1062 检验医学 2016 年 12 月第 31 卷第 12 期 Laboratory Medicine,December 2016,Vol. 31,No. 12 children in Jiading,Shanghai. The cross resistance with clindamycin

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1 1061 文章编号 : (2016) 中图分类号 :R 文献标志码 :A DOI : /j.issn 上海市嘉定地区感染患儿分离的化脓链球菌分子流行病学分析 乔丹 1, 陈明亮 2, 朱咏臻 1, 樊绮诗 1 1, 周敏 (1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科, 上海 ; 2. 上海市疾病预防控制中心, 上海 ) 摘要 : 目的了解上海市嘉定地区感染患儿分离的化脓链球菌 emm 分型及其耐药特点, 为临床治疗和感染控制提供相关信息 方法收集 2014 年 11 月至 2015 年 7 月在上海交通大学医学院附属瑞金医院北院门诊就诊的 急性咽炎等患儿或咽拭子样本分离的化脓链球菌 75 株 应用 API 20 Strep 链球菌鉴定板条进行菌株鉴定, 并用纸片扩散法检测菌株对 8 种常用抗菌药物的敏感性 应用聚合酶链反应 (PCR) 扩增编码 M 蛋白的 emm 基因, 对 PCR 扩增后的 emm 基因产物进行测序, 通过比对, 获得菌株的 emm 分型结果 采用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析不同 emm 基因型菌株的特征, 并将 75 株化脓链球菌结果导入 BioNumerics 软件进行聚类分析 结果上海市嘉定地区化脓链球菌对红霉素 克林霉素的耐药率分别为 94.7% 和 97.3%, 对红霉素和克林霉素的双重耐药率为 93.3% 具有相同 emm 基因型的菌株在 PFGE 带型上高度聚集, 其中存在占优势的 PFGE 型 在临床分离的 75 株化脓链球菌中,emm1 基因型菌株 25 株 (33.3%, 25/75),emm12 基因型菌株 49 株 (65.3%,49/75),emm22 基因型菌株仅 1 株 (1.3%,1/75) 结论目前上海市嘉定地区儿童咽拭子样本分离得到的化脓链球菌对红霉素普遍耐药, 且与克林霉素存在较严重的交叉耐药现象 emm12 或 emm1 基因型菌株是上海市嘉定地区儿童主要感染的化脓链球菌类型 关键词 : 化脓链球菌 ; 红霉素 ;emm 基因分型 ; 细菌 ; 耐药性 Molecular epidemiological analysis of Streptococcus pyogenes isolated from children in Jiading, Shanghai QIAO Dan 1,CHEN Mingliang 2,ZHU Yongzhen 1,FAN Qishi 1,ZHOU Min 1. [1. Department of Clinical Laboratory,Ruijin Hospital(North),Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai , China;2. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai ,China] Abstract:Objective To study the emm genotype in Streptococcus pyogenes isolated from children in Jiading, Shanghai and its drug resistance,and to provide a reference for infection control and treatment. Methods Outpatient children diagnosed with acute respiratory infection,acute tonsillitis and acute pharyngitis or carriers in Ruijin Hospital (North) from November 2014 to July 2015 were enrolled,and 75 isolates of Streptococcus pyogenes were collected by pharyngeal swab culture. The isolates of Streptococcus pyogenes were identified by API 20 Strep. Antimicrobial susceptibility test was done by Kirby-Bauer method for 8 kinds of commonly-used antibiotics. The emm gene encoding M protein was amplified by polymerase chain reaction(pcr),and the gene product of PCR was sequenced. Through comparison,the emm genotypes were obtained. The characteristics of different emm genotypes were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis(pfge). BioNumerics software was used to analyze PFGE results from 75 isolates of Streptococcus pyogenes for cluster analysis. Results The erythromycin and clindamycin resistance rates of Streptococcus pyogenes in Jiading,Shanghai were 94.7% and 97.3%,respectively. The double resistance rate to erythromycin and clindamycin was 93.3%. The isolates with the same emm genotype in PFGE band were in high cluster. There were major PFGE genotypes. Among 75 isolates of Streptococcus pyogenes,25 isolates(33.3%,25/75) contained emm1 genotype,49 isolates(65.3%,49/75) contained emm12 genotype,and only 1 isolate(1.3%,1/75) contained emm22 genotype. Conclusions There is a high erythromycin resistance rate of Streptococcus pyogenes isolated from 作者简介 : 乔丹, 女,1984 年生, 博士, 技师, 主要从事病原微生物诊断和耐药研究 通讯作者 : 周敏, 联系电话 :

2 1062 检验医学 2016 年 12 月第 31 卷第 12 期 Laboratory Medicine,December 2016,Vol. 31,No. 12 children in Jiading,Shanghai. The cross resistance with clindamycin is high. Streptococcus pyogenes containing emm12 or emm1 genotype is the main epidemic pathogen among children in Jiading,Shanghai. Key words:streptococcus pyogenes;erythromycin;emm genotypes;bacteria;drug resistance 化脓链球菌是一种常见的致病性 化脓性革兰阳性球菌, 经常侵犯上呼吸道黏膜上皮等浅表部位, 主要引起儿童咽炎 扁桃体炎及猩红热等疾病, 在儿童细菌性咽炎中最常见 化脓在少数情况下可导致坏死性筋膜炎 链球菌中毒性休克综合征等危及生命的疾病 迟发性化脓后可引起非化脓性疾病, 如后肾小球肾炎 深入研究化脓链球菌的流行病学特点, 将有助于进一步认识和预防化脓链球菌引起的化脓性感染 化脓链球菌传统血清分型包括 OF 分型 T 分型 M 分型, 其中 M 分型是化脓链球菌的终极分型 由 emm 基因编码的 M 蛋白和超抗原是化脓链球菌最重要的毒力因子 emm 基因测序分型是 M 蛋白分型的标准方法 [1] 为了探讨上海市嘉定地区引起儿童急性咽炎等疾病的化脓链球菌的药物敏感性及其流行病学特征, 本研究对上海交通大学医学院附属瑞金医院北院儿童咽拭子样本分离的化脓链球菌的药物敏感性进行了分析, 同时对菌株进行了 emm 基因分型 材料和方法一 研究对象收集 2014 年 11 月至 2015 年 7 月在上海交通大学医学院附属瑞金医院北院儿科门诊就诊患儿咽拭子样本分离出的化脓链球菌 75 株, 主要取自 急性咽炎 等患儿或 二 试剂及仪器所有药物敏感性纸片均为英国 Oxoid 公司产品, 哥伦比亚血琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品,API 20 Strep 链球菌鉴定板条为法国生物梅里埃公司产品 CHEF MAPPER System 脉冲场凝胶电泳系统为美国 Bio-Rad 公司产品 基因组 DNA 抽提试剂盒为天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司产品 三 菌株分离鉴定及基因组 DNA 抽提将咽拭子样本接种于哥伦比亚血琼脂平板 中, 在 35 5%CO 2 条件下培养 24 h, 可疑菌落纯分离后 35 培养过夜, 使用 API 20 Strep 链球菌鉴定板条进行菌种鉴定 将化脓链球菌 35 培养过夜, 用接种环挑取 1 环菌落, 转入装有 500 μl 生理盐水的 Eppendorf 管内, g 离心 5 min, 收集细菌沉淀, 使用细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取基因组 DNA, 最终洗脱获得 50 μl DNA 溶液,4 保存备用 四 药物敏感性试验采用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验 在哥伦比亚血琼脂平板上测定青霉素 氨苄西林 头孢曲松 万古霉素 红霉素 克林霉素 左氧氟沙星和利奈唑胺的抑菌圈直径 金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923) 大肠埃希菌(ATCC 25922) 铜绿假单胞菌(ATCC 27853) 作为药物敏感性试验的质控菌株, 药物敏感性试验结果参照 2015 年美国临床实验室标准化协会 (the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 的 M100-S24 标准进行判定 在诱导克林霉素耐药试验中, 如果靠近红霉素纸片一侧的克林霉素的抑菌圈出现 截平 现象, 整个抑菌圈形状如字母 D, 则判读为克林霉素诱导耐药 ; 若无 截平 现象, 则按真实的抑菌圈直径报告药物敏感性结果, 判断其敏感或耐药 五 emm 基因分型根据美国疾病预防控制中心 ( cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocol _emm-type. htm) 的 emm 基因分型标准操作程序和 emm 基因 5' 端碱基组成特点设计引物, 对化脓链球菌的 M 蛋白 N 末端用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,pcr) 进行扩增, 委托北京华大基因测序公司进行 PCR 扩增产物的纯化和测序, 序列提交美国疾病预防控制中心专用数据库 (http: // 进行比对, 获得相应 emm 基因分型 六 脉冲场凝胶电泳 (pulsed-field gel electrophoresis,pfge)

3 1063 用限制性内切酶 Sma I 10 U 水解 DNA 样本 3 h [2] PFGE 条件为 :0.5 Tris-Borate- 乙二胺四乙酸缓冲液 ml, 电压 6.0 V/cm, 温度 14, 脉冲夹角 120, 起始脉冲时间 4 s, 终止脉冲时间 40 s, 电泳时间 20 h 将电泳图像录入 BioNumerics (version 4.0,Applied Maths, Inc.) 软件包处理, 不同的条带均视为不同的 PFGE 型 [3], 并对各个型别进行命名 根据每 2 个图像之间的相似性系数, 用非加权配对算术平均法聚类, 构建聚类树 PFGE 的分型标准 : 将 PFGE 相似性 >80% 的菌株聚类为一个簇 [4] 结果一 感染化脓链球菌的患儿年龄分布及菌株体外药物敏感性临床咽拭子样本分离出 75 株化脓链球菌的患儿年龄为 2~9 岁, 其中 2~3 岁患儿 5 例 ( 男 4 例, 女 1 例 ),4~5 岁患儿 18 例 ( 男 12 例, 女 6 例 ),6~7 岁患儿 44 例 ( 男 22 例, 女 22 例 ), 8~9 岁患儿 8 例 ( 男 4 例, 女 4 例 ) 75 株化脓链球菌对青霉素 氨苄西林 利奈唑胺 头孢曲松和万古霉素的敏感性很高, 均为 100% 然而在 75 株化脓链球菌中对红霉素耐药的菌株 71 株, 耐药率达 94.7%, 对克林霉素耐药的菌株 73 株, 耐药率达 97.3%, 对红霉素和克林霉素双重耐药的菌株 70 株, 双重耐药率为 93.3% 对左氧氟沙星耐药的菌株 2 株, 耐药率为 2.7% 二 化脓链球菌的 emm 基因和 PFGE 分型在 75 株化脓链球菌中 49 株检出 emm12 基因, 阳性率为 65.3%;25 株检出 emm1 基因, 阳性率为 33.3%;1 株检出 emm22 基因, 阳性率为 1.3% 将 75 株化脓链球菌 PFGE 的结果导入 BioNumerics 软件进行聚类分析, 见图 1 75 株化脓链球菌 PFGE 结果的带型比较集中, 发现 2 个绝对优势的 PFGE 带型 相同 emm 基因分型菌株在 PFGE 带型中高度聚集, 存在相似的分子特征 在明显聚集的 2 个簇中,Cluster A 包括 21 株化脓链球菌, 均为 emm1 基因型 ;Cluster B 包括 49 株化脓链球菌, 均为 emm12 基因型 讨论化脓链球菌主要引起呼吸道感染, 特别 在儿童呼吸道感染中多见 针对呼吸道感染, 特别是诊断为急性咽炎和扁桃体炎的, 早 期采集咽拭子样本培养, 能够帮助查明致病的 病原菌类型, 从而指导临床医生进行有效 合 理 规范的治疗 随着抗菌药物特别是广谱抗菌药物在临 床上的广泛使用, 细菌的耐药率不断增加, 化 脓链球菌的耐药率也有增加的趋势 本研究表 明, 从患儿咽拭子样本中分离到的化脓链球菌 对 β- 内酰胺类的青霉素和头孢曲松等有很高的敏 感性, 对喹诺酮类药物中的左氧氟沙星也较敏 [5] 感, 这与文献报道一致, 未发现对万古霉素和 利奈唑胺耐药的菌株 但对 β- 内酰胺类抗菌药物 过敏的, 大环内酯类抗菌药物是最主要的 替代治疗药物 近年来, 由于抗菌药物选择压 力及菌株突变等原因, 化脓链球菌对大环内酯 类药物的耐药趋势迅速上升 本研究发现, 上 海市嘉定地区患儿咽拭子样本分离到的化脓链 球菌对红霉素的耐药率为 94.7% 化脓链球菌对 大环内酯类抗菌药物中的红霉素耐药率高, 可 能是由于儿童支原体感染等原因引起疾病时, 临床常使用大环内酯类抗菌药物 ( 阿奇霉素 罗红霉素等 ) 进行治疗, 在一定程度上影响了 化脓链球菌对红霉素的敏感性, 也可能是由于 化脓链球菌中存在某些耐药基因之故 而对克 林霉素耐药率 (97.3%) 较高的主要原因可能是 红霉素的耐药诱导了克林霉素的耐药 有学者 对吉林 四川 湖北 广东 4 个省的 376 株化脓 链球菌进行了研究, 结果显示化脓链球菌对不 同类型抗菌药物的耐药性存在地区差异, 但对 红霉素及克林霉素的耐药率均较高 [6] 化脓链球 菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率由 1993 年的 43% 升高到 2008 年的 98%, 而对克林霉素的耐药 率由 2000 年的 80% 升高到 2008 年的 95% [7] 由 emm 基因决定的 M 蛋白是引起化脓链球菌 感染性疾病的重要致病因子, 目前已经发现 170 个 emm 基因型和 750 个 emm 基因亚型, 但不同的 国家和地区 emm 基因型分布和流行不同 [8-10] 本 研究发现,75 株化脓链球菌 PFGE 的带型比较集 中, 具有相同 emm 基因型的菌株在 PFGE 带型中 高度聚集, 存在 2 个绝对优势的 PFGE 带型, 提 示有优势克隆株在本地区流行的可能 emm1 和

4 1064 检验医学 2016 年 12 月第 31 卷第 12 期 Laboratory Medicine December 2016 Vol. 31 No. 12 emm基因 分型 岁 支气管肺炎 急性咽炎 猩红热 链球菌性咽炎 急性咽炎 急性咽喉炎 支气管炎 链球菌性咽炎 急性化脓性扁桃体炎 图1 75株临床分离的化脓链球菌的emm基因分型及PFGE聚类图 emm1.15 emm1.3 emm1.22 emm1.73 emm1.66 emm1.3 emm22.0 emm12.19 emm12.19 emm12.76 emm12.7 emm12.21 emm12.21 emm12.67 emm12.37 emm12.68 Cluster A Cluster B

5 1065 emm12 基因型化脓链球菌是导致上海市嘉定地区 儿童感染的主要链球菌类型, 所占的比例分别 为 33.3% 和 65.3%, 尤其以 emm12 基因型化脓链 球菌为主 化脓链球菌对克林霉素和红霉素的 耐药率有较高的一致性 (93.3%), 存在较严重 的交叉耐药 这与以往的报道一致,2011 年上 海市猩红热暴发流行,95.6% 的和 83.3% 的 携带者所分离的菌株为含 emm12 基因的化脓链 球菌 [2,10], 可为新型疫苗的研发提供一定的理论 依据 这与中国北京地区及日本的研究结果也 相似 [11-12] [13], 但与其他学者的研究具有一定的差 异 在 1993 至 1994 年间, 流行的化脓链球菌的 菌株多含 emm3(26.3%) emm1(17.5%) emm4(13.9%) 或 emm12(10.2%) 基因 [14] 而 2005 至 2007 年间, 上海和北京地区主要流行含 emm12(40~55.9%) 或 emm1(39.6~42.8%) 基 因的化脓链球菌 [15] 综上所述, 本研究比较客观地反应了上海 市嘉定地区 2014 年 11 月至 2015 年 7 月感染患儿咽 拭子样本分离的化脓链球菌的流行病学情况, 有利于临床医生更清晰地了解化脓 的类型及其药物敏感性情况, 从而为化脓链球 菌感染引起的儿童上呼吸道感染的诊断和治疗 等提供更全面的理论依据, 能够为针对特定 emm 基因型的深入研究提供更多数据支持, 同时为 新型疫苗的研发提供更可靠的理论依据 [1] [2] [3] [4] 参考文献 YA N G P, P E N G X, Z H A N G D, e t a l. Characteristics of group A Streptococcus strains circulating during scarlet fever epidemic,beijing, China,2011[J]. Emerg Infect Dis,2013,19 (6): CHEN M,YAO W,WANG X,et al. Outbreak of scarlet fever associated with emm 12 type group A Streptococcus in 2011 in Shanghai,China[J]. Pediatr Infect Dis J,2012,31(9):e158-e162. T E N O V E R F C, A R B E I T R D, G O E R I N G RV,et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing[j]. J Clin Microbiol,1995,33(9): TSE H,BAO JY,DAVIES MR,et al. Molecular characterization of the 2011 Hong Kong scarlet fever outbreak[j]. J Infect Dis,2012,206(3): [5] BAHNAN W,HASHWA F,ARAJ G,et a1. emm typing,antibiotic resistance and PFGE analysis of Streptococcus pyogenes in Lebanon[J]. J Med Microbiol,2011,60(Pt 1): [6] 叶颖子, 俞蕙, 曾玫, 等. 上海地区儿童化脓性链球菌的红霉素耐药基因研究 [J]. 中华传染病杂志, 2008,26(11): [7] 董太明, 苏健, 黄震东. 我国部分地区儿童 A 组链球菌耐药性的研究 [J]. 中华儿科杂志,1999,50 (1):35. [8] ANAND TD,RAJESH T,RAJENDHRAN J,et al. Superantigen profiles of emm and emm-like typeable and nontypeable pharyngeal strepococcal isolates of South India[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2012,11:3. [9] STOCKMANN C,AMPOFO K,HERSH AL,et al. Evolving epidemiologic characteristics of invasive group A streptococcal disease in Utah, [J]. Clin Infect Dis,2012,55(4): [10] SHEA PR,EWBANK AL,GONZALEZ-LUGO JH,et al. Group A Streptococcus emm gene types in pharyngeal isolates,ontario,canada, [j]. Emerg Infect Dis,2011,17(11): [11] 梁云梅, 常贺生, 沈叙庄, 等. 致儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌 emm 分型 [J]. 临床儿科杂志,2011,29 (4): [12] 粱玉梅, 常贺生, 沈叙庄, 等. 北京地区儿童携带的酿脓链球菌 emm 分型和超抗原 spea 和 spec 的相关性研究 [J]. 实用儿科临床杂志,2010,25 (22): [13] RANTALA S,V A HA KUOPUS S,SILIJANDER T,et al. Streptococcus pyogenes bacteraemia, emm types and superantigen profiles [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(5): [14] 吴琼, 曾婷, 王全意, 等. 儿童 A 族链球菌 emm 分型变迁与大环内酯类耐药的关系 [J]. 中国现代医学杂志,2014,24(27): [15] MA Y,YANG Y,HUANG M,et al. Characterization of emm types and superantigens of Streptococcus pyogenes isolates from children during two sampling periods[j]. Epidemiol Infect,2009, 137(10): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

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