0,(9) 李斌等 : 重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测胞介素 -(IL-) [] IL- 按其结构不同分为 IL-α 和 IL-β IL-α 基因定位于号染色体, 含个外显子,IL-α 的前体是由 IL-α 基因合成的无信号肽的 kd 分子 IL-α 前

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勉姻邱
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 0, (9):-0 重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测李斌许晓亚杨刚刚崔晴晴杨亚娟徐存拴河南师范大学生命科学学院河南省一科技部共建细胞分化国家重点实验室培育基地和河南省生物工程重点实验室新乡 00 摘要在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素 -α rhil-α 优化 rhil-α 的发酵工艺及纯化方法以获得高表达高纯度具有生物学活性的 rhil-α 通过 PCR 扩增获得 hil-α 基因构建其真核表达载体 ppiczαa/hil-α 电转化至毕赤酵母 X- 用 PCR 和 SDS-PAGE 方法筛选高效表达 rhil-α 的工程菌株并进行 Western blot 鉴定 DEAE 弱阴离子离子交换层析一步纯化表达产物并用 MTT 法初步检测其对人肝癌细胞 0 的生物学作用 rhil-α 在摇瓶规模下经甲醇诱导 d 后表达量约为 0 mg/l Western blot 检测 rhil-α 的特异性结合获得纯度约 9% 收率 0% 左右的 rhil-α 并证明 rhil-α 能够抑制人肝癌细胞 0 的增殖构建了重组 hil-α 的基因工程菌并在毕赤酵母中实现了高效表达为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础关键词重组人白细胞介素 -α 毕赤酵母表达纯化人肝癌细胞 DOI 0.0/j.cnki.biotech.bull Expression Purification and Bioactivity of Recombinant Human Interleukin-α Expressed in Pichia pastoris Li Bin Xu Xiaoya Yang Ganggang Cui Qingqing Yang Yajuan Xu Cunshuan State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation and Henan Bioengineering Key Laboratory Henan Normal University College of Life Science Henan Normal University Xinxiang 00 Abstract: This work is to secret and express human interleukin-α rhil-α in Pichia pastoris and optimize the fermentation and purification process of rhil-α for obtaining the rhil-α with high-purity, high-expression and owing biological activity. The gene hil-α amplified by PCR was constructed into the eukaryotic expression vector ppiczαa/hil-α, and then it was transformed into the P. pastoris X- strain via electroporation The engineering strain with high-expression of rhil-α was screened and assayed by the methods of PCR and SDSPAGE, further indentified by Western blot. The expressed product was purified by the DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography, and the bioactivity of it to human cancer Bel-0 cell was initially assayed. Results showed that inducing rhil-α by methanol for d at shaking flask level, the expression reached 0mg/L, the test by Western blot revealed that specific binding activity of rhil-α was detected the purity of the rhil-α reached about 9 and the yield was about 0% rhil-α inhibited the proliferation of Bel-0 cells. In conclusion, recombinant engineering vector of rhil-α was successfully constructed, and it was highly expressed in P. pastoris, which lays groundwork for further study of its function and bioactivity. Key words: recombinant human interleukin-α Pichia pastoris expression purification Bel-0 cell 9 年 Gery 等从人白细胞的培养上清中提取因子或内源性热原质破骨细胞刺激因子黑素瘤得到一种可溶性物质起初被命名为淋巴细胞激活细胞生长抑制因子等在 99 年被统一命名为白细收稿日期 0-- 基金项目国家 9 前期研究专项 0CB0 河南省自然科学基金项目河南省重大科技攻关项目作者简介李斌女硕士研究方向微生物药物研究与开发 libin880@.com 通讯作者徐存拴男教授研究方向微生物药物研究与开发 cellkeylab@.com

2 0,(9) 李斌等 : 重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测胞介素 -(IL-) [] IL- 按其结构不同分为 IL-α 和 IL-β IL-α 基因定位于号染色体, 含个外显子,IL-α 的前体是由 IL-α 基因合成的无信号肽的 kd 分子 IL-α 前体被 Ca + 依赖的钙蛋白激酶降解为 kd 的成熟体, 等电点为.,IL-β 是由个氨基酸以 β- 折叠的形式组成位于号染色体, 分子量约为. kd, 等电点为. IL-α 和 β 在同一种属中两者的同源性只有 0%-0%, 但在不同种属间具有较高同源性, 分别为 0%-0% 和 %-8% [,] IL-α 具有很重要的研究意义和应用价值, 文献报道 IL-α 在白血病肝癌黑色素瘤胃癌等在内的多种肿瘤中均有表达 [-], 而其表达机制尚不清楚临床试验表明,0 ng/kg IL-α 可治疗骨髓或干细胞移植期间早期血小板的减少 [,8] 头颈部临床试验 III 期发现,IL-α 具有重要的免疫治疗作用 (Cel-Sci Corp) [9] 目前,IL-α 主要通过原核表达系统制备, 而真核表达系统尚未见报道由于原核表达体系存在产量低, 操作复杂, 后期复性困难等问题为得到表达量高活性高的 IL-α, 更好地研究 IL-α 的特性和功能, 本研究利用巴斯德毕赤酵母表达 hil- α, 在 L 摇瓶规模下对其进行表达条件优化和分离纯化方法探索, 同时, 对 hil-α 的活性进行了初步研究材料与方法. 材料 E.coli DHα 购自武汉晶赛生物工程技术有限公司, 毕赤酵母 X- 菌株和 ppiczαa 分泌型酵母表达载体购自 Invitrogen 公司, 重组人白细胞介素 -α 基因委托上海生工生物工程有限公司合成, 兔多抗人 IL-α 抗体和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔二抗购自 Invitrogen 公司, 人肝癌细胞 (Bel- 0) 购自中科院上海细胞库,RPIM0 培养基购自 Invitrogen 公司, 胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司,MTT DMSO 购自 Geneview 公司, 限制性内切酶 SacI BamH I 和 EcoR I 等购自 MBI 公司, Protein Ladder 购自北京康为世纪生物科技有限公司, 考马斯亮蓝 G-0( 分析纯 ) 购自中国医药公司, 牛血清白蛋白 ( 生化试剂 ) 购自西安沃尔森生物技术有限公司, 其他试剂为国产分析纯. 方法.. 人白介素 -α 基因 (hil-α) 的设计及载体的构建在 GenBank 上搜索得到 IL-α 基因的全序列 (NM_000), 通过查阅文献确定 IL-α 蛋白的成熟序列, 利用在线序列优化工具对 IL-α 核苷酸序列进行人工优化 (http :// 在不改变氨基酸序列的情况下, 密码子替换为高频使用或次高频使用的密码子 [0] 人工合成优化( 终止序列调整密码子优化并提高 GC 含量 ) 后的 IL-α 基因序列连接至 T 载体, 进行测序, 用 EcoR Ⅰ/ Not Ⅰ 双酶切 IL-α/pUC-T 及质粒 ppiczαa, 回收目的基因片段和载体片段进行连接, 连接产物转化至 DHα 感受态, 经蓝白斑筛选阳性克隆提取质粒进行 PCR 和双酶切鉴定, 结果正确后进行测序以上操作由上海生工生物有限公司完成.. 酵母分泌型表达载体的转化重组表达质粒 ppiczαa/hil-α 以 Sac I 线性化, 按毕赤酵母表达手册中电转化方法, 将重组表达质粒转至毕赤酵母 X- 感受态细胞, 将转化的 X- 涂于含 00 μg/ml 博来霉素 (Zeocin) 的 YPD 平板上,8 培养 d 至长出菌落, 在 YPD 平板上随机挑取 8 个克隆, 扩大培养后提取酵母基因组 DNA, 以之为模板,PCR 鉴定目的基因是否整合到酵母染色体.. rhil-α 摇瓶规模表达随机挑取个鉴定正确的菌种接种到 0 ml YPG 培养基 /0 ml 三角瓶中, 于 8 0 r/min 摇床培养 8- h, 当 OD 值达到 0 时, 取 ml 菌液, 接种到 00 ml BMGY 培养基 / L 三角瓶中, 于 8 80 r/min 继续培养 h 后, 加入终浓度为 %(V/V) 的甲醇进行诱导表达, 培养条件调整为 8 00 r/min 每 h 补加一次甲醇, 补加量为发酵液体积的 %(V/V) 分别取诱导 h 的发酵液于 000 r/min 离心 min, 取 ml 上清进行三氯乙酸 (TCA) 后, 进行 %SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白表达.. rhil-α 摇瓶发酵规模条件优化... 最佳体积和转速试验毕赤酵母是好氧微生物, 溶解氧浓度对菌体的生长和产物的表达有很大的影响, 溶氧过低会抑制菌体生长, 过高则会促

3 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 0,Vol.,No.9 进菌体的新陈代谢加快, 加速菌体死亡, 造成蛋白过早降解, 不利于目的蛋白积累转速调节是改变发酵过程中溶解氧的重要方式, 较高的转速会提高氧的体积系数, 增加发酵液中氧的供给, 但同时会加剧细胞的死亡速率, 降低产物的表达量 [] 因此, 我们设计了以下正交实验研究在 L 摇瓶条件下 rhil-α 诱导表达的最佳装液量和转速, 参数设置如下 : 体积设置 :00 ml 00 ml 00 ml ; 转速设置 :00 r/min 00 r/min 00 r/min 以上实验每组设定次重复, 在诱导最佳时间进行取样,SDS- PAGE 电泳检测蛋白表达情况, 确定诱导表达的最佳体积和转速... 最佳 ph 试验酵母菌生长最适 ph 范围为.0-.0,pH 过低会影响膜表面电荷的性质及膜的通透性, 过高则会抑制菌体中某些酶的活性 [], 通过调节初始 ph 值来考察 ph 对 rhil-α 表达的影响本研究设定 ph 梯度为 : 每组设定次重复... 最佳温度试验一般而言, 毕赤酵母的最佳生长温度为 8-0, 当温度升高到时毕赤酵母菌株不能正常生长, 温度对毕赤酵母发酵产物的活性发酵液的物理性质及合成方向等有重要的影响研究表明, 在发酵过程中, 诱导表达时的温度低于菌体生长时的温度更加有利于蛋白的表达 [] 为此本实验对 rhil-α 温度优化为最佳甲醇浓度试验在毕赤酵母诱导表达过程中, 甲醇作为诱导剂和碳源双重身份影响目的蛋白的表达, 过低或者过高均影响目的蛋白的表达, 因此合适的甲醇浓度是提高外源蛋白表达量的又一个关键因素文献报道 [,], 甲醇添加量一般为 0.%-% 为了研究在 L 摇瓶条件下诱导表达的最佳甲醇浓度, 本实验设置了 0.% 0.% 0.% % 四个梯度.. rhil-α 的分离纯化取诱导 d 的发酵液于, 000 g 离心 0 min, 收集上清进行 0 kd 超滤浓缩取蛋白浓缩液进行 DEAE 弱阴离子交换层析柱进行纯化用 buffer A(0 mmol/l Na HPO ph8.0) 平衡柱子, 样品以 ml/min 的流速流穿离子交换树脂, 然后用 buffer B(buffer A 中含有 0-00 mmol/l NaCl ph8.0) 进行梯度洗脱, 紫外检测仪监控, 收集各洗脱峰,SDS-PAGE 进行检测.. rhil-α 蛋白免疫印迹检测蛋白免疫印迹按 [] Towbin 等方法进行 rhil-α 进行 SDS-PAGE 后, 将 rhil-α 转移到 PVDF 膜上, 用 IL-α 兔多抗一抗室温孵育 h,tbst 洗涤次, 再与辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔二抗室温孵育 h,tbst 洗涤次, 超敏 ECL 底物发光显色, 用 Typhoon 00 扫描仪和图像定量软件进行定量分析.. 考马斯亮蓝法 (Bradford) 测定蛋白浓度以纯的牛血清白蛋白作为标准品, 取 ml 标准品于 0 ml 试管中, 加水至 ml, 然后加入 ml 的 G-0 溶液, 混匀, 静止 0 min, 在 9 nm 处测其吸光值制定标准曲线 [] 取样品溶液 0. ml, 做个重复, 以水作空白对照, 测其吸光值, 并计算蛋白浓度..8 rhil-α 的生物学活性检测人肝癌细胞 0 (Bel-0) 于含 0% 胎牛血清的 RPMI-0 培养基, %CO 饱和湿度条件下培养, 取对数生长期的细胞, 于 000 个 / 孔接种至 9 孔板中培养 h, 待细胞贴壁后弃培养基, 更换含有不同浓度 rhil-α (0 0 0 ng/ml) 的培养基, 每组设个平行孔继续培养 h 后, 每孔加入 mg/ml MTT 溶液 0 μl, 于培养箱中培养 h, 弃掉培养基, 每孔加入 DMSO 0 μl, 摇动培养板 min, 使细胞内结晶全部溶解, 用 Biotek reader 酶标仪在 90 nm 处测其吸收值, 检测 rhil-α 对 Bel-0 细胞增殖的影响结果. 重组质粒 ppiczαa/hil-α 的构建和鉴定用碱裂解法提取 hil-α 质粒, 并分别进行单双酶切和 PCR 扩增,% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 ( 图 ) 显示, 重组质粒经 Sac Ⅰ 单酶切后出现一条 kb 左右条带 BamH I 和 EcoR Ⅰ 双酶切后出现 kb 和 00 bp 左右的条带用载体通用引物进行 PCR 扩增出现一条 kb 左右的特异性扩增条带, 与预期片段大小一致, 经上海生工生物公司测序证明其序列正确

李斌等重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测 0,(9) kd 0000 8000 M A 000 bp 000 M 8 000 00 000 00 0 B kd M X- M 0000 Marker IL-α/pPICZαA 的 PCR IL-α/pPICZαA 的双酶切 IL-α/pPICZαA 的单酶切

重组表达质粒 ppiczαa/hil-α 转化毕赤酵母菌 X- 后在 YPD 平板上随机挑取 8 个克隆扩大培养 C 提取基因组后进行 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电 Control X- 泳分析图 -A 8 个转化子在 000 bp 位置均出现预期条带证明 hil-α 基因已经整合到酵母基因 A PCR 鉴定 M 000marker -8 随机挑取

在相对分子质量约 X- 空载 rhil-α 图 kd 处出现考马斯染色条带与 hil-α 的分子量一致且在甲醇诱导第天表达量最高经 Western blot 鉴定图 -C 目的条带均有阳性反应说明 rhil-α 正确表达.

将菌种分别接种于不同体积 BMGY 8 9 00 00 00 ml 培养基中于 8 80 r/min 摇床振荡培养至 OD00=- 分别取瓶含 00 00 00 ml 培养基的三角瓶放于 00 r/min 的摇床培养剩余瓶分别放于 00 r/min 和 00 r/min 摇床培养表每隔 h

4 李斌等重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测 0,(9) kd M A 000 bp 000 M B kd M X- M 0000 Marker IL-α/pPICZαA 的 PCR IL-α/pPICZαA 的双酶切 IL-α/pPICZαA 的单酶切 IL-α/pPICZαA 的质粒图. rhil-α 三种不同表达载体质粒鉴定结果 8. rhil-α的表达与鉴定. 重组表达质粒 ppiczαa/hil-α 转化毕赤酵母菌 X- 后在 YPD 平板上随机挑取 8 个克隆扩大培养 C 提取基因组后进行 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电 Control X- 泳分析图 -A 8 个转化子在 000 bp 位置均出现预期条带证明 hil-α 基因已经整合到酵母基因 A PCR 鉴定 M 000marker -8 随机挑取 8 个克隆 B SDS-PAGE 组中对鉴定正确的重组菌株进行 L 规模摇瓶筛选 M 蛋白 marker X- 空载 h 取不同时间表达上清进行 SDS-PAGE 检测和 Western rhil-α 表达量 C Western blot 鉴定 Control 阳性对照大鼠肝组织 blot 鉴定结果图 -B 显示在相对分子质量约 X- 空载 rhil-α 图 kd 处出现考马斯染色条带与 hil-α 的分子量一致且在甲醇诱导第天表达量最高经 Western blot 鉴定图 -C 目的条带均有阳性反应说明 rhil-α 正确表达... rhil-α摇瓶条件的优化培养基体积和转速对 rhil-α 的影响取表 rhil-α 鉴定结果培养基体积和转速对 rhil-α 表达的影响转速 / r min- 培养基量 /ml X-/pPICZαA/hIL-α 菌株进行活化培养当 OD00 X- 值达到 0 时将菌种分别接种于不同体积 BMGY ml 培养基中于 8 80 r/min 摇床振荡培养至 OD00=- 分别取瓶含 ml 培养基的三角瓶放于 00 r/min 的摇床培养剩余瓶分别放于 00 r/min 和 00 r/min 摇床培养表每隔 h 添加甲醇至终浓度为 % 诱导 d 取 ml 上清进行 TCA 处理后 SDSPAGE 电泳检测图发现随着体积的增大蛋 X- 对照培养基 00 ml 00 r/min 00 ml 00 r/min 00 白表达量降低当转速为 00 r/min 时蛋白表达量 ml 00 r/min 00 ml 00 r/min 00 ml 00 r/min 00 ml 优于 00 r/min 和 00 r/min rhil-α 发酵培养最佳体积和转速为 00 ml/l 00 r/min.. ph 对 rhil-α 表达的影响分别取 ml 菌液 00 r/min 00 ml 00 r/min 8 00 ml 00 r/min 9 00 ml 00 r/min 图培养基体积和转速对 rhil-α 表达的影响接种到 ph 为的 BMGY 培养

生物技术通报 Biotechnology Bulletin 8 0,Vol.,No.9 X- 0.% 0.% 基进行培养 SDS-PAGE 检测图表明当 ph < 0.% %. 时随着 ph 的降低蛋白的表达量逐渐下降 X-..0..0. 图不同甲醇浓度对 rhil-α的影响图不同 ph 对 rhil-α 的影响当 ph >.

. 温度对 rhil-α 表达的影响 rhil-α 培养进入诱导阶段时培养温度分别更改为 0 原液 - 不同盐梯度洗脱 0-00 mmol/l 9 诱导 9 h 后取发酵液进行 SDS-PAGE 检测 X- 0ć ć ć 9ć 图

rhil-α抑制人肝癌细胞0的增殖不同浓度的 rhil-α 处理 Bel-0 细胞后 MTT 法检测细胞的活力结果如图 8 所示 0 ng/ml rhil-α 处理细胞 h 后与对照比有显著的差异图不同温度对

0 图 8 表明 rhilα 对人肝癌细胞 0 具有一定的杀伤力能抑制表达量最低当温度为时 rhil-α 表达量最高.0.. 0.9 甲醇浓度对 rhil-α 表达的影响 rhil-α 进 0.

5 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 8 0,Vol.,No.9 X- 0.% 0.% 基进行培养 SDS-PAGE 检测图表明当 ph < 0.% %. 时随着 ph 的降低蛋白的表达量逐渐下降 X 图不同甲醇浓度对 rhil-α的影响图不同 ph 对 rhil-α 的影响当 ph >. 时随着 ph 的增大蛋白的表达量显著降低在 ph. 时 rhil-α 的表达量最高.. 温度对 rhil-α 表达的影响 rhil-α 培养进入诱导阶段时培养温度分别更改为 0 原液 - 不同盐梯度洗脱 0-00 mmol/l 9 诱导 9 h 后取发酵液进行 SDS-PAGE 检测 X- 0ć ć ć 9ć 图 rhil-α 各步分离纯化 SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE 检测发现在 00 mm NaCl 处可以洗脱下单一的目的蛋白图蛋白纯度为 9% 经 Bradford 法测定蛋白收率为 0% 左右. rhil-α抑制人肝癌细胞0的增殖不同浓度的 rhil-α 处理 Bel-0 细胞后 MTT 法检测细胞的活力结果如图 8 所示 0 ng/ml rhil-α 处理细胞 h 后与对照比有显著的差异图不同温度对 rhil-α 的表达影响结果图表明当温度为 9 时重组蛋白的 P<0.0 当 rhil-α 的浓度为 0 ng/ml 时与对照比有极显著差异 P<0.0 图 8 表明 rhilα 对人肝癌细胞 0 具有一定的杀伤力能抑制表达量最低当温度为时 rhil-α 表达量最高甲醇浓度对 rhil-α 表达的影响 rhil-α 进 0.8 入诱导期后在 00 r/min 下培养甲醇浓度所示随着甲醇浓度的增加重组蛋白的表达量随着提高当添加甲醇浓度为 % 时 rhil-α 的产量达到最高. rhil-α的分离纯化 0. OD 分别设为 0.% 0.% 0.%.0% 结果如图取诱导 d 发酵液经过离心 0 kd 膜包浓缩 DEAE 弱阴离子交换层析方法收集各洗脱峰图8 0 0 rhil-α/ ng ml- 0 不同浓度 rhil-α 对 Bel-0 细胞的影响

6 0,(9) 李斌等 : 重组人白细胞介素 -α 在毕赤酵母中的表达纯化及生物学活性检测 9 癌细胞的增殖生长讨论 IL-α 作为重要的促炎性细胞因子参与多种生理活动, 如修复增殖凋亡细胞迁移分化细胞坏死等, 在角膜受损研究中发现,IL-α 参与到 NF-κB 信号通路调控受损角膜的修复 [8] 在非小细胞肺癌的胸腔积液中 IL-α 处于一个高表达水平, 它可作为潜在诊断非小细胞肺癌的生物标志物 [9,0] 研究表明, 当人永生化角质形成细胞 (HaCaT) 受中波紫外线 (UVB) 照射时, 细胞分泌大量的 IL-α,IL-α 下调 HaCaT 细胞水通道蛋白 (AQP) 的表达, 这一作用可能和皮肤光老化的发生有关 [] [] 李树等的研究发现, 在小鼠皮肤受损修复过程中,IL-α 在受损早期有一次表达高峰, IL-α 可作为损伤早期时间推断的一个指标因此, IL-α 在组织受损肿瘤自身免疫性疾病等方面具有重要的潜在临床研究价值本实验选用毕赤酵母野生型 X- 菌株, 它具有生命力强无回复突变分泌能力强能在 YPD 和最小规模培养基中生长等优点 [] 根据酵母在密码子上使用偏爱性, 在不改变氨基酸序列的情况下, 通过调整终止序列提高 GC 含量对 hil-α 序列进行优化, 把 hil-α 的成熟肽连在 α- 交配因子信号肽的 C 端,AOX 启动子诱导 hil-α 在毕赤酵母中分泌表达蛋白产量与发酵条件密切相关, 为此, 本实验分别从装液量转速温度 ph 甲醇浓度个方面对 rhil-α 的发酵条件进行优化研究表明, 装液量和转速直接影响培养基中溶解氧的浓度, 在发酵过程中, 溶解氧浓度对外源蛋白的表达具有十分重要的影响, 过高或过低都不利于蛋白的表达 [,] 实验结果显示, 在装液量为 00 ml/ L, 转速 00 r/min 时, 蛋白表达量最高, 过多的装液量和过高的转速均不利于蛋白的表达也有研究表明, 适当的升高温度, 有利于细胞的生长代谢和蛋白的表达, 但温度过高会使菌体提早衰老, 降低蛋白的表达量 [] 本实验从 0-9 对 rhil-α 的表达进行研究发现, 随着温度的升高, 蛋白产量增加, 当温度 > 时, 蛋白产量随着下降因此, 在诱导阶段适当的降低温度可以减少菌体的死亡, 同时也可保护蛋白不被降解 [] ph 是影响蛋白表达的又一关键参数, 适宜的 ph 不仅有利于蛋白的表达, 同时也可防止蛋白酶降解, 易于后续的纯化工作结果表明,pH 为. 时, 最有利于 rhil-α 的表达在发酵过程中, 定时定量地补加甲醇对蛋白的表达具有至关重要的影响 [,] 过低不够蛋白的表达, 过高则会导致菌体死亡, 降低蛋白产量本研究发现, 随着甲醇浓度的升高, 蛋白产量随着增加, 在 % 时产量达到最多本研究用毕赤酵母表达 hil-α, 仅用一步层析纯化, 获得纯度高达 9% 以上的重组蛋白与原核表达体系相比, 减少了破壁复性等复杂的纯化步骤, 提高蛋白的收率, 降低了生产成本对纯化后的 rhil-α 进行活性检测发现,rhIL-α 能抑制 Bel- 0 细胞的增殖, 与文献报道一致 [,8,9] 本研究为深入探讨 IL-α 功能机理提供了良好的条件, 同时也为其产业化生产奠定了坚实的基础结论成功构建了 rhil-α 的毕赤酵母表达体系, 对其摇瓶发酵条件进行了优化, 最适的发酵条件为装液量为 00 ml/ L 摇瓶初始 ph 为. 诱导转速 00 r/min, 诱导温度为, 甲醇添加量为 %, 每 h 补加一次, 诱导 d, 最终获得 rhil-α 的最高产量约 0 mg/l, 较优化前提高了.9% 用 DEAE 弱阴离子交换层析一步法对其进行纯化, 得到纯度高达 9%, 得率约 0%, 能抑制 Bel-0 细胞增殖的 rhil-α 参考文献 []Dinarello CA. IL- :disoveries, controversies and future directions [J]. Eur J Immunol, 00, 0():99-0. []Sims JE, March CJ, Cosman D, et al.cdna expression cloning of the IL- receptor, a member of the immunoglobulin superfamily[j]. Science, 988, (8):8-89. []Chizzonite R, Truitt T, Kilian PL, et al. Two high-affinity interleukin receptors represent separate gene products[j]. Proc Natl Acad USA, 989, 8(0): [] 刘海燕. 抗人 IL-α 单克隆抗体及其应用 : 中国, [P]

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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽