12 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 素类 头孢菌素类不敏感, 而对影响细菌蛋白质合成的抗菌药物如大环内酯类 喹诺酮类等敏感 [3] 由于儿童处于生长发育期, 能够用于治疗儿童 Mp 感染的药物

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1 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 11 文章编号 : (2013) 中图分类号 :Q503 文献标志码 :A DOI: /j.isn 肺炎支原体 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型的分析 叶芸, 李苏亮, 姜萍, 王瑶, 杨超 ( 西安医学院附属医院, 陕西西安 ) 摘要 : 目的了解本地区社区呼吸道感染肺炎支原体 (Mycoplasmapneumoniae,Mp) 感染状况, 探讨肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物的耐药分子机制, 并分析肺炎支原体耐药菌株 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型之间的关系 方法对 400 例社区获得性呼吸道感染患儿咽拭子标本进行分离培养, 应用巢式聚合酶链反应 (PCR) 对临床分离株进行分子鉴定 ; 通过体外药物敏感试验测定 Mp 临床分离株对大环内酯类抗菌药物的最小抑菌浓度 (MIC), 并筛选出耐药株 ; 检测耐药株 23SrRNA 基因序列, 并与标准菌株 M129 基因序列对比分析, 分析突变位点与耐药表型的关系 结果 400 例咽拭子标本中分离 Mp50 株 其中敏感株 32 株, 耐药株 18 株 18 株耐药株分别出现 A2063G A2064G A2067G 位点突变 A2063G 突变株表现出对 14 元环大环内酯类抗菌药物耐药,A2064G 突变株表现为对 元环大环内酯类抗菌药物的耐药,A2067G 突变株表现出对交沙霉素耐药 结论 Mp 对大环内酯类抗菌药物耐药现象严重,23SrRNA 基因位点突变是耐药性产生的主要机制 通过对 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型的分析研究, 初步了解临床肺炎支原体耐药现状, 并且为抗菌药物的合理选择和应用提供理论指导 关键词 : 肺炎支原体 ; 基因突变 ; 大环内酯类 ; 微生物敏感试验 AnalysisonMycoplasmapneumonia23SrRNAgenemutationsiteanddrugresistancephenotype YEYun, LISuliang,JIANGPing,WANGYao,YANGChao. (TheAfiliatedHospitalofXi anmedicalcolege,shanxixi an ,China) Abstract:Objective ToinvestigatetheinfectionsituationofMycoplasmapneumonia(Mp)inpatientswith community acquiredrespiratorytractinfectionandthemoleculardrugresistancemechanismsofmacrolide,andtoanalyze therelationshipbetween23srrnagenemutationsiteofisolatesresistanttompanddrugresistancephenotype.methods Atotalof400throatswabspecimensofcommunity acquiredrespiratorytractinfectionwereculturedtoisolatemp,the clinicalisolateswereidentifiedbynestedpolymerasechainreaction,andtheinvitroantibioticsensitivitytestwas performedforidentifyingmacrolide resistantisolatesthroughtheminimalinhibitoryconcentration(mic).thesequences ofmacrolide resistant23srrnageneweredetected.thesequenceswerecomparedtothecorespondingsequencesof M129.Therelationshipbetweenmutationsiteanddrugresistancephenotypewasanalyzed.Results Atotalof50Mp wereisolatedfrom 400throatswabspecimens.Ofthe50isolates,32isolatesweresusceptibletomacrolide,and18 isolateswereresistanttomacrolide.the18 clinicalisolatesappeared mutation A2063G,A2064G and A2067G, separately.a2063g showed14ringmacrolideresistance.a2064g showed14and16ringmacrolideresistances. A2067Gshowedjosamycinresistance.Conclusions Mptomacrolideresistanceisserious,andthemutationof 23SrRNAgeneisapredominantmechanism thatcontributestothemacrolideresistance.throughtheanalysisof 23SrRNAgenemutationsiteanddrugresistancephenotype,theclinicalMpdrugresistancesituationisobtained.The theoreticalguidanceforreasonableselectionandapplicationofantibioticsisprovided. Keywords:Mycoplasmapneumonia;Genemutation;Macrolide;Microbialsensitivitytest 肺炎支原体 (Mp) 是儿童和青少年社区获得性呼吸道感染的常见病原体之一, 其导致的肺炎 及肺外并发症对儿童健康危害严重 [1 2] Mp 缺乏细胞壁, 故对作用于细胞壁的抗菌药物如青霉 基金项目 : 西安医学院附属医院科研计划项目 (XYFY 09 20) 作者简介 : 叶 芸, 女,1974 年生, 硕士, 副主任技师, 主要从事免疫学及分子生物学研究

2 12 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 素类 头孢菌素类不敏感, 而对影响细菌蛋白质合成的抗菌药物如大环内酯类 喹诺酮类等敏感 [3] 由于儿童处于生长发育期, 能够用于治疗儿童 Mp 感染的药物选择更少, 首选大环内酯类药物, 主要为 14 元环的红霉素和 15 元环的阿奇霉素 近年来已有多个国家报道了 Mp 红霉素耐药株的出现 [4 5] 目前耐药机制的研究热点主要为大环内酯类抗菌药物作用靶位的基因突变 我国也有 Mp 耐药株的报道, 且耐药现象严重, 造成有效抗菌药物失效 但对于肺炎支原体 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型之间的关系缺乏系统研究 为了解本地区社区呼吸道感染肺炎支原体感染状况及进一步明确 Mp 对大环内酯类抗菌药物的耐药机制及基因突变位点与耐药表型之间的关系, 我们从临床分离培养的 Mp 中筛选耐药株, 并对 23SrRNA 药物作用靶位基因进行检测, 系统分析肺炎支原体 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型之间的关系 材料和方法一 对象研究对象为 2008 年 6 月至 2010 年 6 月西安医学院附属医院儿科社区获得性呼吸道感染患儿 400 例, 男 250 例, 女 150 例, 年龄 1~12 岁 二 方法 1.Mp 培养基制备在 70mL 支原体 (PPLO) 基础培养基中加入新生小牛血清 20mL 50% 鲜酵母浸液 5mL 1% 酚红指示剂 200μL 20% 葡萄糖 2.5mL 2.5% 醋酸铊 1mL U/mL 青霉素 0.5mL 新鲜小牛血清由郑州益康生物有限公司生产 ; 鲜酵母由博而特生物科技有限公司提供 ; 酚红指示剂购自国药集团化学试剂有限公司 ; 抗菌药物购自深圳致君制药有限公司 2. 标本采集及培养用灭菌棉签擦拭感染期患儿咽后壁分泌物, 经处理后接种于 Mp 培养基中, 混匀后置 37 温箱中孵育, 并设置阴性与阳性对照 如果有 Mp 生长, 将发酵葡萄糖产酸, 使培养基 ph 值下降, 指示剂发生颜色变化, 并与阳性对照做对比 颜色由红变黄可作为有 Mp 生长的指征 3.Mp 临床分离株的分子鉴定 Mp 聚合酶 链反应 (PCR) 荧光探针法定量检测试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供 4. 体外药物敏感试验按照美国国家临床实验室标准委员会 (NCCLS) 标准判定每株对大环内酯类抗菌药物的敏感性, 采用微量稀释法测定临床分离株的最小抑菌浓度 (MIC) [6 7] 用 Mp 液体培养基倍比稀释药物, 从 256mg/L 稀释至 0.001mg/L 各管中加入等量菌液( 质量浓度为 CCU/L), 置于 37 二氧化碳温箱孵育 8 种药物标准品均购自中国药品生物制品检定所, 其中 14 元环大环内酯类抗菌药物包括红霉素 克拉霉素 罗红霉素,16 元环大环内酯类抗菌药物包括交沙霉素 麦迪霉素 泰利霉素 螺旋霉素,15 元环大环内酯类抗菌药物为阿奇霉素 Mp 标准株 M129 作为质控菌株, 凡是 MIC 值超出标准株 MIC 值 4 倍以上, 将其判为耐药 5. 提取临床分离株 DNA 将冷冻保存的 Mp 菌株取出后传代复苏 当生长时间较稳定后 ( 约 7d), 吸取 20μL 菌液置于 1.5mL 离心管中, 以 g 离心 10min, 弃去上清液后, 然加标本处理液 200μL 并混匀, 在 100 沸水中水浴 10min, 此溶液作为 DNA 模板备用 6.PCR 扩增目的基因片段及 DNA 测序根据 GenBank 数据库中的 Mp23SrRNA 核酸序列 (NC_000912) 利用生物学软件 Primer5.0 自行设计巢式 PCR 扩增所需的引物, 见表 1 扩增体系为 :Mp 1F 和 Mp 1R 引物各 15pmol,TaqDNA 聚合酶 1U, 总反应体积 20μL, 其中模板液 5μL 热循环参数为 93 预变性 2min 93 1min 50 1min 72 1min, 共 35 个循环, 最后 1 个循环 72 延长 5min, 扩增产物为 290bp 然后取 2μL 作为模板继续进行第 2 轮扩增, 用 Mp 2F 和 Mp 2R 作为引物, 其余条件相同, 完成第 2 次扩增 扩增终产物为 244bp 并对其进行电泳, 检测是否存在目的片段 对于经电泳检测阳性的标本, 将过夜培养的菌液直接取 1mL 放离心管中送往上海生工生物技术服务有限公司进行测序, 测得序列与 NCBI 已登录的 Mp 标准株 M129(ATCC 29342D) 相应基因序列作比对, 每次实验均设立阳性和阴性对照 [7 8]

3 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 13 表 1 巢式 PCR 扩增引物及产物大小 引物 序列 (5 3 ) 位置 产物大小 (bp) Mp 1F GGTCCTAAGGTAGCGAAATT 1926~ Mp 1R CAGTTACCAATTAGAACAGC 2215~2196 Mp 2F CCTAGTCGGGTAAATTCCGT 1946~ Mp 2R CCAAGGGTAGTATTCCACCT 2189~2170 对 14 元环大环内酯类抗菌药物耐药,A2064G 突变株表现为对 元环大环内酯类抗菌药物耐药, A2067G 突变株表现为对交沙霉素耐药 见表 3 注 :Mp 1 为外套引物 ;MP 2 为内套引物 ;F 为正向引物 ;R 为反向引物 结 果 一 Mp 的分离培养及分子鉴定 400 份咽拭子标本共分离培养出 Mp50 株, 分离阳性率为 12.5% 应用 PCR 荧光探针法定量检测证实均为 Mp 二 体外药物敏感试验检测结果按照美国国家临床实验室标准化委员会制定的标准, 对分离培养阳性的 50 株 Mp 及标准株 M129 进行体外药物敏感试验, 判定时间为 5~14 d, 结果发现其中 32 株 (64%) 敏感,18 株 (36%) 耐药 见表 2 注 :1~3 为部分耐药株 ;M 为 Marker 图 1 巢式 PCR 产物电泳图 表 2 32 株敏感株的 MIC (μg/ml) 抗菌药物 范围 50% 90% M129 红霉素 0.002~ 克拉霉素 0.001~ 阿奇霉素 0.001~ 交沙霉素 0.016~ 麦迪霉素 0.063~ 泰利霉素 0.002~ 螺旋霉素 0.016~ 罗红霉素 0.002~ 三 巢式 PCR 扩增和 DNA 测序结果 1. 产物电泳 巢式 PCR 扩增出现的目的条 带见图 1 2.DNA 测序 敏感株与耐药株的 DNA 测序 结果见图 2~5 四 突变位点与耐药株体外药敏实验结果 对分离培养阳性的 50 株 Mp 及标准株 M129 进行测序分析, 其中 32 株敏感株与标准株 M129 比 较均未发生基因位点突变 18 株耐药株分别出现 A2063G(12/16) A2064G(3/16) A2067G(1/16) 位 点突变, 且以 A2063G 为主 ( 约占 75%), 有 2 株耐 药菌株无基因位点的突变 A2063G 突变株表现为 注 : 下划线处指 Mp 敏感株 23SrRNA 基因的 位点的碱基, 均为 A 图 2 Mp 敏感株基因测序图 ( 无点突变 ) 注 : 下划线处指 2063 位点发生碱基 A G 突变图 3 Mp 耐药株 2063 位点突变测序图

4 14 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 注 : 下划线处指 2064 位点发生碱基 A G 突变 图 4 Mp 耐药株 2064 位点突变测序图 注 : 下划线处指 2067 位点发生碱基 A G 突变 图 5 Mp 耐药株 2067 位点突变测序图 表 3 18 株耐药株体外药物敏感试验检测结果与突变位点结果 菌株序号 年龄 MIC(μg/mL) 红霉素克拉霉素阿奇霉素交沙霉素麦迪霉素泰利霉素螺旋环素罗红霉素 突变位点 A2063G A2063G A2064G A2063G 无 A2063G A2063G A2063G A2067G A2063G A2064G A2063G A2063G 无 A2063G A2064G A2063G A2063G

5 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. 15 讨 Mp 近年来感染呈加重趋势, 所导致的肺炎和肺外并发症对儿童健康危害严重 [8 10] 鉴于其自身的结构特点和儿童处于生长发育期的特殊性, 大环内酯类抗菌药物成为治疗儿童 Mp 感染的首选药物 大环内酯类抗菌药物通过抑制细菌蛋白质的合成而发挥抑菌作用 作用靶位是细菌核糖体 50S 大亚基, 结合于转肽酶中心与肽输出通道狭窄之间的部分, 通过机械性的阻塞通道而抑制新生肽链的延伸, 从而阻碍蛋白质的合成 [11] 同时还可抑制核糖体 50S 大亚基的组装, 导致细胞内有功能的核糖体数量下降, 细菌蛋白合成能力下降, 结合位点多位于 23SrRNAV 区中心环的 A2063 A2064 位 [12] [13] Morozumi 等分析 2002~2006 年 Mp 菌株对大环内酯类耐药的情况, 发现耐药株的出现频率呈增快趋势 在一定程度上说明 Mp 对大环内酯类抗菌药物耐药非常严重 Pereyre 等 [4] 2007 年首次报道出现了 Mp 耐药株, 且认为 Mp 对大环内酯类耐药的主要机制是 23SrRNA 发生点突变 Mp 耐药株的出现造成有效治疗抗菌药物的失效, 影响了临床转归 目前认为 Mp 耐药机制有以下几种 :(1) 靶位改变 : 基因突变或甲基化 ;(2) 主动外排 ;(3) 药物灭活 [14] 根据以往研究结果 [15], 说明某些位点突变与耐药表型之间有因果关系, 但其突变位点与耐药表型之间的关系需要进一步证实 本研究从 400 份社区获得性呼吸道感染患儿咽拭子标本共分离培养出 Mp50 株, 分离阳性率为 12.5% 分离阳性率较其他地区低 [16], 分析原因为采集标本前部分患儿使用过大环内酯类药物导致 Mp 已被抑制 因此不能真正反映 Mp 对大环内酯类抗菌药物的耐药率 分离培养阳性的 50 株中有 18 株耐药, 耐药率 36% 进一步说明本地区患儿中大环内酯类耐药肺炎支原体比例非常高, 需要引起临床的高度重视 本研究分离培养并筛选了 18 株对大环内酯类耐药的 Mp 阳性地方株, 并研究了其可能的耐药机制, 结果证实 23SrRNAV 区靶位基因突变是耐药性产生的主要机制 18 株耐药株分别出现 论 A2063G(12/16) A2064G(3/16) A2067G(1/16) 位点突变, 且以 A2063G 为主 ( 约占 75%) 有 2 株耐药菌株无基因位点的突变, 分析其耐药可能与 Mp 耐药的其他机制有关 A2063G 突变株表现出对 14 元环大环内酯耐药,A2064G 突变株表现为对 元环大环内酯耐药,A2067G 突变株表现出对交沙霉素耐药 本研究对所有 Mp 感染病例给予阿奇霉素治疗,32 例对大环内酯类敏感未发生基因突变患者 3~7d 发热消失,1 周左右咳嗽减轻, 治疗 2 周后复查胸片显示炎性反应基本吸收 16 例对大环内酯类耐药发生基因突变患者 6~10d 发热消失,2 周左右咳嗽减轻, 治疗 3 周后复查胸片显示炎性反应基本吸收 2 例对大环内酯类耐药未发生基因突变患者患者治疗后仍有肺纹理增粗, 选用左氧氟沙星继续治疗 1 周后逐渐恢复正常 提示耐药肺炎支原体感染具有难治性, 可导致患儿病程延长, 给临床治疗带来困难 总之, 本研究通过对肺炎支原体 23SrRNA 基因突变位点与耐药表型的分析, 初步了解了本地区临床肺炎支原体耐药现状及基因突变位点与耐药表型之间的关系 但由于研究例数不多, 尚存在局限性, 且体外药敏试验对大环内酯类耐药的临床意义尚不十分明确, 因此有必要通过复制动物模型来进一步研究, 为临床上合理应用抗菌药物提供参考, 从而提高临床对耐药 Mp 的诊治水平 参考文献 [1] Schmidt IoanasM,BenderM,RothA,etal.Serologic earlydiagnosisofpneumoniacausedbymycoplasma pneumoniae[j].dtschmedwochenschr,2006,131 (12): [2] HarisJA,KolokathisA,CampbelM,etal.Safety and eficacy ofazithromycin in the treatmentof community acquired pneumonia in children[j]. PediatrInfectDisJ,1998,17(10): [3] BébéarCM,PereyreS.Mechanismsofdrugresistance inmycoplasmapneumoniae[j].curdrugtargets InfectDiscord,2005,5(3): [4] PereyreS,CharonA,RenaudinH,etal.Firstreport ofmacrolide resistantstrainsand description ofa

6 16 检验医学 2013 年 1 月第 28 卷第 1 期 LaboratoryMedicine,January2013,Vol28.No1. novelnucleotidesequencevariationinthep1adhesin gene in Mycoplasma pneumoniae clinical strains isolated in France over 12 years[j].j Clin Microbiol,2007,45(11): [5] MatsuokaM,NaritaM,OkazakiN,etal.Characteri zationandmolecularanalysisofmacrolide resistant Mycoplasmapneumoniaeclinicalisolatesobtainedin Japan[J].AntimicrobAgentsChemother,2004,48 (12): [6] PereyreS,GuyotC,RenaudinH,etal.Invitroselection andcharacterizationofresistancetomacrolidesand relatedantibioticsinmycoplasmapneumoniae[j]. AntimicrobAgentsChemother,2004,48(2): [7] TakahataM,ShimakuraM,HoriR,etal.Invitroand in vivo eficacies oft 3811ME (BMS ) againstmycoplasma pneumoniae[j]. Antimicrob AgentsChemother,2001,45(1): [8] XuYC,ZhuLJ,XuD,etal.Epidemiologicalcharacte ristics and meteorological factors of childhood Mycoplasma pneumoniae pneumonia in Hangzhou [J].WorldJPediatr,2011,7(3): [9] YounYS,LeeKY,HwangJY,etal.Diference of clinical features in childhood Mycoplasma pneumoniaepneumonia[j].bmcpediatr,2010,10: 48. [10] 郭丽, 张善辉, 王平平. 儿童血清肺炎支原体感 染情况调查 [J]. 检验医学,2012,27(11): [11] WilsonDN,HarmsJM,NierhausKH,etal.Species specificantibiotic ribosomeinteractions:implications fordrugdevelopment[j].biolchem,2005,386 (12): [12] ZamanS,FitzpatrickM,LindahlL.Novelmutationsin ribosomal proteins L4 and L22 that confer erythromycinresistanceinescherichiacoli[j].mol Microbiol,2007,66(4): [13] MorozumiM,IwataS,HasegawaK,etal.Increased macrolideresistanceofmycoplasma pneumoniaein pediatric patients with community acquired pneumonia[j].antimicrobagentschemother,2008, 52(1): [14] 辛德莉, 糜祖煌, 侯安存, 等. 肺炎支原体对红霉素耐药机制研究 [J]. 实用儿科临床杂志,2005,20 (7): [15] AverbuchD,Hidalgo GrassC,MosesAE,etal. Macrolide resistance in Mycoplasma pneumoniae, Israel,2010[J].EmergInfectDis,2011,17(6): [16] 姜毅, 李温慈, 徐海滨, 等. 小儿肺炎咽拭子肺炎支原体培养及药敏分析 [J]. 中华医院感染学杂志,2011,21(9): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 范基农 ) 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿 检验医学 杂志今年 改头换面 检验医学 是一本由上海市临床检验中心主办的全国公开发行的中国科技论文统计源核心期刊及华东地区优秀期刊 刊物坚持以实用为主, 理论与实践 普及与提高 检验与临床三结合, 体现了上海检验界的学术水平, 也为全国各级检验人员提供了他们所需的基础知识和新理论 新技术, 为此, 深受全国检验界同道的欢迎和好评 近年来, 检验医学迅猛发展, 与临床医学相互渗透, 同时与检验相关的边缘学科也发展迅速 而本刊自 1986 年创刊 26 年以来一直将栏目分为免疫学检验 临床检验与血液学检验 微生物学检验 生物化学检验论著等, 后虽随着学科的发展, 又增设了分子生物学检验和实验室管理 2 个栏目 但这种绝对的细分已不再适应检验医学的发展, 为此本刊将从今年第 1 期起将栏目改为 临床应用研究 论著 技术研究与应用 论著 基础研究 论著 等, 并增设 读者 作者 编者 栏目, 便于三者互通信息 沟通交流 同时还将从每期论文中选出数篇重点 热点文章题目放于封面导读之中, 增加对读者的吸引力及关注力 本刊还将狠抓杂志内在质量, 期待更上一个新台阶 ( 本刊记者 : 范基农 )

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