左勇等 : 红霉素产生菌的诱变及培养基优化研究 15 25mL 的试管中, 放入超声波清洗器中, 水淹没至试管 2/3 左右, 进行超声波处理, 超声波功率分别为 200W 300W 400W, 诱变时间分别为 0min 3min 6min 9min 12min 15min 18min 21min

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偕郁
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1 2012 年 2 月四川理工学院学报 ( 自然科学版 ) JournalofSichuanUniversityofScience&Engineering(NaturalScienceEdition) Vol 25 No 1 Feb 2012 文章编号 : (2012) 红霉素产生菌的诱变及培养基优化研究左勇, 李杨, 任永利, 鞠帅, 谢晖, 祁峰 ( 四川理工学院生物工程学院, 四川自贡 ) 摘要 : 以红色糖多孢菌 08L 作为出发菌株进行诱变, 选育高产菌株结果表明, 诱变得到的 UL5 菌株发酵水平比出发菌株提高 12 6% 再通过培养基优化, 其组成为淀粉 3%, 糊精 3%, 葡萄糖 2%, 黄豆饼粉 3%, 玉米浆 1%, 硫酸铵 0 15%, 碳酸钙 0 6%, 磷酸二氢钾 0 02% 的条件下,UL5 菌株在诱变的基础上, 发酵水平再提高 15 2% 关键词 : 红色糖多孢菌 ; 诱变 ; 正交实验 ; 发酵中图分类号 :TQ465 5 文献标识码 :A 红霉素 (erythromycin,er) 是红色糖多孢菌 (Sachar opolysporaerythraea) 的次级代谢产物, 为十四元大环内酯类抗生素, 包括 ErA~ErF [1],ErA 的抑菌活性最高它的抗菌谱和青霉素 G 相似, 特别是对抗酸杆菌革兰氏阳性细菌大病毒及立克次氏体有抗菌活性, 是治疗溶血性链球菌感染和耐药性金黄色葡萄球菌感染所引起疾病的首选药物, 同时红霉素衍生物的生产, 进一步刺激了母体红霉素的需求 [2 4] 影响红霉素发酵的主要因素是菌种的质量, 其优劣对红霉素发酵工业有极大的影响目前, 我国红霉素的发酵工业与国外相比还有较大的差距, 现在国外红霉素发酵单位已达到 8000μg/mL 以上, 而国内大多企业红霉素发酵水平却一直在 4000~5000μg/mL 左右 [5] 因此, 本文拟研究红霉素生产菌种的改良, 在此基础上优化红霉素培养基组成, 以达到提高红霉素发酵单位, 降低红霉素生产成本, 增强我国红霉素的国际市场竞争能力 1 材料与方法 1 1 出发菌株红色糖多孢菌 (Sacharopolysporaerythraea)08L: 实验室分离纯化得到 1 2 培养基改进高氏培养基 : 可溶性淀粉 2%,NaCl0 05%, 硝酸钾 0 1%, 磷酸二氢钾 0 05%, 硫酸镁 0 05%, 硫酸亚铁 0 001%, 重铬酸钾 (70~80μg/mL), 青霉素 (2 5~3 μg/ml), 琼脂 1 5~2 5%,pH7 4~7 6(NaOH 调 ) 发酵培养基 : 黄豆饼粉 3 0%, 淀粉 4 0%, 糊精 3 0%, 硫酸铵 0 2%, 碳酸钙 0 6%, 葡萄糖 1 0%, 磷酸二氢钾 0 04%,pH6 8(NaOH 调 ) 改进斜面培养基 : 可溶性淀粉 1%, 硫酸铵 0 3%, 玉米浆 1 2%,NaCl0 3%, 碳酸钙 0 3%, 琼脂 1 5~ 2 5%, 重铬酸钾 (70~80μg/mL), 青霉素 (2 5~3μg/mL), ph7 5(NaOH 调 ) 种子培养基 : 淀粉 3 0%, 黄豆饼粉 2 5%, 蛋白胨 0 5%, 糊精 3 0%, 葡萄糖 1 0%,NaCl0 4%, 硫酸铵 0 75%, 碳酸钙 0 6%, 硫酸镁 0 025%, 磷酸二氢钾 0 02%,pH7 5(NaOH 调 ) 1 3 诱变方法对红霉素产生菌的孢子进行超声波氯化锂 ( 分别采用在孢子悬液中加入适量的氯化锂和在培养基中加入适量的氯化锂两种方法 [6] ) 单一诱变在此基础上, 将诱变得到的实验菌株用超声波氯化锂进行复合诱变, 选取高产菌株 [7 9] 超声波诱变法分别取 10mL 出发菌株 08L 的菌悬液于 33 支收稿日期 : 作者简介 : 左勇 (1972 ), 男, 重庆万州人, 副教授, 主要从事生物工程和生物制药方面的研究,(E mail)sgzwoyong@tom.com

2 左勇等 : 红霉素产生菌的诱变及培养基优化研究 15 25mL 的试管中, 放入超声波清洗器中, 水淹没至试管 2/3 左右, 进行超声波处理, 超声波功率分别为 200W 300W 400W, 诱变时间分别为 0min 3min 6min 9min 12min 15min 18min 21min 24min 27min 30min 氯化锂诱变法方法 1: 菌种在培养过程中诱变, 分别取改进高氏培养基 90mL 于 7 个 250mL 的锥形瓶中, 再分别加入 10mL 浓度为 3 0% 6 0% 9 0% 12 0% 15 0% 18 0% 21 0% 的氯化锂溶液, 灭菌后制成平板方法 2: 菌种诱变后再培养, 取 7 支 25mL 的试管分别加入浓度为 0 3% 0 6% 0 9% 1 2% 1 5% 1 8% 2 1% 的氯化锂溶液各 9mL, 再各加入孢子悬液 1mL, 在振荡培养箱中振荡 3~4h 超声波 - 氯化锂复合诱变复合诱变采用四因素三水平正交表法, 取 10 支 25 ml 的试管各加入 9mL 菌悬液, 然后按正交表加入灭菌的氯化锂溶液或无菌水, 在振荡培养箱中振荡 3~4h 后再进行超声波处理, 最后涂布在相应的平板上 1 4 培养条件平板 :33 培养 7d 斜面:33 培养 7d 种子摇瓶 :33 培养 2d, 摇瓶转速 220r/min 发酵摇瓶:31 培养 2d,33 培养 3d, 摇瓶转速都为 220r/min 1 5 红霉素生物效价测定红霉素生物效价测定采用管碟法 [10] 2 结果与讨论 2 1 诱变结果超声波诱变结果分别移取 10mL 红色糖多胞菌孢子悬液装入容量为 25mL 的无菌试管中, 在不同功率的超声波处理后涂布于平板上,33 恒温培养 3~4d, 观察各平板上菌落生长状况, 统计菌落数, 超声波诱变致死率见图 1 由图 1 可知, 随着超声波诱变时间的增长, 红色糖多胞菌的致死率都在不断的增加 ; 在 3 个不同功率的超声波诱变中, 超声波功率为 200W 时, 随着诱变时间的增长, 致死率上升得不明显, 诱变效果不显著 ; 超声波功率为 400W 时, 红色糖多胞菌很快就全部致死, 反而没有达到诱变效果 ; 超声波功率为 300W 时, 诱变时间 20 min, 致死率接近 83%, 且平板上的红色糖多胞菌菌落大小不均一, 诱变效果较好图 1 超声波诱变致死率曲线氯化锂诱变结果根据氯化锂诱变法和 1 4 红色糖多胞菌培养条件进行诱变和培养, 红色糖多胞菌诱变结果见图 2 图 2 LiCl 诱变致死率曲线从图 2 可见, 氯化锂诱变中, 方法 1 诱变能取得较好的致死效果, 可能是因为在培养的过程中, 由于平板中有氯化锂存在, 对红色糖多胞菌起着长期诱变的作用, 因此诱变效果更好随着氯化锂浓度的提高, 致死率随着提高, 当氯化锂浓度超过 0 6% 时, 红色糖多胞菌的致死率增加幅度不在显著, 因此在诱变中氯化锂浓度确定为 0 6% 在正交实验中, 氯化锂浓度分别选 0 4% 0 5% 0 6% 三个水平, 并分别采用两种方法进行实验正交实验结果根据单因素实验结果, 超声波功率分别选用 200W 250W 300W, 诱变时间为 15min 20min 25min, 氯化锂浓度分别为 0 4% 0 5% 0 6%, 采用不同的诱变方法进行正交诱变实验, 其正交试验因素水平表见表 1, 正交实验结果见表 2 水平 A 超声波功率 (W) 表 1 正交因素水平表 B 诱变时间 (min) CLiCl 浓度 (%) DLiCl 使用方法培养基中加 LiCl 孢子悬液处里 4h 同时处理

3 16 四川理工学院学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 2 月表 2 正交试验结果实验号 A B C D 生物效价 μg/ml k k k G=35532 R 注 : 以上均为三个平行实验的平均值正交实验数据处理采用正交设计助手软件 iv3 1 处理从表 2 的结果可以看出, 在正交试验的 4 个因素中, 其影响程度为 : 氯化锂使用方法 > 超声波诱变时间 > 超声波功率 > 氯化锂浓度从表 2 中可以得到实验号为的诱变菌株的相对效价较高, 其中 5 号菌株诱变效果最好, 其最佳诱变方法为 A 2 B 2 C 3 D 1, 将 5 号菌株命名为 UL5, 其发酵水平比出发菌株 4238μg/mL 提高了 12 6% 2 2 发酵单因素实验通过改进发酵培养基营养成分组成, 研究培养基对发酵效果的影响, 实验设计见表 3 发酵培养条件, 见 1 4 实验编号表 3 单因素实验设计淀粉糊精葡萄糖黄豆饼粉玉米浆硫酸铵碳酸钙 (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 磷酸二氢钾 (%) 1 / / / / / / / / 注 : / 表示变量不同碳源对发酵结果的影响按照实验设计 ( 表 3) 中实验编号进行实验, 实验结果分别如图所示图 3~5 是不同碳源对发酵结果的影响由图 3 可知, 随着淀粉含量的不断增加, 相对效价先升高后下降原因在于当淀粉含量过高时, 发酵液的黏度增加, 将影响红色糖多胞菌的生长, 同时还会对后续的红霉素分离提取工作带来不利由图 4 可知, 当糊精含量增大时, 图 3 不同淀粉含量对红霉素效价的影响图 4 不同糊精含量对红霉素效价的影响图 5 不同葡萄糖含量对红霉素效价的影响发酵水平提高不太明显由图 3 和图 5 比较, 淀粉和葡萄糖影响红霉素的效价显著, 它们的趋势十分相似在发酵过程中, 红色糖多胞菌的发酵能力下降, 可能是因为葡萄糖浓度过高增大了发酵液的黏度, 影响发酵液的溶氧量, 导致发酵效果不好 ; 其次葡萄糖可以产生碳分解代谢物阻遏效应, 影响红霉素的最终发酵单位效价因此, 取 3 0% 淀粉,3 0% 糊精,2 0% 葡萄糖, 有利于提高发酵水平通过单因素实验表明, 单一碳源均不能很好的满足最佳发酵的需要, 因此, 在后继工作中复合碳源对发酵水平的影响有待进一步研究不同氮源对发酵结果的影响按照实验设计 ( 表 3) 中实验编号进行实验, 实验结果分别如图所示黄豆饼粉在红霉素发酵过程前期中起着重要作用, 当培养基中的淀粉水解速率供不应求时, 菌体生长容易利用的碳源不足, 而被迫利用黄豆饼粉从图 6 可看出, 随着黄豆饼粉含量增加, 红霉素效价不再增大, 且黄豆饼粉含量过高时会增大发酵液黏度对后续红霉素的提取带来不利玉米浆是一种优质有机氮源有利于红

4 左勇等 : 红霉素产生菌的诱变及培养基优化研究 17 图 6 不同黄豆饼粉含量对红霉素效价的影响图 9 不同碳酸钙含量对红霉素效价的影响图 7 不同玉米浆含量对红霉素效价的影响图 8 不同硫酸氨含量对红霉素效价的影响霉素的合成, 加入不同量的玉米浆后发酵单位都有所提高, 但从图 7 中看出, 在玉米浆含量为 1 2% 以上时生物效价有降低趋势, 其可能是因为氮源浓度过高, 前期菌丝体增殖过多导致后期一些红霉素合成成份不够, 同时菌丝体浓度过高也会增大发酵液黏度, 导致菌体自溶硫酸氨作为一种微量成份, 以氨离子的形式提供氮源, 氨离子可能会参与红霉素的合成, 但是过量的氨离子也可能会对红色糖多胞菌内的一些酶类起到抑制作用, 从而使红霉素的合成受阻, 同时也直接影响发酵液的酸碱度, 氨离子的存在对保持适宜的酸碱度在发酵过程中起着相当重要的作用从上面三种氮源对红霉素效价影响可知, 有机氮源含量适当提高, 有利于红霉素的合成, 无机氮源处于较低水平有利于发酵水平的提高综上分析, 取 3 0% 黄豆饼粉,1 0% 玉米浆,0 15% 硫酸铵, 可达较高的发酵水平由于不同氮源在不同的发酵时期起着不同的作用, 为此, 我们将继续研究复合氮源的对发酵结果的影响辅助因子对发酵结果的影响按照实验设计 ( 表 3) 中实验编号 7 8 进行实验, 实验结果分别如图 9 10 所示图 10 不同磷酸二氢钾含量对红霉素效价的影响在微生物的培养中, 作为辅助成分的碳酸钙和硫酸铵的作用相似, 是一种无机碳源, 其作用主要是保持微生物代谢产生的酸碱平衡, 其浓度过低 ph 值会发生变化, 导致红色糖多胞菌提前进入衰亡期 KH 2 的浓度对红霉素效价有很大影响, 在缺乏 KH 2 时, 效价明显降低, 但是过量的 KH 2 也会使效价下降, 原因是因 KH 2 会对红色糖多胞菌菌体内的一种诱导酶起到诱导作用, 而这种酶对红霉素的合成起着重要作用, 但是当 KH 2 的用量太大时可能会抑制其他代谢的进行 ; 因此必须控制好 KH 2 的浓度因此, 在发酵过程中, 0 6% 的碳酸钙,0 02% 的 KH 2 有利于提高红霉素发酵水平 2 3 单因素发酵验证根据 2 2 发酵单因素实验, 在发酵培养基组成为 3 0% 淀粉 3 0% 糊精 2 0% 葡萄糖 3 0% 黄豆饼粉 1 0% 玉米浆,0 15% 硫酸铵,0 6% 碳酸钙,0 02% 磷酸二氢钾, 转速为 220r/min, 进行变温发酵 :31 条件下培养 2d,33 条件下培养 3d,31 条件下培养 2d UL5 的最终发酵液的平均效价提高到 5497μg/mL 3 结束语红霉素出发菌株经过超声波 - 氯化锂复合诱变和改良培养基后, 均大幅提高了发酵水平其中经过诱变后的最优 UL5 菌株摇瓶发酵的效价最大提高了 12 6% 经过培养基优化后,UL5 的菌株摇瓶发酵的效价比原来提高了 15 2%

5 18 四川理工学院学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 2 月参考文献 :!" #$ # $$% & ' & % # % # ' % ' & % $ ( %! )$ ' **+,-./01 1*! 范代娣陈斌尚龙安等! 红霉素发酵工艺优化研究! 生物工程学报 *** -./0 1! + 施敏敏! 红霉素发酵过程的控制技术! 工业控制与应用 * 1.,/01! 李啸陈长华李友元! 红霉素发酵条件的优化! 中国医药工业杂志 +,. / ! - 张金国刘翔! 红霉素发酵培养基优化研究! 中国抗生素杂志 +.,/0! 国家药典委员会! 中华人民共和国药典! 北京 0 化学工业出版社 -!, 吴梧桐! 生物制药工艺学! 北京 0 中国医药科技出版社 +! 1 张金国王敏! 红霉素高产菌株的选育! 中国抗生素杂志 + 1.+/01 1! * 刘峰周文娟陈国荣! 红霉素高产菌株的选育及摇瓶发酵工艺的优化! 海峡药学. /0 1+ 1,! 王颖! 红霉素产生菌的诱变和筛选! 黑龙江医药 1. /0,* 1! StudyontheMutationofErythromycinProductiveStrainandItsFermentation ZUOYong,LIYang,RENYong li,jushuai,xiehui,qifeng (SchoolofBiotechnologyEngineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong643000,China) Abstract:TheSacharopolysporaerythraea08Lisusedasthestartingstrain.Procesedbyultravioletmutagenesis,the fermentationproductofthemutatedstrainswasincreasedby12 6%.Inaddition,undertheoptimizedculturemediumwhich consistedofstarch3%,dextrin3%,glucose2%,soybeanmeal3%,cornsteepliquor1%,(nh 4 ) 2 SO %,Ca CO 3 0 6%,KH %,thefementationyieldofUL5strainswasincreasedby15 2%. Keywords:Sacharopolysporaerythraea;mutagenesis;orthogonaltest;fermentation

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