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钢万
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1 doi: /j.issn Let 7d 靶向 LOX 1 逆转 ox LDL 诱导血管内皮细胞凋亡观察闫杰 1), 陈静 2), 黄宇玲 1), 葛庆锋 1), 刁增利 1), 苏鹏宇 1) 1), 李燕 1) 华北理工大学附属医院心血管内科河北唐山 ) 华北理工大学生命科学学院河北唐山关键词 Let 7d;LOX 1;ox LDL; 人脐静脉内皮细胞 ; 凋亡中图分类号 R331.3 摘要目的 : 研究 Let 7d 对氧化低密度脂蛋白 (ox LDL) 诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 凋亡以及凝集素样氧化低密度脂蛋白清除受体 1(LOX 1) 表达的影响方法 : 用 50mg/L 的 ox LDL 处理 HUVECs24h 和 48h, 分别采用 Westernblot 和 RT qpcr 法检测 LOX 1 和 Let 7d 表达的变化 TargetScan 和双荧光素酶报告基因实验预测 LOX 1 与 Let 7d 之间的靶向调控关系将 mirna 模拟物对照 (NC) 和 Let 7d 单独或联合 50mg/L 的 ox LDL 处理 HUVECs48h, 分别记为 NC 组 Let 7d 组 NC+ox LDL 组和 Let 7d+ox LDL 组, 采用 Westernblot 和 RT qpcr 法检测各组中 LOX 1 Caspase3 Bax 和 Bcl 2 蛋白表达及 LOX 1mRNA 表达, 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率结果 : 用 50mg/L 的 ox LDL 处理 HUVECs0h 24h 和 48h 后, 各组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白表达增加,Let 7d 表达降低 (P<0.05) TargetScan 和双荧光素酶报告基因实验表明 LOX 1 可能是 Let 7d 的靶基因 NC 组 Let 7d 组 NC+ 基金项目唐山市科学技术研究与发展计划项目 ( z) 作者简介闫杰, 通信作者, 男,1980 年 1 月生, 硕士, 副主任医师, 研究方向 : 心血管内科,E mail:sjf5vf@163.com

2 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Sep Vol.53 No ox LDL 组和 Let 7d+ox LDL 组 HUVECs 中 LOX 1 的表达细胞凋亡率及 Caspase3 Bax Bcl 2 蛋白表达比较, 差异均有统计学意义 (P<0.001) ox LDL 可诱导 HUVECs 中 LOX 1 细胞凋亡率和促凋亡蛋白 Caspase3 Bax 表达增加, 抗凋亡蛋白 Bcl 2 表达降低 ;Let 7d 能够显著抑制 ox LDL 对 HUVECs 中 LOX 1 表达细胞凋亡率及促凋亡蛋白 Caspase3 Bax 表达的诱导作用和抗凋亡蛋白 Bcl 2 表达的抑制作用 (P<0.05) 结论:Let 7d 能够逆转 ox LDL 诱导的 HUVECs 凋亡, 其机制可能与 Let 7d 靶向抑制 LOX 1 表达有关 EfectsofLet 7donapoptosisofvascularendothelialcelsinducedbyox LDLthroughregulatingLOX 1expresion YANJie 1),CHENJing 2),HUANGYuling 1),GEQingfeng 1),DIAOZengli 1),SUPengyu 1),LIYan 1) 1)DepartmentofCardiovascularDiseases,theAfiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceand Technology,Tangshan,Hebei )ColegeofLifeSciences,NorthChinaUniversityofSciencesand Technology,Tangshan,Hebei Keywords Let 7d;LOX 1;ox LDL;HUVEC;apoptosis Abstract Aim:ToinvestigatetheefectsofLet 7dontheapoptosisofhumanumbilicalveinendothelialcels(HU VECs)inducedbyox LDLandtheexpressionofLOX 1.Methods:TheexpressionsofLOX 1andLet 7dweredetectedby WesternblotandRT qpcr,respectively,afterhuvecsweretreatedwith50mg/lox LDLfor24hand48h.TargetScan anddualluciferasereportergeneexperimentpredictedtheregulatingrelationshipbetweenlox 1andLet 7d.HUVECswere treatedwithncandlet 7daloneorcombinedwith50mg/Lox LDLfor48h,whichwererecordedasNCgroup,NC+ox LDLgroup,Let 7dgroupandLet 7d+ox LDLgroup.WesternblotandRT qpcrwereusedtodetecttheproteinlevelsof LOX 1,Caspase3,BaxandBcl 2,andthemRNAlevelofLOX 1,respectively.Flowcytometrywasusedtodetecttheapop tosisrateofthecelsineachgroup.results:afterbeingtreatedwith50mg/lox LDLfor0h,24hand48h,theprotein leveloflox 1inHUVECswasincreasedsignificantly,whilethatofLet 7ddecreasedsignificantly(P<0.05).TargetScan anddualluciferasereportergeneexperimentshowedthatlox 1wasapotentialtargetofLet 7d.Thereweresignificant diferencesintheexpressionsoflox 1,apoptosisrateandtheproteinlevelsofCaspase3,Bax,Bcl 2inHUVECsfrom NC,Let 7d,NC+ox LDLandLet 7d+ox LDLgroups(P<0.001).Ox LDLcouldinducetheincreasesofexpressionsof LOX 1,Caspase3,andBax,andtheapoptosisrateincreasedsignificantly,whiletheexpressionofBcl 2decreasedremark ably;let 7dcouldsignificantlyinhibittheabovechangesinducedbyox LDL(P<0.05).Conclusion:Let 7dprotectsHU VECsfrom ox LDLinducedapoptosisbyinhibitingtheexpressionofLOX 1. 动脉粥样硬化是大中动脉动脉壁的一种慢性炎症性疾病, 其特征是形成可部分或完全阻塞血管腔的动脉粥样硬化斑块 [1] 氧化低密度脂蛋白(ox idized lowdensitylipoprotein,ox LDL) 在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用 [2] 凝集素样氧化低密度脂蛋白清除受体 1(lectin likeoxidizedlow density lipoproteinscavengerreceptor 1,LOX 1) 是负责结合内化和降解 ox LDL 的主要受体之一 [3] LOX 1 的激活与许多病理生理事件有关, 包括内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖细胞周期信号改变及细胞凋亡等 [4] [4] 研究表明, 动脉粥样硬化区域细胞凋亡显著增加, 研究 ox LDL 诱导的血管内皮细胞凋亡将有助于了解动脉粥样硬化的发生发展机制 mirna 是非编码单链分子, 由约 22 个核苷酸组成, 可在转录水平上调控基因表达,miRNA 与炎症氧化应激和血管生成有关 [5] Let 7 家族已被证实能够通过与 mrna 的 3 UTR 结合来抑制目的基因的表达 [6], 在炎症动脉粥样硬化进展中起着至关重要的作用 [7 8] [7] Qin 等研究表明 let 7c 可通 [9] 过抑制 Bcl xl 来促进内皮细胞凋亡 Chen 等研究报道了 let 7g 与 LOX 1 之间负反馈调节,LOX 1 mrna 的 3 非翻译区上含有 let 7g 结合位点 Bao [10] 等研究报道, 在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者中 Let 7d 和 Let 7i 表达下调, 提示 Let 7d 可能在动脉粥样硬化中起作用本研究证实了 ox LDL 能够诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 中 Let 7d 表达降低, 并且过表达 Let 7d 可通过靶向 LOX 1 表达来逆转 ox LDL 对血管内皮细胞凋亡的诱导作用, 现将结果报道如下

3 566 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 1 材料与方法 1.1 实验材料 HUVECs 购自美国 ATCC; 胎牛血清 RPMI1640 培养基 OPTI MEM 培养基青霉素链霉素胰蛋白酶 Lipofectamine2000 购自美国 In vitrogen 公司 ;ox LDL 购自北京索莱宝科技有限公司 ;mirna 反转录试剂盒购自中国大连宝生物科技有限公司 ;KAPA SYBR FASTqPCR 试剂盒购自美国 KAPA Biosystems 公司 ;mirna 模拟物对照 (NC) Let 7d 模拟物购自上海吉玛公司 ;pmirglo 质粒 DualLuciferase ReporterAssaySystem 购自 Promega 公司 ;Ⅷ 因子抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ;LOX 1 抗体购自美国 Sigma 公司, Caspase3 Bax Bcl 2 GADPH 抗体购自 CST 公司 ; 辣根过氧化物酶联二抗和 ECL 发光液购自德国 MerckMilipore 公司 1.2 细胞培养及分组将 HUVECs 用含有体积分数 10% 胎牛血清和青链霉素的 RPMI1640 培养基, 于 37 体积分数 5% CO 2 的培养箱中培养, 待细胞融合度达到 80% 时, 用胰蛋白酶消化并传代用 50mg/L 的 ox LDL 分别处理 HUVECs0 24 和 48 h [11], 分别记为 0h 组 24h 组和 48h 组将对数生长期 HUVECs 消化, 取个细胞接种于 24 孔板中, 分为 4 组, 每组 3 个复孔, 待细胞贴壁后融合度达 50% 时, 用 Lipofectamine2000 和 OPTI MEM 培养基将 NC 与 Let 7d 转入细胞中,6h 后其中 2 组更换新鲜培养基, 另外 2 组更换含有 50mg/L 的 ox LDL 的培养基, 放入细胞培养箱继续培养至 48h, 分别记为 NC 组 Let 7d 组 NC+ox LDL 组和 Let 7+ ox LDL 组 1.3 HUVECs 中 Let 7d 表达的 RT qpcr 检测按照 Trizol 说明书提取各组细胞总 RNA, 采用 mir NA 反转录试剂盒进行反转录并于 PCR 仪上检测 Let 7d 的表达, 以 U6 作为内参, 用 2 -ΔΔCt 法计算 Let 7d 相对表达量循环步骤为 :94 5min;94 30 s,60 30s,72 1min,40 个循环 ; 然后进行熔解曲线分析使用的引物序列如下 Let 7d: 上游引物 5 AGGTTGCATAGTTTTAGGGCA 3, 下游引物 5 AAGGCAGCAGGTCGTATAGT 3 ;U6: 上游引物 5 CTCGCTTCGGCAGCACA 3, 下游引物 5 AACGCTTCACGAATTTGCGT 3 实验重复 3 次 1.4 HUVECs 中相关蛋白表达的 Westernblot 法检测取处理后的细胞用冷 PBS 洗 2 次,RIPA 裂解液提取总蛋白,BCA 法测蛋白浓度并经 SDS PAGE 电泳分离各组样品, 蛋白分离后进行转膜至 PVDF 膜,50g/L 脱脂牛奶封闭后分别用 LOX 1 Caspase 3 Bax Bcl 2 和 GADPH( 内参 ) 抗体以及辣根过氧化物酶联二抗孵育, 最后于曝光仪上用 ECL 发光液曝光显影用 ImageJ 软件分析 LOX 1 Caspase3 Bax 和 Bcl 2 蛋白的相对表达量实验重复 3 次 1.5 Let 7d 与 LOX 1 靶向调控关系的分析采用双荧光素酶报告基因实验进行 Let 7d 与 LOX 1 靶向调控关系的分析采用 TargetScan(htp://www. targetscan.org/) 在线预测网站检测到 LOX 13 UTR 与 Let 7d 存在结合位点, 猜测 LOX 1 可能是 Let 7d 的一个靶基因用 Trizol 提取细胞总 RNA 并反转录为 cdna, 使用 LOX 1 的 3 UTR 引物进行 PCR 扩增, 并将其克隆至 pmirglo, 构建 pmirglo LOX 1 WT 载体利用 TaKaRa 点突变试剂盒突变 pmir GLO LOX 1 WT 上 Let 7d 结合位点来构建 pmir GLO LOX 1 Mut 载体利用 Lipofectamine2000 将 LOX 1 WT 或 LOX 1 Mut 报告载体联合 NC 或 Let 7d 转染至 HUVECs 中,48h 后使用 DualLuciferase ReporterAssaySystem 试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性实验重复 3 次 1.6 HUVECs 凋亡检测取个对数生长期 HUVECs 接种至 6 孔板中, 在培养基中加入终浓度为 50mg/L 的 ox LDL, 培养 48h; 另取转染 NC 或 Let 7d 后的 HUVECs 加入 50mg/L 的 ox LDL 继续培养 48h 用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化收集细胞, 冷的 PBS 洗 2 次, 上流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况实验重复 3 次 1.7 统计学处理采用 SPSS21.0 进行统计学分析 0h 组 24h 组和 48h 组间 LOX 1 蛋白表达及 Let 7d 表达的比较均采用单因素方差分析, 两两比较采用 LSD t 检验 ;NC 组和 Let 7d 组间荧光素酶活性的比较采用两独立样本的 t 检验 ;NC 组 Let 7d 组 NC+ox LDL 组和 Let 7d+ox LDL 组间 LOX 1 蛋白和 mrna 表达细胞凋亡率及 Caspase3 Bax Bcl 2 蛋白表达的比较均采用 2 2 析因设计的方差分析检验水准 α= 结果 2.1 ox LDL 诱导 HUVECs 中 LOX 1 和 Let 7d 表达的变化结果显示,ox LDL 诱导细胞中 LOX 1 表达增加,Let 7d 表达降低 ( 图 1 表 1)

JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Sep. 2018 Vol.53 No.5 567 2.3 Let 7d 对 HUVECs 中 LOX 1mRNA 和蛋白表达的影响结果见图 3 表 3 2.

02 0.98±0.04 24h 组 3 0.41±0.04 0.49±0.05 48h 组 3 0.52±0.03 # 0.34±0.03 # F 70.580 201.700 P <0.001 <0.001 : 与 0h 组相比,P<0.05;#: 与 24h 组相比,P<0.05 2.

;2:NC+ox LDL 组 ;3:Let 7d 组 ;4:Let 7d+ox LDL 组图 3 各组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白表达的检测组别表 3 各组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白和 mrna 相对表达量的比较 n LOX 1 蛋白相对表达量 LOX 1mRNA 相对表达量 NC 组 3 0.38±0.04 1.00±0.06 NC+ox LDL 组 3 0.94±0.

4 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Sep Vol.53 No Let 7d 对 HUVECs 中 LOX 1mRNA 和蛋白表达的影响结果见图 3 表 Let 7d 对 ox LDL 诱导 HUVECs 凋亡及相关蛋白表达的影响结果见图 4 表 4 1:0h 组 ;2:24h 组 ;3:48h 组图 1 ox LDL 诱导 HUVECs 中 LOX 1 蛋白的表达表 1 3 组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白及 Let 7d 相对表达量的比较组别 n LOX 1 蛋白相对表达量 Let 7d 相对表达量 0h 组 ± ± h 组 ± ± h 组 ±0.03 # 0.34±0.03 # F P <0.001 <0.001 : 与 0h 组相比,P<0.05;#: 与 24h 组相比,P< Let 7d 与 LOX1 的靶向调控关系 TargetScan 在线预测网站预测发现 LOX 1 是 Let 7d 潜在靶基因,LOX 13 UTR 中含有与 Let 7d 反向互补结合的核苷酸序列 ( 图 2) 双荧光素酶报告基因实验结果显示,Let 7d 显著降低了 LOX 1 WT 荧光素酶活性, 而对 LOX 1 Mut 荧光素酶活性无影响 ( 表 2) 1:NC 组 ;2:NC+ox LDL 组 ;3:Let 7d 组 ;4:Let 7d+ox LDL 组图 3 各组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白表达的检测组别表 3 各组 HUVECs 中 LOX 1 蛋白和 mrna 相对表达量的比较 n LOX 1 蛋白相对表达量 LOX 1mRNA 相对表达量 NC 组 ± ±0.06 NC+ox LDL 组 ± ±0.40 Let 7d 组 ± ±0.05 Let 7d+ox LDL 组 ± ±0.13 F Let 7d (P) (0.009) (0.011) F ox LDL (P) (<0.001) (<0.001) F 交互 (P) 9.452(0.015) 8.338(0.021) 图 2 Let 7d 与 LOX 1 的 3 UTR 互补结合表 2 2 组 HUVECs 中荧光素酶活性比较组别 n 荧光素酶活性 LOX 1 Mut LOX 1 WT NC 组 ± ±0.08 Let 7d 组 ± ±0.09 t P < :NC 组 ;2:NC+ox LDL 组 ;3:Let 7d 组 ;4:Let 7d+ox LDL 组图 4 各组 HUVECs 中凋亡相关蛋白表达的检测

5 568 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期表 4 各组 HUVECs 细胞凋亡率及 Caspase3 Bax Bcl 2 蛋白相对表达水平的比较组别 n 细胞凋亡率 /% Caspase3 Bax Bcl 2 NC 组 ± ± ± ±0.13 NC+ox LDL 组 ± ± ± ±0.02 Let 7d 组 ± ± ± ±0.14 Let 7d+ox LDL 组 ± ± ± ±0.06 F Let 7d (P) 8.358(0.028) (<0.001) (0.006) (<0.001) F ox LDL (P) (<0.001) (<0.001) (<0.001) (<0.001) F 交互 (P) (<0.001) (<0.001) (<0.001) 9.852(0.013) 3 讨论内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的一个关键特征, 其中包括内皮细胞增殖缺陷和异常的细胞凋亡 [12] 动脉粥样硬化中的高脂血通常会导致内皮细胞损伤死亡以及从血管壁的分离, 进而失去对白细胞的抗黏附性作用, 增加内皮壁对循环脂质的渗透性, 最终导致动脉粥样硬化病变形成 [13] 因此, 内皮细胞对维持内皮细胞壁完整性是必不可少的, [14] 其通过修复血管来抵抗损伤已有研究证实, 高脂血症导致的 ox LDL 水平升高能够通过抑制内皮细胞增殖所必需的碱性成纤维细胞生长因子表达来抑制内皮细胞增殖 LOX 1 表达于内皮细胞膜上, 动脉粥样硬化病理状态下,LOX 1 通常高表达, 急性炎症条件下,LOX 1 细胞外结构域可作为可溶性 LOX 1(sLOX 1) 从细胞膜释放到血液循环中,sLOX 1 现已作为动脉粥样硬化的一个潜在诊断和预后指标 [15 16] LOX 1 是 ECs 摄取 ox LDL 的主要受体, 在 ox LDL 致 HUVECs 毒性作用中起了关键作用 [17] 内皮特异性 LOX 1 过度表达增加主动脉 ox LDL 水平, 导致内皮功能障碍血管炎症和斑块形成 [18] 因此, 抑制 LOX 1 的表达来逆转 ox LDL 诱导的内皮细胞凋亡可能代表了遏制动脉粥样硬化发生发展的治疗新机制 [19] [4] 先前的研究表明,ox LDL 能够刺激内皮细胞中 LOX 1 的表达, 且 ox LDL 被 LOX 1 摄取, 可诱导细胞发生病理变化, 包括衰老和细胞凋亡, 本研究结果与其一致 : 用 50mg/L 的 ox LDL 处理 HUVECs 可上调 LOX 1 表达, 并且也可诱导细胞凋亡增加有 [13] 研究表明, 升高的 LOX 1 亦进一步促进了细胞对 ox LDL 的摄取,ox LDL/LOX 1 正反馈环路可能进一步促进了疾病的发展, 提示 LOX 1 可能是治疗血管内皮功能障碍的靶标基于 LOX 1 在 ox LDL 诱导内皮细胞凋亡中的作用, 作者猜测 mirna 可能参与调控 ox LDL 诱导的 HUVECs 中 LOX 1 的表达和活性通过 TargetScan 生物信息学分析发现 LOX 1 是 Let 7d 的潜在靶标, 并且 ox LDL 可下调 Let 7d 的表达, 这与 ox LDL 诱导 LOX 1 表达结果呈相反趋势为进一步研究 Let 7d 和 LOX 1 之间调控关系, 本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了 Let 7d 能够直接结合 LOX 1mRNA 的 3 UTR 种子序列此外, 本研究将 Let 7d 模拟物转染至 HUVECs 中, 亦发现其可抑制 ox LDL 诱导的 LOX 1 表达, 上述结果表明,Let 7d 能够靶向结合 LOX 1 的 3 UTR 抑制 LOX 1 表达细胞凋亡是通过涉及死亡受体或线粒体信号传导途径的两个主要信号途径诱导的在线粒体凋亡信号通路中, 细胞膜电位发生改变, 导致细胞色素 c 的释放和 Caspase 信号通路的激活,Caspase3 被认为是凋亡过程中的关键因子或调节因子 [20] 细胞凋亡也受到几种凋亡相关蛋白的调节, 包括作为抗死亡因子的 Bcl 2 和促凋亡因子的 Bax [21] [11] 研究证实,ox LDL 能够通过与 LOX 1 相互作用参与调控 Fas 介导的内皮细胞凋亡, 并且 ox LDL 通过 LOX 1 下调抗凋亡蛋白 Bcl 2 和抑制性细胞凋亡蛋白 1 的表达, 从而激活细胞凋亡信号转导途径, 诱导细胞凋亡在本研究中,ox LDL 在增加 LOX 1 蛋白表达水平的同时, 增加了 Caspase3 和促凋亡蛋白 Bax 的表达, 降低了抗凋亡蛋白 Bcl 2 的表达, 而转染 Let 7d 后则逆转了 ox LDL 对 Caspase3 和 Bax 的诱导作用, 并促进了抗凋亡蛋白 Bcl 2 的表达总之, 本研究结果表明,Let 7d 通过抑制 ox LDL 对 HUVECs 中 LOX 1 表达的诱导, 逆转了 ox LDL 诱导的内皮细胞凋亡, 对内皮细胞起到一定的保护作用本研究结果将可能为内皮损伤的分子机制和动脉粥样硬化的发病机制提供新见解,Let 7d 可能成为治疗动脉粥样硬化中内皮细胞功能障碍的新靶标参考文献 [1] 陆攀, 宋佳希.miR 181 在动脉粥样硬化相关血管炎症和免疫调节中的研究进展 [J]. 临床检验杂志,2017,35

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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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