.3 文献标识码 :A 文章编号 :-663(27) 收稿日期 : 作者简介 : 易弋 ( 1 7-), 男, 讲师, 博士, 研究方向为分子生物学及微生物发酵健, 25(5): [2] 王大慧, 卫功元. 的应用前景及生产研究现状 [J]. 化学与生物工程 24(3): 1-. [3] 蔡俊. 的研究进展 [J]. 粮食与饲料工业, 2(1): [4] LI Y, CH J, MAO Y Y, et al. Effect of additives and fed batch cultures trategies on the production of glutathione by recombinant Escherichia coli[j]. Process Biochem, 18, 33(7): 7-7. [5] 谢雷波. 利用酿酒酵母生物合成及其分离纯化的初步研究 [D]. 南昌 : 南昌大学, 25. [6] ALFAFARA C G, MIURA K, SHIMIZU H, et al. Cysteine additions trategy for maximumglutathione production in fes batch culture of Saccharomyce scerevisiae[j]. Appl Microbiol Biotechnol, 12, 37: 1-6. [7] LI Y, CH J, ZHOU D, et al. The effect of environmental condition and glucose feedingstrategy on glutathione production[j]. Chinese Journal of Biotechnology, 18, (2): [8] SMYTH J F, BOWMAN A, PERREN T, et al. Glutathione reduced the toxicity and improves quality of life of women diagnosed with ovarian cancer treated with cisp-latin:results of a double-blind,randomised trial[j]. Ann Oncol, 17, 8(6): [] 李华钟, 林金萍, 李寅, 等. 的生物合成 [J]. 中国医药工业杂志, 2, 31(5): [1] 童群义, 王国成, 堵国成, 等. 补料方式对酵母菌生产的影响 [J]. 23, 33(3): 肖冬光. 微生物工程原理 [M]. 北京 : 中国轻工业出版社, 26. [] 孙俊良. 酶制剂生产技术 [M]. 北京 : 科学技术出版社, 24. [13] 陈坚, 卫功元, 李寅, 等. 微生物发酵法生产 [J]. 无锡轻工大学学报, 24, 33(5): -.

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖

32 27, Vol. 28, No. 1 食品科学 生物工程 Key words:glutathione;saccharomyces cerevisiae;biomass;fermentation 中图分类号 :TS21.3 文献标识码 :A 文章编号 :-663(27) (gluta

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