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1 820 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No. 9 文章编号 : (2016) 中图分类号 :R446.5 文献标志码 :A DOI : /j.issn G 群链球菌的分子鉴定及耐药特征分析何丽华 1, 倪丽君 1, 刘红 2, 王蓓 2, 田月如 2, 郭建 1 1, 吴文娟 (1. 同济大学附属东方医院南院医学检验科, 上海 ; 2. 复旦大学附属华山医院检验科, 上海 ) 摘要 : 目的探讨 16S rdna 测序法鉴定 β- 溶血性 G 群链球菌的价值, 通过体外药物敏感性试验确定 G 群链球菌对青霉素红霉素和克林霉素等抗菌药物的耐药性, 并确定红霉素耐药菌株的耐药表型及基因型方法采用 API 20 Strep 链球菌鉴定系统兰氏抗原血清分型和 16S rdna 测序法对复旦大学附属华山医院临床分离的 50 株 β- 溶血性 G 群链球菌进行鉴定采用琼脂稀释法对该 50 株 G 群链球菌进行体外药物敏感性试验, 并通过纸片法 D 试验测定红霉素耐药菌株的耐药表型通过聚合酶链反应 (PCR) 检测其大环内酯类耐药基因 ermb 和 mefa 结果 50 株链球菌经手工 API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定, 均为停乳链球菌 16S rdna PCR 扩增及测序,42 株为停乳链球菌,8 株为咽峡炎链球菌, 鉴定概率 >97% 以测序结果为标准,API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定的准确率为 84% 兰氏抗原血清分型均为 G 群药物敏感性试验结果显示,50 株 G 群链球菌中没有对左氧氟沙星头孢曲松万古霉素和青霉素耐药的菌株红霉素耐药菌株共 28 株 (56%), 其中 cmls 型耐药菌株 26 株 (52%),Ms 型耐药菌株 2 株 (4%), 没有发现 imls 型耐药菌株, 红霉素中介菌株 4 株 (8%) 克林霉素耐药菌株共 31 株 (62%), 其中红霉素敏感而克林霉素耐药菌株 3 株 (6%), 红霉素中介而克林霉素耐药菌株 2 株 (4%) cmls 型耐药菌株中均检测到 ermb 基因,2 株 Ms 型耐药由 mefa 基因介导,4 株红霉素中介菌株中检出 ermb 和 mefa 基因各 1 株结论 16S rdna 测序法能准确鉴定 G 群链球菌 G 群链球菌对红霉素和克林霉素的耐药率有所提高, 但对青霉素敏感,β- 内酰胺类药物可以作为治疗 G 群链球菌感染的首选药物关键词 :G 群链球菌 ; 药物敏感性试验 ;16S rdna;ermb;mefa Identification of Streptococcus G and its drug resistance HE Lihua 1,NI Lijun 1,LIU Hong 2,WANG Bei 2, TIAN Yueru 2,GUO Jian 1,WU Wenjuan 1. (1. Department of Laboratory Medicine,Shanghai East Hospital South Campus,Tongji University,Shanghai ,China;2. Department of Clinical Laboratory,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai ,China) Abstract:Objective To investigate the significance of 16S rdna sequencing method in identifying betahemolytic Streptococcus G and determine the drug resistance of beta-hemolytic Streptococcus G to antibiotics, like penicillin,erythromycin and clindamycin,by in vitro drug susceptibility test,in order to determine the drug resistance phenotypes and genotypes of erythromycin-resistant isolates. Methods A total of 50 beta-hemolytic Streptococcus G isolates were collected from Fudan University Huashan Hospital,and they were identified by API 20 Strep Streptococcus identification system,lancefield's streptococcal grouping test and 16S rdna sequencing method. The in vitro drug susceptibility test was performed by agar dilution method. Erythromycin-resistant phenotypes were determined by D test. The drug resistance genes,ermb and mefa,were determined by polymerase chain reaction (PCR). Results The 50 beta-hemolytic Streptococcus G isolates were identified by API 20 Strep Streptococcus identification system as Streptococcus dysgalactiae. For 16S rdna sequencing method,there were 42 isolates of Streptococcus dysgalactiae and 8 isolates of Streptococcus anginosus,and the identification rate was >97%. 16S 基金项目 : 上海市浦东新区卫生系统学科带头人培养计划项目 (PWRd ); 浦东新区卫生系统重点专科建设项目 (PWZz ) 作者简介 : 何丽华, 女,1978 年生, 硕士, 主管技师, 主要从事细菌耐药性及耐药机制研究通讯作者 : 吴文娟, 联系电话 :

2 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No rdna sequencing method was used as standard,and the identification accuracy of API 20 Strep Streptococcus identification system was 84%. The results of Lancefield's streptococcal grouping test were all group G. The results of drug susceptibility test showed that there was no levofloxacin-,ceftriaxone-,vancomycin- and penicillinresistant isolates. Erythromycin resistance was found in 28 isolates(56%),among them,there were 26 isolates (52%) with cmls,2 isolates(4%) with Ms and no isolate with imls. Furthermore,4 isolates (8%) were intermediately resistant to erythromycin. A total of 31 isolates(62%) were clindamycin-resistant,among them,3 isolates(6%) were sensitive to erythromycin and resistant to clindamycin,and 2 isolates(4%) were intermediately resistant to erythromycin and resistant to clindamycin. All cmls-resistant isolates carried ermb,and 2 Ms-resistant isolates carried mefa. There were 2 isolates of 4 isolates with intermediate resistance to erythromycin carried ermb and mefa,respectively. Conclusions 16S rdna sequencing method could identify Streptococcus G. The drug resistance rates to erythromycin and clindamycin increase. However,all the isolates are sensitive to penicillin. The beta-lactam antibiotic may be the first choice for the treatment of Streptococcus G infection. Key words:streptococcus G;Drug susceptibility test;16s rdna;ermb;mefa β- 溶血性 G 群链球菌为人体呼吸道胃肠道和泌尿生殖道的共生菌, 通常可引起糖尿病心血管疾病癌症等基础性疾病患者的继发感染 [1] 近年资料显示,G 群链球菌的感染率呈上升趋势, 可以通过消化道呼吸道等途径引起咽炎软组织坏死急性肾小球肾炎等多种疾病 [2], 并累及各年龄层人群, 值得关注近年来, 有关 β- 溶血大菌落的 G 群链球菌感染的报道越来越多 [3], 停乳链球菌是 G 群链球菌中与临床关系最为密切的一种链球菌 [4], 所以其准确鉴定及准确的药物敏感性试验对临床诊治有重要意义本研究旨在探讨 16S rdna 测序法鉴定 β- 溶血性 G 群链球菌的价值, 并通过体外药物敏感性试验和耐药基因检测分析其耐药状况, 为临床治疗链球菌感染提供依据材料和方法一菌株来源选择复旦大学附属华山医院菌毒种库保存的 50 株 β- 溶血性 G 群链球菌, 分离自 2008 至 2011 年疑似感染性疾病患者的血液 (5 株 ) 痰液 (21 株 ) 伤口分泌物(9 株 ) 脓液(4 株 ) 中段尿(3 株 ) 皮肤组织(2 株 ) 排泄物 (2 株 ) 和其他分泌物临床样本 (4 株 ) 二手工生化鉴定和血清分型所有菌株从 -70 冰箱取出后转种于血琼脂平板 ( 浙江拱东医疗科技有限公司 ), 分离纯化传代后, 采用 API 20 Strep 链球菌鉴定系统进行鉴定 ( 法国生物梅里埃公司 ), 按编码判读结果群抗原血清分型用 Oxoid 兰氏分群试剂盒 (Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham,MA, 美国,DR0585) 三聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,pcr) 扩增采用细菌 D N A 提取试剂盒 [ 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ] 提取 D N A, 扩增 1 6 S R N A 引物序列 L P W 为 5 ' - GAGTTGCGAACGGGTGAG-3',LPW205 为 5'- CTTGTTACGACTTCACCC-3' 反应条件为: 94 1 min,55 1 min,72 2 min,35 个循环,72 延伸 10 min, 扩增片段约 bp 四体外药物敏感性试验采用琼脂稀释法测定 G 群链球菌的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,mic), 将不同剂量的抗菌药物加入融化并冷却至 50 左右的定量水解酪蛋白胨 (Mueller-Hinton, MH) 琼脂中, 配制成不同浓度的血 MH 平板 ( 青霉素浓度为和 1 μg/ml, 红霉素浓度为和 1 μg/ml, 克林霉素浓度为和 1 μg/ml, 万古霉素浓度为和 8 μg/ml, 左氧氟沙星浓度为和 8 μg/ml, 头孢曲松浓度为和 1 μg/ml), 将 2 μl 0.5 麦氏单位的 G 群链球菌悬液接种于琼脂平板表面, 形成直径为 5~8 mm 的菌斑,35 孵育 18~24 h 后观察结果质控菌株为金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923, 上海市临床检验中心 )

822 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No. 9 五 D 试验按照美国临床实验室标准化协会 ( t h e Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 2014 年标准 [5], 将 0.

3 822 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No. 9 五 D 试验按照美国临床实验室标准化协会 ( t h e Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 2014 年标准 [5], 将 0.5 麦氏单位 G 群链球菌的新鲜悬液均匀涂布于血 MH 平板上, 分别在相距 15 和 12 mm 处 ( 边缘到边缘 ) 贴上红霉素和克林霉素药物敏感性纸片,35 孵育 18~24 h 后观察结果在对红霉素耐药而克林霉素敏感的菌株中若靠近红霉素纸片一侧的克林霉素抑菌圈变钝, 形似大写字母 D, 则为 D 试验阳性, 称为 imls 型耐药 ; 若克林霉素抑菌圈正常, 仍为圆型, 则为 D 试验阴性, 称为 Ms 型耐药 ; 若红霉素和克林霉素均耐药, 则为 cmls 型耐药质控菌株为金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923, 上海市临床检验中心 ) 六耐药基因的检测采用 PCR 检测 G 群链球菌的耐药基因 ermb 和 mefa 引物序列为:ermB,5'-GAAAAGGTAC- TCAACCAAATA-3' 和 5'-AGTAACGGTACTTAA- ATTGTTTAC-3'(639 bp);mefa,5'-agtatc- ATTAATCACTAGTGC-3' 和 5'-TTCTTCTGG- TACTAAAAGTGG-3'(348 bp) 反应条件为: 93 变性 3 min, 然后 93 1 min,52 1 min, 72 1 min,35 个循环,72 延伸 5 min 七统计学方法采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析, 检出率的比较采用 χ 2 检验, 以 P<0.05 为差异具有统计学意义结果一生化鉴定经 API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定,50 株链球菌的生化鉴定结果一致, 触酶试验阴性, 分解海藻糖, 不分解山梨醇,β- 葡萄糖醛酸苷酶阳性, 吡咯烷酮芳基酰胺酶 V P (VogesProskauer) 试验环磷酸腺苷和马尿酸钠试验均为阴性鉴定结果均为停乳链球菌兰氏抗原血清分型均为 G 群二 16S rdna PCR 扩增及测序 50 株菌株的 16S rdna 经 PCR 扩增, 均获得 bp 左右的目的片段, 见图 1 测序结果经 GeneBank 比对分析,42 株为停乳链球菌,8 株为咽峡炎链球菌, 鉴定率 >97% 以测序结果为标准,API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定的准确率为 84% M 注 :M 为 Marker;1~17 为链球菌 16S rdna PCR 产物图 1 G 群链球菌 16S rdna PCR 扩增片段三药物敏感性试验及 D 试验菌株被分为敏感中介和耐药 3 种, 根据 [5] 2014 年 CLSI M100-S24 折点标准进行判读, 见表 1 50 株 G 群链球菌中没有发现对左氧氟沙星头孢曲松万古霉素和青霉素耐药的菌株红霉素耐药菌株共 28 株 (56%), 红霉素中介菌株 4 株 (8%) 克林霉素耐药菌株共 31 株 (62%), 红霉素敏感而克林霉素耐药菌株 3 株 (6%), 红霉素中介而克林霉素耐药菌株 2 株 (4%) D 试验结果显示, 红霉素耐药菌株中 cmls 型耐药 26 株 (52%),Ms 型耐药 2 株 (4%), 没有发现 imls 型耐药表 1 链球菌 β- 溶血群的抑菌圈直径及 MIC 解释标准抗菌药物 MIC 解释标准 (μg/ml) 敏感中介耐药红霉素克林霉素青霉素万古霉素左氧氟沙星头孢曲松四耐药基因检测共检出携带 ermb 基因菌株 27 株, 携带 mefa 基因菌株 3 株红霉素耐药的 28 株 (56%) 菌株中检测到携带 ermb 基因菌株 26 株, 均为 cmls 型耐药 ; 携带 mefa 基因菌株 2 株, 为 Ms 型耐药 4 株红霉素中介菌株中检出携带 ermb 和 mefa 基因菌株各 1 株克林霉素耐药的 31 株 (62%) 菌株中检测到携带 ermb 基因菌株 27 株, 携带 mefa 基

4 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No 因菌株 2 株, 还有 2 株未检出基因 ermb 和 mefa 基因在红霉素和克林霉素耐药菌株中的检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 讨论链球菌种的鉴定可以帮助临床评估细菌的毒力和侵袭力 [6-7], 预防严重感染的发生采用传统方法链球菌通常只能鉴定到属, 较难准确鉴定到种的水平 [6] 目前链球菌的鉴定主要有 Rapid ID 32 Strep API 20 Strep 和 Vitek 2 systems 这几种系统, 但对链球菌鉴定的准确率均不高, 分别为 81.5% 66.7% 和 37% [8] 本研究通过 API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定 50 株菌株均为停乳链球菌, 经过 16S rdna PCR 扩增和测序, 结果只有 42 株为停乳链球菌, 其余 8 株为咽峡炎链球菌, 以测序结果为标准,API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定的准确率为 84%, 与参考文献 [8] 不同, 可能与所检测的链球菌菌群不同有关采用 16S rdna 测序进行分型的优点为核苷酸序列数据的解释比表型结果更为直观, 通过 DNA 双链的测序能给出准确的核苷酸信息, 特别适合于条件要求较高生长缓慢的苛养菌本研究对从临床各种样本中分离并经过 API 20 Strep 链球菌鉴定系统鉴定的 50 株 G 群链球菌进行 PCR 扩增 16S rdna 和序列比对分析, 鉴定率均 >97%, 显示了分子鉴定在链球菌菌种鉴定方面的优势 β- 内酰胺类大环内脂类林可酰胺类和链阳菌素 B 类抗菌药物被临床广泛用于治疗 G 群链球菌的感染在既往大多数国外研究中 G 群链球菌对青霉素敏感, 对红霉素和克林霉素具有一定的耐药性 [9-11] 但国内对 G 群链球菌的研究很少, 相关数据不足目前认为 G 群链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药的机制主要有 3 种 :(1) 抗菌药物作用靶位改变, 即产生由 erm 基因编码的 RNA 甲基化酶, 这种酶能对细菌核糖体 50S 亚基 23S rrna 进行特定核苷酸残基甲基化, 从而导致菌株对大环内酯类林可酰胺类链阳菌素 B 耐药 (2)mefA 基因编码外排蛋白, 使细菌仅对环大环内酯类和链阳菌素 B 耐药, 但对林可酰胺类药物敏感 [12] (3)23S rrna 及核糖体蛋白 L4 和 L22 的突变, 核糖体突变引起的耐药与前面提到的此位点甲基化修饰的耐药表型相似其他一些耐药机制意义不大, 如抗菌药物的酶的灭活 [13] MLs 型耐药可分为 imls 和 cmls,imls 型耐药是指以红霉素作为诱导剂通过衰减机制诱导 erm 基因表达而产生的耐药, 其表型为对红霉素耐药而克林霉素敏感 ;cmls 型耐药是指因 erm 基因上游的启动子发生突变而使 erm 基因持续稳定表达而产生的耐药, 其表型为对红霉素和克林霉素均耐药本研究中对红霉素耐药的菌株有 2 8 株 (56%), 其中 26 株含有 ermb 基因,2 株含有 mefa 基因 26 株 cmls 型耐药菌株均检测到 ermb 基因,2 株 Ms 型耐药菌株检测到 mefa 基因 ;4 株红霉素中介的菌株中检测出携带 ermb 和 mefa 基因菌株各 1 株, 可能还存在其他的耐药机制, 需进一步探讨对克林霉素耐药的菌株有 31 株 (62%), 其中 27 株检测到 ermb 基因,2 株检测到 mefa 基因, 同时含有 ermb 和 mefa 基因的有 2 株红霉素和克林霉素均敏感的菌株中未发现耐药基因 ermb 和 mefa 基因在红霉素和克林霉素耐药菌株中的检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 本研究发现我国红霉素耐药率比其他国家的报道高出许多, 如 2007 至 2011 年台湾报道的耐药率只有 18.5% [8],1995 至 2002 年土耳其为 6.7% [14], 这可能与在不同时期不同地理位置 G 群链球菌的耐药性有所不同有关, 各国各地区的流行病学资料不能相互替代加强我国对耐药菌株的监测, 了解其耐药性变迁, 可为临床医生提供治疗和预防感染的合理方案, 这具有非常重要的临床应用价值本研究对红霉素耐药的 28 株 G 群链球菌中有 26 株为 cmls 型耐药,2 株为 Ms 型耐药, 没有发现 imls 型耐药, 这与阿根廷的报道相似 [15], 耐药表型的鉴定对选择合适抗菌药物治疗感染很重要采用 MIC 评估细菌对抗菌药物的敏感性是很有必要的, 同时也为选择合适的抗菌药物治疗致病菌提供了依据, 还可以观察一定时期内某种致病菌对抗菌药物的耐药趋势本研究中青霉素对 G 群链球菌的 MIC 是 mg/ml, 和 [15] 同类文献比较无增高目前,G 群链球菌对红霉素和克林霉素的耐药率有所提高, 但对青霉素均敏感, 这意味着 β-

5 824 检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine,September 2016,Vol. 31,No. 9 内酰胺类药物是临床治疗 G 群链球菌感染的首选药物 G 群链球菌对抗菌药物的耐药监测很有必要, 我们必须密切关注本研究还存在一定的局限性 : 其一, 临床样本量较少其二, 本研究只测试了 2 个耐药基因, 还有许多其他耐药基因尚待测定其三, 本研究没有统计假阴性, 如果计算假阴性, 可以客观显示研究结果的准确性本研究的上述缺陷将在未来的研究中予以改进参考文献 [1] RANTALA S. Streptococcus dysgalactiae subsp. [2] [3] [4] [5] [6] [7] equisimilis bacteremia:an emerging infection[j]. Eur J ClinMicrobiol Infect Dis,2014,33(8): WHILEY RA, FRASER H, HARDIE JM, et al. Phenotypic differentiation of Streptococcus intermedius, Streptococcus consellatus, and Streptococcus anginosus strains within the Streptococcus milleri group [J]. J Clin Mircobiol,1990,28(7): GHERARDI G,IMPERI M,PALMIERI C, et al. Genetic diversity and virulence properties of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis from different sources[j]. J Med Microbiol,2014,63(Pt 1): TAKAHASHI T,SUNAOSHI K,SUNAKAWA K,et al. Clinical aspects of invasive infections with Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis in Japan: differences with respect to Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae infections[j]. Clin Microbiol Infect,2010,16(8): Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[s]. M100-S24,CLSI,2014. LIU LC,TSAI JC,HSUEH PR,et al. Rapid differentiation between members of the anginosus group and Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis within beta-hemolytic group C and G streptococci by PCR[J]. J Clin Microbiol,2006,44 (5): LO HH,CHENG WS. Distribution of virulence factors and association with emm polymorphism or isolation site among beta-hemolytic group G Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis[j]. APMIS,2015,123(1): [8] CHANG YC,LO HH. Identification,clinical aspects,susceptibility pattern,and molecular epidemiology of beta-haemolytic group G Streptococcus anginosus group isolates from central Taiwan[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2013,76 (3): [9] ERSKINE RJ,WALKER RD,BOLIN CA, et al. Trends in antibacterial susceptibility of mastitis pathogens during a seven-year period[j]. J Dairy Sci,2002,85(5): [10] GUERIN-FAUBLEE V,TARDY F,BOUVERON C,et al. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus species isolated from clinical mastitis in dairy cows[j]. Int J Antimicrob Agents,2002,19(3): [11] ROSSITTO PV,RUIZ L,KIKUCHI Y,et al. Antibiotic susceptibility patterns for environmental streptococci isolated from bovine mastitis in central California dairies[j]. J Dairy Sci,2002,85(1): [12] LECLERCQ R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications[j]. Clin Infect Dis,2002,34(4): [13] DEPARDIEU F,COURVALIN P. Mutation in 23S rrna responsible for resistance to 16-membered macrolides and streptogramins in Streptococcus pneumoniae[j]. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45(1): [14] ERGIN A,ERCIS S,HASC, ELIK G. In vitro susceptibility,tolerance and MLS resistance phenotypes of Group C and Group G streptococci isolated in Turkey between 1995 and 2002[J]. Int J Antimicrob Agents,2003,22(2): [15] DENAMIEL G,LLORENTE P,CARABELLA M,et al. Anti-microbial susceptibility of Streptococcus spp. isolated from bovine mastitis in Argentina[J]. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,2005,52(3): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

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政院衛生署疾病管制局九十一年度自行研究計畫 subih@cdc.gov.tw 1 (1) 3 (2) 4 (3) 6 (4) 7 (5) 7 (6) 11 (7) 11 14 26 35 ( 37 ) 2 10 姙姙姙踪姙姙踪 3 4 5 踪 6 AmpicillinPenicillin, 10 姙姙姙姙踪姙姙姙姙姙 7 姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙姙 8 姙姙姙姙姙