中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 21 tetracycline (tetk, tetl, t

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鹄昌
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1 20 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 临床论著新生儿侵袭性感染 B 族链球菌的耐药表型及耐药机制 1, 摘要目的通过分析侵袭性感染新生儿的 B 族链球菌 (GBS) 临床分离株的耐药性和耐药基因型, 为新生儿 GBS 感染的防治和抗菌药物的合理应用提供理论依据方法收集 2013 年 1 月至 2016 年 6 月就诊于广东省 4 家医院 GBS 侵袭性感染 < 90 d 新生儿病例使用 VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统对 GBS 分离株进行鉴定和抗菌药物最小抑菌浓度 (MIC) 测定 ; 应用 PCR 方法进行红霉素和四环素耐药基因检测结果确诊新生儿 GBS 侵袭性感染 93 例, 其中 34 例 (36.6%) 早发型,59 例 (63.4%) 晚发型 93 株 GBS 分离株药物敏感试验结果显示,GBS 对青霉素类头孢菌素类利奈唑胺和万古霉素均 100% 敏感 ; 对左氧氟沙星氧氟沙星和阿奇霉素的耐药率较低, 分别为 8.6% 2.2% 和 1.1% 对红霉素克林霉素和四环素的耐药率高, 分别为 60.2% 78.5% 和 93.5%; 耐药表型以固有表型 (cmls B ) 为主, 占 53.9%, 其次为 L 表型 (26.3%) 诱导表型 (imls B )(15.8%) 和 M 表型 (3.9%) 56 株红霉素耐药菌株 ermb 基因的携带率为 85.7%,2 株 (3.6%) 耐药菌株同时携带 ermb 和 mefa 基因, 均未检出 erma 87 株四环素耐药菌株中, 四环素耐药基因 teto 和 tetm 携带率分别为 74.7% 和 46%, 其中 25 株同时携带 teto 和 tetm, 均未检出 tetl 和 tetk 基因结论青霉素和氨苄西林仍是治疗新生儿侵袭性 GBS 感染及高危新生儿预防 GBS 感染的首选药物广东地区 GBS 红霉素耐药机制以 ermb 基因介导的核糖体靶位改变为主, 四环素耐药机制以 teto 和 tetm 基因为主关键词新生儿 ;B 族链球菌 ; 微生物敏感性试验 ; 耐药基因 Resistance patterns and mechanism of group B Streptococcus isolated from infants with invasive disease Li Juan 1, Gao Kankan 2, Rong Lili 2, Guan Xiaoshan 2, Deng Qiulian 2, Zhong Huamin 2, Long Yan 2, Gao Xiurong 2, Zhang Lihua 3, Mu Xiaoping 4, Yuan Chunlei 5, Ji Wenjing 6, Liu Haiying 2. 1 Department of Clinical Laboratory, Guangzhou Medical University Affiliated Tumor Hospital, Guangzhou , China; 2 Department of Clinical Laboratory, Guangzhou Women and Children s Medical Center, Guangzhou , China; 3 Department of Clinical Laboratory, Donghua Hospital of Dongguan, Dongguan, China; 4 Maternal and Child Health Hospital of Guangdong Provincial, Guangzhou, China; 5 Boai Hospital of Zhongshan, Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan, China; 6 Management and Clinical Pharmacy, Xi an Jiaotong University, Xi an, China Corresponding author: Liu Haiying, xiangliuhaiying@aliyun.com Abstract Objective To investigate the antibiotics resistance rates and the resistance mechanisms of erythromycin and tetracycline among group B Streptococcus (GBS)-positive isolates cultured from infants with invasive infection, and to provide a reliable evidence for the prevention and treatment of infants with invasive GBS infection. Methods From January 2013 to June 2016, the GBS strains isolated from infants with invasive diseases of < 90 days from four teaching hospitals were collected to investigate the current antimicrobial resistance status and resistance genes of these strains. The GBS isolates were identified and the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotics was determined by VITEK-2 Compact automatic bacterial identification system. Genes associated with resistance to erythromycin (erma, ermb, mefa) and DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 广东省科技计划项目 (No. 2015A ); 广州市卫生局西医类一般项目 (No A010040,No A010026,No A010034) 作者单位 : 广州市, 广州医科大学附属肿瘤医院检验科 1 ; 广州市, 广州市妇女儿童医疗中心检验科 2 ; 东莞市, 东莞东华医院检验科 3 ; 广州市, 广东省妇幼保健院 4 ; 中山市, 南方医科大学附属中山博爱医院 5 6 ; 西安市, 西安交通大学药物院药事管理与临床药学系通信作者 : 刘海英, xiangliuhaiying@aliyun.com

2 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 21 tetracycline (tetk, tetl, tetm, teto) were investigated using PCR amplification and DNA sequencing. Results Total of 93 non-duplicate colonizing GBS isolates were collected from infants with invasive GBS infection, among whom, 34 cases with early-onset infection and 59 cases with late-onset infection were diagnosed. All the isolates were susceptible to penicillins, cephalosporins, linezolid and vancomycin. The resistance of the isolates to levofloxacin, ofloxacin and azithromycin were 8.6 %, 2.2% and 1.1%, respectively. The resistance of isolates to erythromycin, clindamycin and tetracycline were significantly high, which were 60.2%, 78.5% and 93.5%, respectively. The most predominant phenotype was cmlsb (53.9%), followed by L phenotype (26.3%), imlsb (15.8%) and M phenotype (3.9%). Among the resistance genes investigated, tetm (46%) and teto (74.7%) were detected among tetracycline-resistant isolates and ermb (85.7%) and mefa (3.6%) were found among macrolide-resistant isolates. But erma was not detected. Conclusions For neonates and young infants, empirical treatment with penicillins and ampicillin at birth for all high-risk neonates were recommended. Ribosomal modification by ermb gene play major role in erythromycin resistance of GBS, and the tetracycline resistance mediated by teto and tetm genes were dominated. Key words Infant; Group B Streptococcus; Antimicrobial sensitivity test; Resistance gene B 族链球菌 (group B Streptococcus,GBS) 又称无乳链球菌 (S. agalactiae), 是孕产妇胃肠道和泌尿生殖道常见的定植菌群, 为引起孕产妇和新生儿围生期侵袭性感染的重要病原菌之一孕产妇 GBS 感染可导致胎膜早破脓毒性流产绒毛膜羊膜炎胎儿先天性肺炎和宫内死胎等 [1] 新生儿 GBS 感染可导致重症肺炎败血症和化脓性脑膜炎等新生儿免疫功能不完善, 血脑屏障功能差, 尤其是 < 90 d 的新生儿早产儿和低体重患儿更易发生败血症和化脓性脑膜炎 GBS 侵袭新生儿感染起病急, 首发症状非特异 ( 进食少昏睡易激惹发热和呼吸异常等 ) 病情发展凶险, 尽管当前重症监护室技术先进, 儿科医生及时采取抗菌药物及其他治疗措施, 仍有较高的发病率致残率和病死率, 仍是全球新生儿败血症和脑膜炎重要的病原菌之一, 且呈逐年增多的趋势 [1] 欧美等发达国家对 GBS 感染相关的疾病负担非常重视, 但中国等亚洲发展中国家研究资料较少, 疾病负担仍不确定近几年, 新生儿 GBS 感染逐渐引起国内医学界的重视, 但国内尚未制定统一的筛查和防治指南随着产时抗菌药物预防性治疗 (intrapartum antibiotic prophylaxis,iap) 方案的实施以及抗菌药物的过度使用, 近年来出现 GBS 部分抗菌药物严重耐药的现象 [2], 引起国内外普遍关注在孕妇感染或定植的 GBS 菌株耐药谱研究相对较多, 但新生儿 GBS 感染菌株的耐药谱研究较少 [3-15], 掌握新生儿 GBS 感染临床分离株的耐药情况, 对新生儿 GBS 感染的防治及疗效评估至关重要本研究通过收集广东地区 2013 年至 2016 年侵袭性感染新生儿分离的 GBS 菌株的耐药谱和耐药基因数据, 以期指导临床合理选用抗菌药物, 现报道如下资料与方法一研究对象回顾性分析 2013 年 1 月至 2016 年 6 月就诊于广州市妇女儿童医疗中心及其他三家华南地区医院 ( 广东省妇幼保健院中山博爱医院和东莞东华医院 ) 的住院和门诊患者 1. 纳入标准 :1 发病年龄为 0~89 d 的新生儿 ;2 侵袭性 GBS 感染即无菌体液或组织 ( 如血液脑脊液浆膜腔液骨髓和脏器等 ) 分离培养 GBS 阳性的病例 ;3 诊断为新生儿肺炎败血症及化脓性脑膜炎, 诊断标准参照实用新生儿学 ( 第 4 版 ) 若同一患者不同时间段或不同标本类型分离的 GBS 菌株的生物学特征和药敏试验结果一致, 则定义为同一株, 剔除重复菌株 2. 临床感染分型 : 根据发病时间, 分为早发型 (early-onset GBS disease,gbs-eod) 即生后 1 周内 (0~6 d) 发病, 以及晚发型 (late-onset GBS disease,gbs-lod) 即生后 7~89 d 发病 [1] 二方法 1. 一般资料收集 : 医院信息管理系统收集患儿的一般资料 ( 年龄性别出生体重胎龄和发病年龄等 ) 临床症状和体征实验室和影像检查结果等通过病案查询或电话问询随访 3 个月以上 2. 仪器和材料 :BACT/ALERT 3D 全自动细菌培养仪及配套培养瓶 (BioMerieux, 法国 ), VITEK-2 COMPACT 全自动细菌鉴定及药敏分析系统及配套 GP 鉴定卡和 GP67 药敏卡 (BioMerieux, 法

3 22 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 国 ),T100 PCR 仪 (Bio-Rad, 美国 ) 5% 哥伦比亚羊血琼脂平板 MH 平板购自广州市迪景公司 ; 药敏纸片购自 Oxiod 公司 PCR 试剂 DNA marker 和 DNA 提取试剂盒 (Takara, 日本 ) 购自大连宝生物有限公司, 引物由大连宝生物有限公司合成 3. 细菌的分离培养鉴定和药物敏感试验 : 患儿的无菌体液标本 ( 静脉血脑脊液和其他无菌体液 ) 接种于小儿中和抗菌药物培养瓶后放置血培养仪进行培养, 培养瓶报阳后, 及时转种至 5% 羊血琼脂平板,35 5% CO 2 培养 18~20 h, 通过细菌形态学观察细菌涂片镜检触酶试验和 CAMP 试验进行初筛, 使用 VITEK-2 COMPACT 全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定和药物敏感试验美国临床和实验室标准协会指南 2016 版 CLSI M100S26 作为药物敏感性试验判读标准质控菌株为肺炎链球菌 (ATCC49619), 所有质控在控所有操作严格按照全国临床检验操作规程 ( 第 4 版 ) 进行 4. 诱导型克林霉素耐药试验 (D- 抑菌圈试验 ): 选用纸片扩散法检测 GBS 分离株大环内酯类耐药表型, 按照 2016 版 CLSI M100-S26 指南对红霉素耐药和对克林霉素敏感或中介的 GBS 菌株进行 D- 抑菌圈试验, 若细菌对红霉素和克林霉素均耐药, 则为固有表型 (constitutive macrolide-lincosamide Streptogramin B,cMLS B ); 若对红霉素耐药, 靠近红霉素纸片处克林霉素抑菌圈减少或截平, 报告 D- 抑菌圈试验阳性, 则为诱导表型 (inducible MLS B,iMLS B ); 若对红霉素耐药而克林霉素敏感, 靠近红霉素处克林霉素抑菌圈无减少, 则为主动外排所致耐药, 即 M 型若克林霉素耐药, 红霉素敏感或中介为 L 型表型 5. 细菌 DNA 的提取 :GBS 菌株接种于含 5% 羊血琼脂平板, 置 35 5% CO 2 培养箱培养过夜, 约 18~24 h, 使用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA, 严格按试剂说明书进行操作 6. 耐药基因检测 :PCR 方法检测红霉素 (erma ermb 和 mefa) 和四环素耐药基因 (tetl tetk teto 和 tetm),pcr 引物序列详见表 1 PCR 反应体系共 50 μl: 模板 DNA 5 μl,ex Taq 酶 0.5 μl, 正反向引物各 10 pmol/l,dntp 4 μl, 缓冲液 5μl, 用 ddh 2 O 补至 50 μl PCR 反应条件 :94 预变性 5 min, 循环内 95 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 50 s, 共 33 个循环, 终末 72 延伸 10 min 取 10 μl PCR 扩增产物行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统检测到目的条带后,PCR 扩增产物送至华大基因公司完成测序测序结果与 PubMed Genbank 数据库序列进行 BLAST 比对分析三统计学处理采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析两组间的比较采用 Fisher 确切概率检验, 以 P <0.05 为差异具有统计学意义药物敏感试验数据使用世界卫生组织 (WHO) 推荐的 WHONET 5.6 软件进行分析结一研究对象的一般资料共纳入 93 例非重复新生儿 (< 90 d)gbs 侵袭性感染病例, 其中 64 例来自主办单位 ( 广州市妇女儿童医疗中心 ),29 例来自 3 家广东省内合作单位 ( 广东省妇幼保健院东莞东华医院和中山博爱医院 ) 其中 GBS-EOD 感染者 34 例 ( 占 36.6%); GBS-LOD 感染者 59 例 ( 占 63.4%), 以 LOD 较常见, 标本来源分布详见表 2 二入组患儿的临床特征 34 例 GBS 早发型感染患儿中 18 例 (53%) 发生败血症,16 例 (47%) 发生脑膜炎 ;24 例 (70.6%)GBS 早发型患儿于出生后 24 h 内发病,50% 患儿以发热为首发症状 59 例 GBS 晚发型感染患儿中 26 例 (44.1%) 发生败血症,33 例表 1 红霉素和克林霉素耐药基因引物序列及产物引物核酸序列 (5' 3') 产物长度 (bp) erma-f TCT AAA AAG CAT GTA AAA GAA 645 erma-r 果 CTT CGA TAG TTT ATT AAT ATT AGT ermb-f GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA 639 ermb-r AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC mefa-f CGTAGCATTGGAACAGC 316 mefa-r TGCCGTAGTACAGCCAT tetl-f TGAACGTCTCATTACCTG 993 tetl-r ACGAAAGCCCACCTAAAA teto-f AAC TT AGGCAT TC TGGC TCAC 515 teto-r TCCC AC TGT TCCA TAT CG TCA tetk-f TCCTGGAACCATGAGTGT 189 tetk-r AGATAATCCGCCCATAAC tetm-f TTATCAACGGTTTATCAGG 397 tetm-r CGTATATATGCAAGACG

4 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 23 (55.9%) 发生脑膜炎, 脑膜炎为晚发型 GBS 感染最常见的临床表现 37.5%(6/16) 早发型和 39.4% (13/33) 晚发型脑膜炎存活患儿存在不同程度的神经系统后遗症, 主要表现在视神经损害听神经传导通路受损颅内出血和脑积水运动神经发育迟缓等, 严重者有多部位脑梗塞和脑软化症存活患儿脑膜炎复发率高, 导致反复入院治疗三药物敏感试验 93 株 GBS 菌株对青霉素类 ( 如青霉素氨苄西林 ) 头孢菌素类( 头孢曲松 ) 万古霉素和利奈唑胺 100% 敏感对左氧氟沙星氧氟沙星和阿奇霉素的耐药率较低, 分别为 8.6% 2.2% 和 1.1% 对红霉素耐药率为 60.2%(56/93), 中介率为 18.3%(17/93), 不敏感率高达 78.5%, 敏感 20 株克林霉素耐药率高达 78.5%(73/93 株 ), 敏感 20 株 ; 其中 12 株为红霉素诱导克林霉素耐药四环素耐药率高达 93.5%(87/93 株 ), 敏感 6 株药敏试验结果详见表 3 4 家医院分离株对四环素耐药率均 > 90% 2013 年至 2016 年本院分离的 64 例侵袭性 GBS 菌株, 对红霉素和克林霉素的耐药率较高且呈逐年上升趋势 ( 图 1) 东莞东华医院红霉素和克林霉素的耐药率分别为 41.7% 和 75%, 广东省妇幼保健院分别为 11.1% 和 55.6%, 中山博爱医院分别为 37.5% 和 37.5% 四红霉素和克林霉素的耐药表型以及基因型 56 株红霉素耐药菌株 ermb 基因的携带率为 85.7%(48/56),3.6%(2/56) 耐药菌株同时携带 ermb 和 mefa 基因 ;14.3%(8/56) 红霉素耐药株未检测出耐药基因 17 株红霉素中介菌株 ermb 和 mefa 的携带率分别为 100%(17/17) 和 5.9% 表 2 93 例 GBS 感染的标本分布构成比 [ 例 (%)] 疾病类型血液脑脊液血液 + 脑脊液关节腔积液 GBS-EOD 28(30.1) 1(1.1) 5(5.4) 0(0.0) GBS-LOD 34(36.6) 16(17.2) 8(8.6) 1(1.1) 合计 62(66.7) 17(18.3) 13(14.0) 1(1.1) (1/17), 均未检出 erma 基因同时, 在 20 株红霉素敏感株中, 有 9 株 GBS 株检出 ermb 基因, 未检出 erma 和 mefa 基因经 Fisher 确切概率检验, 红霉素耐药基因检出率在红霉素不敏感菌株与敏感菌株中的检出率差异具有统计学意义 (P < 0.001) 耐药表型分析结果显示, 固有表型 (cmls B ) 为主, 占 53.9%(41/76), 其次是 L 表型占 26.3% (20/76) 诱导表型(iMLS B ) 占 15.8%(12/76) 和 M 表型占 3.9%(3/76) 红霉素耐药表型与基因型的关系详见表 4 PCR 扩增产物基因测序结果与 Genebank 数据库进行 Blast 同源性比对, 基因序列一致率为 99% 以上五四环素的耐药基因型 87 株四环素耐药菌株中, 四环素耐药基因 teto 和 tetm 携带率分别为 74.7%(65/87) 和 46% (40/87), 其中 25 株同时携带 teto 和 tetm, 均未检出 tetl 和 tetk 基因 7 株四环素耐药菌株未检出耐药基因,3 株四环素敏感株中也检出 teto 和 tetm 耐药基因, 未检出 tetl 和 tetk 基因经 Fisher 确切概率检验, 四环素耐药基因检出率在四环素耐药菌株与敏感菌株中的检出率差异具有统计学意义 (P = 0.015) 部分 PCR 扩增产物电泳结果见图 2, 部分表 3 93 株 GBS 对 11 种抗菌药物的耐药情况 [ 例 (%)] 耐药中介敏感抗菌药物株数耐药率株数中介率株数敏感率青霉素 G 氨苄西林头孢曲松万古霉素利奈唑胺四环素克林霉素红霉素左氧氟沙星氧氟沙星阿奇霉素表 4 红霉素和克林霉素耐药表型与基因型的相关性耐药表型菌株 [ 株 (%)] 耐药基因 ( 株 ) 耐药特征 cmls B 41(53.9) ermb(33) 红霉素和克林霉素同时耐药 ermb + mefa(2) imls B 12(15.8) ermb(11) 红霉素耐药克林霉素诱导耐药 M 表型 3(3.9) ermb(2) 红霉素耐药克林霉素敏感 L 表型 20(26.3) ermb(18) 克林霉素耐药红霉素敏感或中介 ermb + mefa(1) 合计 76 ermb(64) ermb + mefa(3)

5 24 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 基因序列结果见图 3 讨论尽管美国等西方国家从 1996 年开始逐渐采用产前筛查和产时抗菌药物预防性治疗 (IAP) 来预防新生儿 GBS 感染, 使 GBS-EOD 的发病率下降 80%, 然而对 GBS-LOD 效果不明显, 目前新生儿 GBS 感染的致病机理尚未完全阐明, 全球尚无完善的防治策略能够完全消除 GBS 感染,GBS 感染仍是全球新生儿主要致残及致死病原菌之一, 给患儿家庭和社会造成一定的经济和社会负担, 且近年来全球发病率有上升趋势, 特别是晚发型, 具体原因尚 [1, 3, 不明确 16] 本研究共收集 93 株新生儿 GBS 侵袭性感染病例, 其中 47% 为早发型和 55.9% 为晚发型发展为脑膜炎,38.8% 脑膜炎存活患儿存在不同程度的神经系统后遗症 GBS 不仅侵袭胎儿或新生儿的肺部, 同时会通过血流感染侵袭全身脏器和组织, 尤其 GBS 具有脑膜趋向性, 通过黏附转位等侵袭血脑屏障, 引发脑膜炎 [1] GBS 脑膜炎较非 GBS 脑膜炎患儿病情更重, 治疗周期和住院时间更长, 后遗症严重和病死率更高 GBS-EOD 多发生在出生前或出生时 ; 首要高危因素是孕产妇胃肠道和生殖道的 GBS 定植 ( 尤其是 GBS 高密度定植 ),GBS 菌尿症是高密度定植的重要标志 EOD 的传播方式主要是母婴垂直传播, 有 1%~2% 定植阳性孕妇分娩的新生儿发生侵袭性感染, 大多数患儿在出生 24 h 内出现临床症状 [1] EOD 以败血症和暴发性肺炎为主, 部分患儿出现脑膜炎 ; 首发临床表现为呼吸急促, 低氧发绀肺高压等呼吸道系统症状 GBS-LOD 多发生在出生时或出生后 LOD 高危因素是早产, 且出生越早危险系数越高 [1] LOD 传播方式主要是母婴垂直传播和出生后水平传播, 主要表现为化脓性脑膜炎 ; 高浓度的 GBS 菌血症是触发中枢神经系统炎症的先决条件研究报道高毒力高 120 耐药率 (%) 四环素红霉素克林霉素年份图至 2016 年侵袭性 B 族链球菌对四环素红霉素和克林霉素的耐药率变迁注 :A:ermB 基因,B:mefA 基因,C:tetM 基因,D:tetO 基因 ;A 图 1 ~ 8 泳道 B 图 1 ~ 7 泳道 C 图 1 ~ 8 泳道和 D1 ~ 6 泳道 :GBS 菌株, D 图第 6 孔 : 阴性对照 ;D 图第 7 孔 : 阳性对照图 2 红霉素和四环素耐药基因 PCR 产物电泳图

6 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No A 3B 3C 3D 注 :A:ermB 基因,B:mefA 基因,C:tetM 基因,D:tetO 基因图 3 红霉素和四环素耐药基因部分基因序列图侵袭力菌株 ( 如基因序列分型 ST-17) 和早产是新生儿 GBS 感染的独立高危因素本研究 GBS 感染临床分离株对青霉素类头孢菌素类万古霉素和利奈唑胺均敏感, 国外有关于 GBS 菌株对青霉素 β- 内酰胺类头孢菌素和头 [13, 孢噻肟敏感性降低的研究报道 17-19], 国内申阿东 [20] 等报道 1994 年至 1999 年北京地区 GBS 分离株对青霉素类的中介率高达 17%, 本研究期间尚未发现青霉素不敏感菌株 ; 左氧氟沙星氧氟沙星和阿奇霉素的耐药率较低, 与国内外报道一致本研究红霉素和克林霉素耐药率较高, 红霉素不敏感率为 78.5%( 耐药率为 60.2% + 中介耐药率为 18.3%), 克林霉素耐药率为 78.5% 国内外新生儿 GBS 感染红霉素耐药率报道 : 意大利为 12% [3], 法国为 16.7% [4], 西班牙为 8.3% [5], 日本为 35% [6], 韩国为 42.9% [7], 北京为 92.5% [8] 新生儿 GBS 感染克林霉素耐药率报道 : 西班牙为 4.1% [5], 日本为 15% [6], 北京为 87.5% [8] 国内外孕妇 GBS 定植红霉素和克林霉素耐药率报道 : 巴西为 4.1% 和 3.1% [9], 西班牙为 16.5% 和 10.1% [5], 美国为 50.7% 和 38.4% [10], 瑞士为 14.6% 和 14% [11], 加拿大为 36% 和 33% [12], 韩国为 25.6% 和 54% [13], 北京为 78.6% 和 64.3% [14] 综上报道, 我国新生儿感染和围产期妇女定植 GBS 分离株的红霉素和克林霉素耐药率较国外明显偏高, 广州地区较北京略低, 本院较其他三家参与医院耐药率略高本课题组现阶段在收集孕妇 GBS 耐药谱的数据以行进一步研究 GBS 对红霉素和克 [1, 林霉素的主要耐药表型和机制 15] :1MLSB 型 : erm 基因编码的甲基化酶导致的核糖体构型改变, 使 GBS 与大环内酯类抗菌药物结合受阻, 即大环内酯类 - 林可霉素类 - 链阳霉素 B 三类抗菌药物交叉耐药 MLSB 耐药表型又分为固有表型 (cmlsb) 和诱导表型 (imlsb) 2M 表型 :mefa 基因编码外排蛋白使细菌主动将大环内酯类药物泵出菌体外而产生耐药主要表现为红霉素耐药, 对林可霉素和链阳性菌素 B 敏感本研究 GBS 耐药表型以 [12, cmlsb 为主, 与国内外近年研究数据一致 15] 通过耐药基因检测,ermB 是介导广东地区红霉素耐药的主要机制, 几乎全部 cmlsb 全部 imlsb 和 M 型耐药表型均携带 ermb 基因,85.7% 红霉素耐药菌株携带 ermb 耐药基因耐药基因流行情况存在时空和地域差异, 近年国内新生儿侵袭和孕产妇定植 [8, GBS 菌株红霉素耐药均以 ermb 基因为主 15], 法国新生儿以 ermb 为主 [4], 日本新生儿以 erma 为主 [6], 韩国新生儿以 ermb 为主 [7] 8 株红霉素耐药株未检测出 erma ermb 和 mefa 基因, 提示可能存在其

7 26 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 他耐药机制本研究发现 95.9%(70/73 株 ) 红霉素不敏感株与克林霉素发生交叉耐药 (cmlsb 或 imlsb), 因此,GBS 红霉素不敏感株高度怀疑克林霉素耐药国内外新生儿感染和围产期妇女定植 / 感染的 GBS 分离株对四环素的耐药率均较高 : 本研究为 93.5%, 北京为 83.9% [14], 意大利为 93.3% [3], 法国为 90% [4], 加拿大为 89% [12], 巴西为 97% [9] 究其原因为四环素广泛应用于农业和畜牧业的抗感染治疗, 使 GBS 在内的许多细菌对四环素产生普遍耐药性, 耐药基因通过质粒转座子接合转座子和整合子在不同菌群间传播, 导致四环素高耐药率现状四环素耐药主要是获得耐药基因,tetK 和 tetl 编码外排蛋白, 介导四环素耐药 ;tetm 和 teto 编码核糖体保护蛋白, 使四环素无法与细菌核糖体结合而耐药 [15] 本研究四环素耐药主要由 teto 和 tetm 介 [15] 导, 携带率分别为 74.7% 和 46%, 与陈惠玲等报道一致然而, 欧美洲国家主要由 tetm 介导, 如意大利为 97.1% [3], 法国为 99% [4], 巴西为 99.3% [9] 另外, 本研究同时发现在少数红霉素和四环素敏感菌株检出耐药基因, 可能是敏感菌株通过质粒转座子等从 GBS 菌株或其他菌群获得耐药基因, 尚未表现出耐药表型, 具体机制有待进一步研究目前, 全球普遍使用美国 CDC 制订的预防围产期 GBS 感染指南, 该指南建议 35~37 周的孕妇均应行直肠和阴道的 GBS 筛查, 阳性者予以预防性治疗 ; 对有绒毛膜羊膜炎长期胎膜早破早产的高危孕妇均应接受 GBS 预防性治疗 [16] CDC 指南认为青霉素是预防新生儿 GBS 感染的首选药物, 青霉素过敏者除外 ; 青霉素低危过敏孕妇推荐使用头孢唑啉等一二代头孢类药物, 羊水内可达到较高的药物浓度, 而且青霉素和头孢菌素类抗菌药物的交叉过敏反应发生率较低, 约为 4%~6% [21] ; 青霉素高危过敏反应孕妇, 若红霉素和克林霉素均敏感可以使用克林霉素若孕妇对克林霉素耐药或药敏试验结果未知时, 万古霉素可用于青霉素高危过敏 [21] 尽管美国 CDC 推荐克林霉素作为青霉素高危过敏反应孕妇的预防手段, 但与国外相比, 我国 GBS 分离株对于红霉素和克林霉素处于高耐药率现状, 克林霉素作为我国 GBS 感染的预防和治疗手段需结合药敏试验, 应慎重考虑有研究数据表明, 当青霉素高危过敏反应孕妇的 GBS 定植菌对克林霉素耐药, 若使用克林霉素来预防围产期 GBS 感染会导致防治失败, 严重威胁着胎儿和新生儿的健康 [21] 本研究新生儿感染 GBS 株对青霉素和氨苄西林 100% 敏感, 青霉素和氨苄西林可作为治疗新生儿 GBS 感染首选药物, 青霉素过敏患儿除外氟喹诺酮类药物对新生儿关节软骨有损伤, 不常规用于孕妇和新生儿四环素影响儿童牙齿和骨骼发育, 肝肾毒性严重, 不应用于儿童尽管利奈唑胺 100% 敏感, 但其主要用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 耐万古霉素肠球菌和耐青霉素肺炎链球菌引起的危重症感染, 其胎盘穿透能力尚未明确, 因此不予推荐应用于 GBS 感染治疗 [21] 万古霉素有肾毒性和耳毒性, 新生儿要慎用由于头孢菌素类较青霉素类较易穿透血脑屏障, 对于脑膜炎患儿临床推荐使用头孢曲松进行治疗当怀疑脑膜炎时, 推荐使用头孢噻肟 ; 与万古霉素相比, 头孢噻肟在脑脊液的血药浓度较高, 且最小杀菌浓度较低与头孢唑林相比, 克林霉素红霉素和万古霉素到达胎儿循环和羊水中的杀菌水平非常有限 [3] 当临床怀疑新生儿败血症时, 临床医生应进行全面的临床评估, 包括外周血培养血常规 ( 白细胞计数中性粒细胞比例和血小板计数 ), 胸片 ( 有呼吸道感染症状和体征时 ), 必要时行腰椎穿刺当血培养结果尚未回报临床, 临床医生应及早开始 [1] 充分的经验抗感染治疗, 国外专家建议初始治疗方案为联合使用氨苄西林和氨基糖苷类 ( 庆大霉素 ), 覆盖引起新生儿败血症的常见致病菌, 如阳性球菌 ( 尤其是 GBS 和其他链球菌 ) 单核李斯特菌和阴性杆菌 ( 如肠杆菌 ) 若怀疑合并化脓性脑膜炎, 需联合穿透血脑屏障的药物, 如头孢噻肟等头孢菌素类当产妇诊断为绒 ( 毛 ) 膜羊膜炎, 尽管新生儿出生时无症状, 其患 EOD 的风险较高, 应进行血常规和血培养, 在等待血培养结果的同时, 也应尽早开始抗感染经验治疗若无症状新生儿的血培养结果报告为阴性, 此时仍不可掉以轻心, 有可能是抽血量偏少或在抗菌药物使用后抽血导致的血培养假阴性, 应严密观察病情的进展 [2] 若实验室回报致病菌和药敏试验结果, 临床医生根据患儿病情细菌特征药动学和药敏结果制定安全有效的治疗方案, 尤其极低体重儿, 使血液或脑脊液的药物浓度足以抑制细菌生长新生儿是一个特殊的群体, 应用于新生儿的抗菌药物的药理学 ( 包括吸收排泄和毒性 ) 是独特的, 不可以照搬成人的防治指南目前尚无统一的治疗新生儿

8 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 2018 年 2 月第 12 卷第 1 期 Chin J Exp Clin Infect Dis (Electronic Edition), February 2018, Vol.12, No.1 27 侵袭性感染的指南, 临床医生根据初期感染征兆开始抗感染经验治疗, 根据感染症状的持续时间决定抗感染疗程尽管多数 GBS 对氨基糖苷类耐药, 但 [1] 国外研究报道临床应用青霉素或氨苄西林联合庆大霉素疗效较好流行病学资料显示全球范围新生儿 GBS 侵袭性感染发病率呈逐年增高趋势,GBS 耐药菌株呈全球性分布, 且耐药率呈现不断增加的趋势在中国, 尚未制定统一的国家或地方 GBS 防治指南来预防和治疗新生儿 GBS 感染, 不同地区或同一地区不同医疗机构所实施 GBS 筛查和防治方案不完全相同, 许多大型三甲医院采用美国 CDC 的防治指南, 因此国内的 GBS 侵袭性感染新生儿的疾病负担 ( 包括 GBS 侵袭性感染引起的新生儿肺炎败血症脑膜炎死胎流产等 ) 仍不明确, 需要多中心大数据的资料来支持产时使用青霉素类或头孢类药物对高危因素的孕妇进行围产期预防性治疗, 是防止新生儿发生早发型 GBS 感染较有效的预防措施普遍筛查方案加 IAP 是目前最为有效的预防新生儿 GBS 感染的策略, 但仍有一定的局限性, 对于预防晚发型 GBS 感染仅能降低其严重程度, 并不能完全预防其发生综上, 鉴于不同地区或医院用药习惯不同, 及细菌耐药谱的不断变迁, 使 GBS 耐药谱存在时间和地域差异, 使耐药基因的分布和流行明显不同, 定期监测本地区 GBS 耐药谱和耐药基因监测, 了解耐药性变迁耐药流行株的发生发展及传播规律, 对临床医生制订治疗和预防新生儿 GBS 感染方案具有重要的指导价值, 对预防和控制耐药株的产生和传播至关重要, 也可用于评估当前 GBS 防治措施对降低围产期侵袭性 GBS 感染发病率和病死率的成效参考文献 [1] Wilson CB, Nizet V, Maldonado YA, et al. Remington and Klein s infectious diseases of the fetus and newborn infant[m]. Eighth Edition. Saunders, Philadelphia. 2006: [2] Cotten CM. Antibiotic stewardship: reassessment of guidelines for management of neonatal sepsis[j]. Clin Perinatol,2015,42(1): [3] Imperi M, Gherardi G, Berardi A, et al. Invasive neonatal GBS infections from an area-based surveillance study in Italy[J]. Clin Microbiol Infect,2011,17(12): [4] Joubrel C, Tazi A, Six A, et al. Group B Streptococcus neonatal invasive infections, France [J]. Clin Microbiol Infect,2015,21(10): [5] Liébana-Martos Mdel C, Cabrera-Alavargonzalez J, Rodríguez- Granger J, et al. Serotypes and antibiotic resistance patterns in betahemolytic Streptococcus agalactiae isolates in colonized mothers and newborns with invasive disease[j]. Enferm Infecc Microbiol Clin,2015,33(2): [6] Chang B, Wada A, Hosoya M, et al. Characteristics of group B Streptococcus isolated from infants with invasive infections: a population-based study in Japan[J]. Jpn J Infect Dis,2014,67(5): [7] Kang HM, Lee HJ, Lee H, et al. Genotype characterization of group B Streptococcus isolated from infants with invasive diseases in South Korea[J]. Pediatr Infect Dis J, 2017,36(10):e242-e247. [8] Wang P, Ma Z, Tong J, et al. Serotype distribution, antimicrobial resistance, and molecular characterization of invasive group B Streptococcus isolates recovered from Chinese neonates[j]. Int J Infect Dis Aug;37: [9] Dutra VG, Alves VM, Olendzki AN, et al. Streptococcus agalactiae in Brazil: serotype distribution, virulence determinants and antimicrobial susceptibility[j]. BMC Infect Dis,2014,14:323. [10] Back EE, O Grady EJ, Back JD. High rates of perinatal group B streptococcus clindamycin and erythromycin resistance in an upstate New York hospital[j]. Antimicrob Agents Chemother,2012,56(2): [11] Fröhlicher S, Reichen-Fahrni G, Müller M, et al. Serotype distribution and antimicrobial susceptibility of group B streptococci in pregnant women: results from a Swiss tertiary centre[j]. Swiss Med Wkly,2014,144:w [12] Teatero S, Ferrieri P, Martin I, et al. Serotype distribution, population structure, and antimicrobial resistance of group B streptococcus strains recovered from colonized pregnant women[j]. J Clin Microbiol,2017,55(2): [13] Nagano N, Nagano Y, Toyama M, et al. Nosocomial spread of multidrug-resistant group B streptococci with reduced penicillin susceptibility belonging to clonal complex 1[J]. J Antimicrob Chemother,2012,67(4): [14] Wang P, Tong JJ, Ma XH, et al. Serotypes, antibiotic susceptibilities, and multi-locus sequence type profiles of Streptococcus agalactiae isolates circulating in Beijing, China[J]. PLoS One,2015,10(3):e [15] 陈惠玲, 邓家德, 叶惠芬, 等. 侵入性感染 B 族链球菌对红霉素及四环素的耐药基因检测 [J]. 中华医院感染学杂志,2010,20(10): [16] Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease-revised guidelines from CDC[J]. MMWR Recomm Rep,2010,59(RR-10):1-36. [17] Chu YW, Tse C, Tsang GK, et al. Invasive group B streptococcus isolates showing reduced susceptibility to penicillin in Hong Kong[J]. J Antimicrob Chemother,2007,60(6): [18] Morikawa Y, Kitazato M, Katsukawa C, et al. Prevalence of cefotaxime resistance in group B streptococcus isolates from Osaka, Japan[J]. J Infect Chemother,2003,9(2): [19] Dahesh S, Hensler ME, Van Sorge NM, et al. Point mutation in the group B streptococcal pbp2x gene conferring decreased susceptibility to beta-lactam antibiotics[j]. Antimicrob Agents Chemother, 2008,52(8): [20] 申阿东, 张桂荣, 王咏红, 等. B 组链球菌的耐药性及红霉素耐药基因检测研究 [J]. 中华儿科杂志,2005,43(9): [21] Blaschke AJ, Pulver LS, Korgenski EK, et al. Clindamycin-resistant group B streptococcus and failure of intrapartum prophylaxis to prevent early-onset disease[j]. J Pediatr,2010,156(3): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 孙荣华 ) 李娟, 高坎坎, 容莉莉, 等. 新生儿侵袭性感染 B 族链球菌的耐药表型及耐药机制 [J/CD]. 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ), 2018,12(1):20-27.

政院衛生署疾病管制局九十一年度自行研究計畫

政院衛生署疾病管制局九十一年度自行研究計畫 subih@cdc.gov.tw 1 (1) 3 (2) 4 (3) 6 (4) 7 (5) 7 (6) 11 (7) 11 14 26 35 ( 37 ) 2 10 姙姙姙踪姙姙踪 3 4 5 踪 6 AmpicillinPenicillin, 10 姙姙姙姙踪姙姙姙姙姙 7 姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙 8 姙姙姙姙姙