第 1 期田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 7 of769 PcelswasasesedbyusingAnnexinV FITCandpropidiumiodidestaining.Results:qRT PCR resultsshowedt

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赐安
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1 第 28 卷第 1 期 2018 年 1 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.28 No.1 Jan.2018 mir 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展田亚萍 1,2, 王成 2, 钟锦莎 2, 丁梦 2, 葛京平 3 2, 张春妮 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 ;2. 南京军区南京总医院临床检验科, 江苏南京 ;3. 南京军区南京总医院泌尿外科, 江苏南京 ) [ 摘要 ] 目的 : 检测 mir 222 3p 在肾细胞癌组织中的表达, 探讨其参与肾细胞癌发生发展的分子机制方法 : 运用 qrt PCR 检测 15 对肾细胞癌组织和对应癌旁组织 mir 222 3p 的表达水平生物信息学预测 mir 222 3p 的靶基因, 荧光素酶报告实验验证其靶向调控作用运用免疫组化和蛋白质印迹技术检测癌组织中靶基因蛋白表达水平进一步通过脂质体瞬时转染技术实现肾细胞癌细胞株 769 P 中 mir 222 3p 过表达, 采用流式细胞术检测 mir 222 3p 对细胞凋亡的影响结果 :qrt PCR 结果显示,miR 222 3p 在肾细胞癌组织的表达水平显著高于癌旁组织 (P<0.01) 生物信息学预测显示, 抗凋亡蛋白 Bim 是 mir 222 3p 潜在的靶基因荧光素酶报告实验证实, 过表达 mir 222 3p 可抑制含有 Bim3 UTR 的荧光素酶报告基因的荧光素酶活性, 但对 Bim3 UTR 突变体的荧光素酶活性没有影响免疫组化结果显示, 肾细胞癌组织中 Bim 蛋白免疫组化阳性反应程度明显低于相应的癌旁组织 (P<0.01); 蛋白质印迹结果进一步证实 Bim 蛋白在肾细胞癌组织中的表达较癌旁组织明显下调 (P<0.01) 进一步在 769 P 细胞中瞬时过表达 mir 222 3p 后, 发现 Bim 蛋白水平明显下调 (P<0.01), 但 BimmRNA 水平无明显变化流式细胞术检测结果显示, 过表达 mir 222 3p 可显著抑制 769 P 细胞的凋亡 (P<0.01) 结论 :mir 222 3p 可通过靶向作用于抑癌基因 Bim 表达抑制肾癌细胞的凋亡, 在肾癌的发生发展中起重要作用,miR 222 3p/Bim 轴为肾细胞癌治疗提供新的途径 [ 关键词 ] 肾细胞癌 ;mir 222 3p;Bim; 凋亡 [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2018) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 田亚萍, 王成, 钟锦莎, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2018,28(1):6-11. mir 222 3pisinvolvedinthedevelopmentandprogresionofrenal celcarcinomabytargetedlyinhibitingbim proteinexpresion TIANYa ping 1,2,WANGCheng 2,ZHONGJin sha 2,DINGMeng 2,GEJing ping 3,ZHANGChun ni 2 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingGeneralHospitalof NanjingMilitaryRegion,NanjingJiangsu210002;3.DepartmentofUrologySurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRe gion,nanjingjiangsu210002,china) [Abstract] Objective:TodetecttheexpresionofmiR 222 3pinrenalcelcarcinoma(RCC)tisues, andexploreitsroleandmechanismsinthedevelopmentandprogresionofrcc.methods:totalrna wasextractedfromthetisuesof15pairsofrccandtheiradjacenttisues.theexpresionofmir 222 3pwasdeterminedbyreal timefluorescentquantitativepcr(qrt PCR).ThetargetgenesofmiR 222 3pwerepredictedbybioinformaticsandverifiedbyluciferasereportergeneasay.Immunohistochemistry andwesternblotinganalysiswereusedtodetecttheexpresionoftargetgeneinrcctisuesamples.li pofectamine2000wasusedtooverexpresmir 222 3pinrenalcarcinomacelline769 P.Theapoptosis [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ); 生命分析化学国家重点实验室资助项目 (5431ZZXM1601) [ 作者简介 ] 田亚萍 (1989 ), 女, 硕士研究生 ; 张春妮 ( 通讯作者 ), 主任技师, 博士生导师,E mail:zchunni27@hotmail.com

2 第 1 期田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 7 of769 PcelswasasesedbyusingAnnexinV FITCandpropidiumiodidestaining.Results:qRT PCR resultsshowedthatmir 222 3pwassignificantlyhigherinRCCtisuesamplesthaninadjacenttisues (P<0.01).BimwaspredictedasapotentialtargetgeneofmiR 222 3pbybioinformaticsmethods.The luciferasereportergeneasayresultsshowedthatoverexpresionofmir 222 3pinhibitedtheBim3 UTR activity,whereasdidnotafecttheluciferaseactivityofmutantformofbim3 UTR.Immunohistochemis tryasayshowedthatthestainingintensityofbimwaslowerinrcctisuesthaninmatchedadjacenttis sues(p<0.01).westernblotinganalysisshowedthatbimwassignificantlydown regulatedinrcctis sues(p<0.01).transientoverexpresionofmir 222 3pin769 PcelsresultedinreductionofBimpro teinlevels(p<0.01);however,bim mrna leveldidnotchangesignificantly.invitrocelfunction studiesshowedthatoverexpresionofmir 222 3psignificantlyinhibitedtheapoptosisof769 Pcels(P< 0.01).Conclusion:miR 222 3pcouldcausecarcinogenesisviainhibitingtheapoptosisofrenalcel carcinoma,whichplaysanimportantroleinthedevelopmentandprogresionofrccthroughtargeting tumorsuppresorgenebim.themir 222 3p/Bimaxismaypotentialyserveasanoveltherapeuticappli cationforrcc. [Keywords] renalcelcarcinoma;mir 222 3p;Bim;apoptosis 肾细胞癌是常见的成人泌尿系统恶性肿瘤, 发病机制至今不详, 早期多无症状, 约 30% 的患者发现时已经发生转移, 导致预后极差 [1] 故阐明肾细胞癌发生发展的分子机制, 寻找新型的分子治疗靶标, 是提高肾细胞癌患者生存率和改善预后的关键微小核糖核酸 (microrna,mirnas) 是一类小分子非编码 RNA, 可通过与靶信使 RNA(mesenger RNA,mRNA)3 端非翻译区 (3 untranslatedregion, 3 UTR) 完全或部分互补结合, 导致靶 mrna 翻译抑制或降解, 在转录后水平调控靶基因表达 [2] 不同的 mirnas 通过靶向不同的基因发挥原癌和抑癌基因作用, 参与肿瘤的发生发展 [3-4] 已有研究显示,miR 222 3p 在恶性甲状腺滤泡癌水平升高, 可用来区分良恶性甲状腺滤泡癌 [5] ; 在胶质细胞瘤中,miR 221/222 通过与蛋白质酪氨酸磷酸酶 μ3 UTR 结合, 下调该蛋白在胶质瘤中表达, 进而诱导细胞的侵袭和迁移 [6] ; 卵巢癌上皮细胞分泌的 mir 222 3p 可以促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞转化从而促进肿瘤的生长和转移 [7] 上述研究提示, mir 222 3p 的表达异常与多种肿瘤发生发展密切相关在 mir 222 3p 与肾肿瘤的研究中, 已报道肾透明细胞癌患者血浆中 mir 221/222 的表达水平升高并且与其发生转移有关, 具体机制尚不清楚 [8-9] Bim 是细胞凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子, 是一种重要的促凋亡蛋白, 研究发现 Bim 在多种肿瘤中发挥抑癌作用 [10-11] [12] Terasawa 等发现 mir 222 通过在转录水平下调 Bim 的表达从而减少 PC12 细胞凋亡然而 mir 222 3p 是否通过调节 Bim 的表达参与肾细胞癌的发生发展尚未见报道因此本研究主要探讨 mir 222 3p 在肾细胞癌组织中的表达变化影响肾细胞癌的凋亡能力以及可能作用的靶基因 1 材料与方法 1.1 材料组织标本来源收集 15 例 2013 年 10 月至 2017 年 11 月在南京军区南京总医院泌尿外科手术的肾细胞癌组织标本, 患者平均年龄 (63.47±2.99) 岁, 其中男 10 例, 女 5 例, 均无吸烟饮酒史 14 例病理分型为肾透明细胞癌,1 例为嫌色细胞癌按照 Furh man 分级标准对患者组织标本进行分级 [13], 其中 Ⅰ ~Ⅱ 级 5 例 (33.3%),Ⅲ ~Ⅳ 级 3 例 (20.0%), 不确定 7 例 (46.7%), 均为新诊治患者, 行肾癌根治性切除术前未进行任何辅助治疗手术切除的肾癌组织留作本课题研究的肿瘤标本, 同时在距肿瘤远端约 3~5cm 处切取正常组织作为对照组织样本取出后用液氮速冻, 然后保存于 -80 冰箱细胞培养人源肾癌细胞株 769 P( 北京协和细胞中心 ) 和人胚肾细胞 293T( 上海中国医学科学院细胞库 ) 分别培养于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 RPMI1640 DMEM 培养液, 并于 37 湿润的培养箱 (5%CO 2 ) 以贴壁形式生长试剂与材料 mir 222 3p 检测探针 ( 美国 AppliedBiosystems 公司 );mir 222 3p 模拟物 (mir 222 3p mimic, 序列为 5 AGCUACAUCUGGC UACUGGGU 3 ) 和阴性对照寡核苷酸 (mir NC

3 8 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 28 卷 mimic, 序列为 5 UAGUGGAUGGCAGGCACACUCA 3 ) 由上海吉玛生物公司合成 ;BimmRNA 定量检测引物 ( 前向引物 5 CACCAGCACCATAGAAGAA 3, 后向引物 5 ATAAGGAGCAGGCACAGA 3 ) GAP DH 定量检测引物 ( 前向引物 5 AGAAGGCT GGGGCTCATTTG 3, 后向引物 5 AGGGGCCATC CACAGTCTTC 3 ) [14] 荧光素酶报告质粒 (p MIR Luciferasereport) 由金斯瑞公司合成 ;RIPA 试剂 ( 碧云天公司 );Bim 抗体 (CelSignaling 公司 );GAP DH α 微管蛋白羊抗兔二抗羊抗鼠二抗 (Santa Cruz 公司 ); 凋亡检测试剂盒 ( 美国 Sigma Aldrich 公司 ); 荧光素酶报告系统检测试剂盒 (Promega 公司 );Opti MEM 培养液 DMEM 培养液 1640 培养液和胎牛血清 (Gibco 公司 );Trizol 试剂 Lipofectamine 2000( 美国 Invitrogen 公司 );SYBRGreen 试剂 ( 大连 TaKaRa 公司 );ECL 试剂盒 ( 美国 Pierce 公司 ) 1.2 方法 qrt PCR 检测肾组织 mir 222 3p 的表达组织总 RNA 用 Trizol 试剂提取 mir 222 3p 检测采用茎环 qrt PCR 法由于组织中常用内参 mir 16 U6 在癌及癌旁正常组织中表达均有差异 (P mir 16 <0.01,P U6 <0.01),miR 222 3p 的表达由直接循环阈值法计算靶基因预测应用 TargetScan 在线工具 (ht tp/ 寻找 mir 222 3p 的可能作用靶基因荧光素酶活性检测实验将 293T 细胞按每孔个接种于 48 孔板中, 当细胞汇合度为 70% 时, 分别将 mir NCmimic mir 222 3pmimic Bim 野生型 Bim 突变型半乳糖苷酶表达载体 (β gal) 质粒共转染 293T 细胞, 培养 6h 后换成含 2% 胎牛血清的 DMEM 继续培养,48h 后检测细胞荧光素酶的活性 β gal 为内参比较实验组相对于对照组荧光素酶活性的变化免疫组织化学染色检测组织 Bim 蛋白的表达采用 EnVision(DAKO 公司 ) 二步法 [15], 抗体为 Bim(1 1000) 使用 ImageJ ProPlus6.0 软件分别计算癌组织及癌旁组织中 200 倍视野下 Bim 蛋白阳性颗粒数和总细胞数, 阳性颗粒数与总细胞数之比为 Bim 相对表达水平蛋白质印迹法检测组织 Bim 蛋白表达采用 RIPA 裂解液提取癌组织及癌旁组织蛋白, 配制 12.5% 的分离胶和 5% 的浓缩胶, 将蛋白加入梳孔进行电泳电泳结束后转印至 PVDF 膜,1.5h 后用 5% 的脱脂牛奶封闭, 室温 1h 后加入一抗 (Bim GAPDH)4 孵育过夜 TBST 洗膜, 二抗孵育 1h 后用 ECL 试剂盒显色发光使用 ImageJ 软件对结果进行灰度分析, 计算蛋白表达水平蛋白质印迹法检测转染 mir 222 3p 后 769 P 细胞 Bim 蛋白表达将 769 P 细胞按每孔个接种在 6 孔板上, 将 200pmol 的 mir NCmimic, mir 222 3p mimic 用溶于 Opti MEM 的 Lipo fectamine2000 试剂转染 769 P 细胞, 培养 6h 后换成含 2% 胎牛血清的 1640 继续培养 48h 收集细胞, 用 PBS 洗涤 2 遍后提取总蛋白质将蛋白提取液用 12.5% SDS PAGE 进行电泳分离分离完毕后通过电转方法将蛋白质转至 PVDF 膜用 Bim GAPDH 单克隆抗体孵育过夜,TBST 洗膜后二抗孵育 1h, 蛋白条带用 ECL 试剂盒显色发光使用 Im agej 软件对结果进行灰度分析 qrt PCR 检测转染 mir 222 3p 后 769 P 细胞中 Bim mrna 的表达 Bim mrna 的定量 PCR 扩增使用 SYBRGreen 试剂,GAPDH 作为内参, 其相对表达用 2 -ΔΔCT 法表示, 其中 ΔCT=Ct Bim -Ct GAPDH, ΔΔCT=ΔCT 肾癌组织 -ΔCT 癌旁组织流式细胞术检测转染 mir 222 3p 后 769 P 细胞的凋亡水平将 769 P 细胞按每孔个接种在 6 孔板上, 将 200pmol 的 mir NCmimic,miR 222 3pmimic 用溶于 Opti MEM 的 Lipofectamine 2000 试剂转染 769 P 细胞, 培养 6h 后换成含 2% 胎牛血清的 1640 继续培养 48h 将细胞用 PBS 洗涤 2 遍后, 按照凋亡试剂盒说明书步骤将 PI 和 Annex in V 加入细胞中孵育 20min, 采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡 1.3 统计学方法所有数据应用 GraphPadPrism5 软件进行统计学分析, 组间比较采用独立样本 t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 肾细胞癌组织中 mir 222 3p 的表达水平显著升高 qrt PCR 检测结果显示, 肾细胞癌组织中 mir 222 3p 表达水平显著高于癌旁对照组织 ( 图 1) 2.2 Bim 是 mir 222 3p 的直接靶点靶基因预测结果表明,miR 222 3p 与促凋亡基因 BimmRNA3 UTR 的第位碱基序列 (AUGUAGCA) 互补结合 ( 图 2), 提示 Bim 可能是

然后在人胚肾细胞 293T 进行了荧光素酶报告基因实验结果显示, 与 mir NCmimic 和空载 β gal 相比, 转染 mir 222 3pmimic 和含有 Bim 的 3 UTR 区域的质粒后, 荧光强度明显降低 (P< 0.

4 第 1 期田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 9 mir 222 3p 的靶点析结果显示, 癌组织与癌旁组织之间 Bim 蛋白表达差异有统计学意义 (P<0.01) 蛋白质印迹结果显示, 与癌旁组织相比, 癌组织中 Bim 蛋白的表达明显减低 (P<0.01, 图 5) 说明 Bim 蛋白在肾细胞癌组织中表达下调, 这与 mir 222 3p 的表达水平相反图 1 qrt PCR 检测肾细胞癌组织和癌旁组织中 mir 222 3p 的表达水平为验证 Bim 是 mir 222 3p 直接作用的靶基因, 我们克隆了包含 mir 222 3p 结合位点的 Bim 3 UTR 序列, 并将该序列插入到携带荧光素酶报告基因的质粒中, 然后在人胚肾细胞 293T 进行了荧光素酶报告基因实验结果显示, 与 mir NCmimic 和空载 β gal 相比, 转染 mir 222 3pmimic 和含有 Bim 的 3 UTR 区域的质粒后, 荧光强度明显降低 (P< 0.01) 为进一步验证 mir 222 3p 对含 Bim3 UTR 区的荧光活性的抑制是由于与该位点的结合所致, 我们将 Bim 的 3 UTR 区序列 AUGUAGCA 突变为 UACAUCGA 同上述的转染方法, 同时转染含有 Bim 的 3 UTR 区域突变体质粒和化学合成的 mir 222 3pmimic 结果显示, 与对照相比, 荧光素酶活性没有变化 ( 图 3) 上述结果证明 mir 222 3p 通过特异性地识别并结合 Bim 的 3 UTR 区域靶向调节 Bim 表达黑色箭头指示 Bim 蛋白阳性颗粒图 4 免疫组化检测肾癌组织 Bim 蛋白表达 ( 200) 图 2 mir 222 3p 与 Bim mrna 靶位点配对示意图 a:n1 N15: 癌旁组织 ;C1 C15: 癌组织图 5 蛋白质印迹检测肾癌组织 Bim 蛋白表达图 3 荧光素酶活性检测 2.3 Bim 蛋白在肾细胞癌组织中表达明显下降免疫组化结果显示, 癌旁组织可见大量棕黄色颗粒,Bim 蛋白表达强 ; 癌组织中则分布少量或不可见的棕黄色颗粒,Bim 蛋白表达弱 ( 图 4); 光密度分 2.4 mir 222 3p 降低 769 P 细胞 Bim 蛋白的表达为进一步证实 mir 222 3p 对 Bim 的负向调控作用, 在 769 P 细胞瞬时过表达 mir 222 3p 后, 发现 Bim 蛋白水平明显下调 ( 图 6), 而 BimmRNA 水平无明显变化 ( 图 7), 提示 mir 222 3p 对 Bim 的调控是经典的转录后水平调控

AnnexinV/PI 染色法检测 769 P 细胞的凋亡水平 3 讨论近年来对肾细胞癌相关 mirna 差异性表达的研究揭示,miRNA 与肾细胞癌密切相关, 并在肾细胞癌发生发展中发挥重要的生理病理功能 Arai [16] 等发现 mir 10a 5p 的低表达纺锤体和着丝粒相关蛋白 1(SKA1) 的高表达与肾细胞癌患者的总生存率显著相关进一步实验结果表明 mir 10a 5p

5 10 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 28 卷 2.5 mir 222 3p 降低 769 P 细胞的凋亡水平流式细胞术检测结果显示, 与转染 mir NC mimic 相比, 转染 mir 222 3pmimic 后 769 P 细胞凋亡水平明显下降 ( 图 8) 图 6 瞬时过表达 mir 222 3p 后 769 P 细胞 Bim 蛋白表达图 7 瞬时过表达 mir 222 3p 后 769 P 细胞 Bim mrna 表达图 8 AnnexinV/PI 染色法检测 769 P 细胞的凋亡水平 3 讨论近年来对肾细胞癌相关 mirna 差异性表达的研究揭示,miRNA 与肾细胞癌密切相关, 并在肾细胞癌发生发展中发挥重要的生理病理功能 Arai [16] 等发现 mir 10a 5p 的低表达纺锤体和着丝粒相关蛋白 1(SKA1) 的高表达与肾细胞癌患者的总生存率显著相关进一步实验结果表明 mir 10a 5p 不仅可以下调 SKA1 的过表达, 而且与肾细胞癌的发生和临床酪氨酸激酶抑制剂治疗抵抗紧密相关我们课题组研究发现 mir 28 5p 通过抑制 RAP1B (Ras 相关的小 GTP 结合癌蛋白 ) 表达并影响 RAP1B 下游 MAPK 信号通路中的两种激酶的活化对肾细胞癌的发生起促进作用 [17] 研究报道 mir 222 3p 在肾透明细胞癌患者血浆中表达水平升高, 是一个促癌 mirna [8], 但其在组织中的表达尚未见报道本研究结果显示肾细胞癌组织中的 mir 222 3p 表达水平明显高于癌旁组织, 进一步说明 mir 222 3p 在肾细胞癌发生发展中起促进作用 mir 222 3p 的生理病理功能并不完全清楚有报道显示,miRNA 19b/221/222 可通过下调过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅激活因子 1α(PGC 1α) 的水平促进动脉粥样硬化的形成, 显示 mir 222 3p 参与病理情况下血管结构变化的过程 [18] [19] Nardeli 等通过芯片技术检测肥胖妊娠和非肥胖妊娠妇女羊膜间质干细胞中多个 mirna 的表达, 发现 mir 138/miR 222 在肥胖妊娠妇女中高表达, 这一结果提示可以通过改变饮食结构调整羊膜干细胞中 mirna 的表达水平, 为新生儿肥胖及肥胖相关代 [12] 谢紊乱疾病提供新的治疗思路 Terasawa 等则发现 mir 222 与 PC12 细胞凋亡有关 Bim 是 Bcl 2 家族中 BH3 only 亚家族的一员, 是一种重要的促凋亡蛋白研究表明 Bim 表达的缺失与多种肿瘤的不良预后有关表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂是一种用来治疗有 EGFR [20] 突变的晚期非小细胞肺癌患者的药物,Zhao 等发 [21] 现 Bim 缺失使其药效降低 Maimaiti 等发现 Bim 表达缺失与乳腺癌尤其是 luminala 型乳腺癌患者不 [22] 良预后有关 Zantl 等发现 Bim 的丢失与肾细胞癌化疗抵抗有关这些研究充分说明 Bim 是一个重要的肿瘤抑制因子本研究首先通过生物信息学方法发现 mir 222 3p 与 Bim mrna 的 3 UTR 有结合位点, 并通过荧光素酶报告实验证实 mir 222 3p 可以直接作用于 Bim 的 3 UTR 序列同时应用免疫组化和蛋白质印迹技术检测了肾细胞癌组织中 Bim 蛋白表达情况, 两者结果均显示 Bim 蛋白在肾细胞癌组织显著降低, 这与 mir 222 3p 的表达水平相反进一步使用转染技术实现 769 P 细胞过表达 mir 222 3p, 检测 769 P 细胞 Bim 蛋白及 mrna 的变化, 证实 mir 222 3p 对 Bim 的调节是经典的转录后调控凋亡实验结果进一步说明 mir 222 3p 可以降低 769 P 细胞的凋亡水平, 对肿瘤发生发展起促进作用综上所述, 本实验结果揭示 mir 222 3p 是肾细

6 第 1 期田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 11 胞癌中一个重要的促癌基因, 通过下调抑癌基因 Bim 的表达抑制肾癌细胞的凋亡, 参与肾细胞癌的发生发展 mir 222 3p/Bim 轴为治疗肾细胞癌提供了新思路 [ 参考文献 ] [1] SiegelRL,MilerKD,FedewaSA,etal. Colorectal cancerstatistics[j].cacancerjclin,2017,67(10): [2] EbertMS,SharpPA.RolesformicroRNAsinconfering robustnestobiologicalproceses[j].cel,2012,149 (3): [3] WolfsonB,EadesG,ZhouQ.RolesofmicroRNA 140in stemcel asociatedearlystagebreastcancer[j].world JStemCels,2014,6(5): [4] MoZH,WuXD,LiS,etal.Expresionandclinicalsig nificanceofmicrorna 376aincolorectalcancer[J].A sianpacjcancerprev,2014,15(21): [5] StokowyT,EszlingerM,SwierniakM,etal.Analysisop tionsforhigh throughputsequencinginmirnaexpres sionprofiling[j].bmcresnotes,2014,7:144. [6] QuintavaleC,GarofaloM,ZancaC,etal.miR 221/222 overexpesioninhumanglioblastomaincreasesinvasive nesbytargetingtheproteinphosphateptpmu[j].on cogene,2012,31(7): [7] YingX,WuQ,WuX,etal.Epithelialovariancancer secretedexosomalmir 222 3pinducespolarizationof tumor asociatedmacrophages[j].oncotarget,2016,7 (28): [8] TeixeiraAL,FereiraM,SilvaJ,etal.Highercirculating expresionlevelsofmir 221asociatedwithpooroveral survivalinrenalcelcarcinomapatients[j].tumourbi ol,2014,35(5): [9] KhelaHW,ButzH,DingQ,etal.miR 221/222are involvedinresponsetosunitinibtreatmentinmetastatic renalcelcarcinoma[j].molther,2015,23(11): [10] LetaiA,BasikMC,WalenskyLD,etal.DistinctBH3 domainseithersensitizeoractivatemitochondrialapopto sis,servingasprototypecancertherapeutics[j].cancer Cel,2002,2(3): [11] AdamsJM,CoryS.TheBcl 2apoptoticswitchincancer developmentandtherapy[j].oncogene,2007,26(9): [12] TerasawaK,IchimuraA,SatoF,etal.Sustainedactiva tionoferk1/2byngfinducesmicrorna 221and222 inpc12cels[j].febsj,2009,276(12): [13] FuhrmanSA,LaskyLC,LimasC.Prognosticsignifi canceofmorphologicparametersinrenalcelcarcinoma [J].AmJSurgPathol,1982,6(7): [14] ZhangH,DuanJ,QuY,etal.Onco mir 24regulates celgrowthandapoptosisbytargetingbcl2l11ingas triccancer[j].proteincel,2016,7(2): [15] KosemehmetogluK,VranaJA,FolpeAL.TLE1expres sionisnotspecificforsynovialsarcoma:awholesection studyof163softtisueandboneneoplasms[j].mod Pathol,2009,22(7): [16] AraiT,OkatoA,KojimaS,etal.Regulationofspindle andkinetochore asociatedprotein1byantitumormir 10a 5pinrenalcelcarcinoma[J].CancerSci,2017, 108(10): [17] WangC,WuC,YangQ,etal.miR 28 5pactsasa tumorsuppresorinrenalcelcarcinomaformultiplean titumorefectsbytargetingrap1b[j].oncotarget, 2016,7(45): [18] XueY,WeiZ,DingH,etal.MicroRNA 19b/221/222 inducesendothelialceldysfunctionviasuppresionof PGC 1αintheprogresionofatherosclerosis[J].Ather osclerosis,2015,241(2): [19] NardeliC,GranataI,IafaldanoL,etal.miR 138/miR 222overexpresioncharacterizesthemiRNomeofamni oticmesenchymalstem celsinobesity[j].stem Cels Dev,2017,26(1):4-14. [20] ZhaoM,ZhangY,CaiW,etal.TheBimdeletionpoly morphism clinicalprofileanditsrelationwithtyrosine kinaseinhibitorresistanceinchinesepatientswithnon smalcellungcancer[j].cancer,2014,120(15): [21] MaimaitiY,DongL,AiliA,etal.Bim maybeapoor prognosticbiomarkerinbreastcancerpatientsespecialy inthosewithluminala tumors[j].cancerbiomark, 2017,19(4): [22] ZantlN,WeirichG,ZalH,etal.Frequentlosofex presionofthepro apoptoticproteinbim inrenalcel carcinoma:evidenceforcontributiontoapoptosisresist ance[j].oncogene,2007,26(49): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志

生物技术通报材料方法

生物技术通报材料方法生物技术通报高曰文朱耀明王艳林朱晨宇秦烨胡汉卿韩钰旨在探讨盐酸普鲁卡因对人结肠癌细胞基因甲基化及表达的影响应用巢式双重甲基化特异性聚合酶链反应检测盐酸普鲁卡因处理前后细胞中基因启动子的甲基化水平逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹技术观察细胞内基因表达情况检测发现人结肠癌细胞中基因存在甲基化经盐酸普鲁卡因处理能够使基因甲基化水平下降和蛋白印迹分析结果显

第 1 期 田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 7 of769 PcelswasasesedbyusingAnnexinV FITCandpropidiumiodidestaining.Results:qRT PCR resultsshowedt

第 1 期田亚萍, 等.miR 222 3p 通过靶向调节 Bim 蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展 7 of769 PcelswasasesedbyusingAnnexinV FITCandpropidiumiodidestaining.Results:qRT PCR resultsshowedt