11 期唐蕾, 等 : 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析 1665 由于近年来水产养殖水体经常出现绿藻爆发等现象, 容易引起水体 ph 变化, 而 CuSO 4 作为杀藻剂在水产养殖中应用广泛, 这些环境因素的变化会对水产动物产生一定的影响 GPxs 可作为环境胁迫条件下

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1 第 40 卷第 11 期水产学报 Vol. 40, No 年 11 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Nov., 2016 文章编号 : (2016) DOI: /jfc 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析唐蕾 1,2, 傅明骏 1,3, 赵超 1,3, 邱丽华 1, 刘文生 2 1*, 江世贵 (1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 ; 2. 华南农业大学动物科学学院, 广东广州 ; 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 热带水产研究开发中心, 海南三亚 ) 摘要 : 为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶 (selenium-dependent glutathione peroxidase, Se- GPx) 在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用, 实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的 Se-GPx 基因 (Pm Se-GPx) 片段为基础, 利用 RACE 技术获得 Pm Se-GPx 基因的 cdna 全长, 并对其进行了生物信息学分析 ; 利用荧光定量 PCR 技术研究了 Pm Se-GPx 在斑节对虾不同组织卵巢发育各期肝胰腺组织在 ph9 硫酸铜 (Cu 2+ ) 应激下的相对表达量和变化趋势结果显示,Pm Se-GPx 基因 cdna 全长为 959 bp,5' 非编码区 (UTR) 长 10 bp, 开放阅读框 (ORF) 长 639 bp, 编码 212 个氨基酸,310 bp 的 3'UTR 包含一个硒代半胱氨酸插入序列 (SECIS),ORF 中的密码子 209 TGA 211 编码硒代半胱氨酸 (selenocysteine, U 67 ) 实时定量 PCR 实验结果表明,Pm Se-GPx 在斑节对虾的肝胰腺卵巢精巢心脏等组织中均有表达, 其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织, 卵巢次之 ; 卵巢发育阶段表达结果则显示 Pm Se-GPx 在卵巢发育各期均有表达, 在卵巢 Ⅲ 期表达量最高, 其次是 V 期 ; 在 Cu 2+ 胁迫下, 其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势 ; 在环境 ph 为 9 胁迫下, 表达趋势呈现先下降, 后回升, 然后又下降, 再大幅上升的趋势研究表明,Se- GPx 在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用, 且 Se-GPx 参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控关键词 : 斑节对虾 ; 含硒谷胱甘肽过氧化物酶 ; 卵巢发育 ;Cu 2+ 胁迫中图分类号 : Q 785;S 文献标志码 : A 谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GPx) 是在抗氧化防御系统中起到重要作用的一类功能蛋白质, 它能够以谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 或硫氧还蛋白 (thioredoxin, Trx) 为电子供体清除体内多余的过氧化氢和磷脂过氧化物, 从而保护机体免受氧化损伤目前在动物体内发现了 8 种 GPx, 分别为 GPx1~8, 并根据 GPxs 催化活性中心氨基酸序列是否携带有一个特殊的硒代半胱氨酸 (selenocysteine, SeCys), 其有助于提高其催化活性, 将 GPx 区分为含硒 GPx 和不含 GPx [1] 以 SeCys 作为氧化反应活性中心的 GPxs 多以谷胱甘肽 (GSH) 为底物, 其反应中心通常由催化四联体 ( 硒代半胱氨酸色氨酸天冬酰胺和谷氨酸 ) 组成 [2] 除了具有共同的抗氧化功能外, 不同 GPxs 亚型还具有各自独特的生物学功能目前 GPxs 的研究主要集中在人类医学上, 在甲壳动物中的研究较少在凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 刀额新对虾 (Metapenaeus ensis) 斑节对虾(Penaeus monodon) 和拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 等甲壳动物中对含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因进行了克隆和表达分析, 但并未有明显的亚型区分 [2-6] 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 现代农业产业技术体系建设专项 (CARS-47); 广东省科技计划项目 (2014B ); 海南省应用技术研发与示范推广专项 (ZDXM ); 深圳市生物产业发展专项资金现代农业生物产业推广扶持计划 (NYSW ) 通信作者 : 江世贵, jiangsg@scsfri.ac.cn

2 11 期唐蕾, 等 : 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析 1665 由于近年来水产养殖水体经常出现绿藻爆发等现象, 容易引起水体 ph 变化, 而 CuSO 4 作为杀藻剂在水产养殖中应用广泛, 这些环境因素的变化会对水产动物产生一定的影响 GPxs 可作为环境胁迫条件下水生生物机体内抗氧化性能的检测指标低盐度胁迫能促进黄姑鱼 (Nibea albiflora) 抗氧化系统的增强,GSH-Px 在一定盐度范围内呈先上升后下降的趋势 [7] 氨氮胁迫下凡纳滨对虾的 GPx 活性显著上升, 投喂抗坏血酸丰富的卤虫可增加凡纳滨对虾的抗氧化能力 [8] 氨氮胁迫过程中脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 的血淋巴 GPx 活力和 GPx 基因表达显著高于对照组, 而肝胰腺中 GPx 基因表达在 48~72 h 有所下降, 结果可推测肝胰腺可能是脊尾白虾主要的氨氮代谢中心 [9] 本实验克隆了斑节对虾 Pm Se-GPx 基因 cdna 全长, 研究了该基因的组织差异性表达卵巢发育周期中表达水平变化在 CuSO 4 胁迫和 ph 9 胁迫下的斑节对虾 Se-GPx 基因的表达变化趋势, 研究结果将有助于阐明 Se-GPx 在斑节对虾卵巢发育中的调控机制及机体对环境理化因子应激机制 1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用斑节对虾组织样及卵巢发育各期样本采于海南三亚 (120~200 g), 取脑心脏肌肉胸神经肝胰腺鳃淋巴器官精巢卵巢等组织, 所需的斑节对虾不同卵巢发育阶 [10] 段判断可依据黄建华等的研究, 每组取 3 个平行, 加入 RNAlater 溶液 (Life Technologies, USA) 4 C 保存过夜, 然后转移到 80 C 保存 1.2 实验方法环境理化因子胁迫环境理化因子胁迫实验在深圳试验基地开展, 实验所用斑节对虾体重为 15~20 g, 实验分别使用硫酸铜浓度为 7.73 mg/l [11] 和 ph 9 的海水, 每天换水两次, 分别在 h 时取肝胰腺组织, 每组取 3 个平行, 加入 RNAlater 溶液 (Life Technologies, USA) 4 C 保存过夜, 然后转移到 80 C 保存 RNA 提取和逆转录根据 TRIzol(Life Technologies, USA) 说明书提取斑节对虾各组织卵巢发育各期应激不同时间段的肝胰腺组织各取 2 μl RNA 用 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性, 取 2 μl RNA 用核酸蛋白分析仪 Nanodrop2000 进行浓度检测各取 3 μg 肝胰腺总 RNA 用 SMART TM RACE kit (Clontech, USA) 进行逆转录合成 cdna 和 3 RACE cdna, 用于基因片段的验证及基因全长的扩增取 1 μg 各样本 RNA, 用 Prime Script TM Realtime PCR Kit (TaKaRa, Japan) 进行逆转录合成 cdna, 用于基因表达情况的检测 RACE 扩增 Pm Se-GPx 基因全长以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得 Pm Se-GPx 的部分序列为基础, 设计 Pm Se-GPx 的 3 RACE 引物 Se-GPx-rF1 和 Se-GPx-rF2( 表 1) 以斑节对虾 3 cdna 为模板, 加入 Se-GPx-rF1 和 UPM 引物进行第一次特异性扩增,PCR 体系总体积为 25 μl, 分别为 16.2 μl RNase Free ddh 2 O,2.5 μl 10 Ex Taq Buffer,2 μl dntp Mix (10 μmol/l),1 μl 3 cdna,0.5 μl Se-GPx-rF1 (10 μmol/l),2.5 μl UPM,0.3 μl Ex Taq 扩增程序为 94 C 预变性 3 min;94 C 变性 30 s,72 C 退火 30 s,72 C 延伸 3 min,5 个循环 ; 94 C 变性 30 s,63 C 退火 30 s, 70 C 延伸 3 min,5 个循环 ;94 C 变性 30 s, 68 C 退火 30 s,72 C 延伸 3 min,25 个循环 ; 72 C 延伸 10 min,4 C 保存 10 min 然后以 PCR 产物为模板进行第二次特异性扩增,PCR 体系总体积为 25 μl, 分别为 18.2 μl RNase Free ddh 2 O,2.5 μl 10 Ex Taq Buffer,2 μl dntp Mix (10 μmol/l),1 μl 3 cdna,0.5 μl Se-GPx-rF2 (10 μmol/l),0.5 μl NUP,0.3 μl Ex Taq 设置一个空白对照, 用同体积 ddh 2 O 代替 Se-GPx-rF2, 表 1 引物序列 Tab. 1 Nucleotide sequences of primers 引物名称 primers 引物序列 sequences of primers Se-GPx-F GTGGAAAGCCTGGATGA Se-GPx-R ACTACGACAAAGAGTGGACC Se-GPx-rF1 ACAGCGAGGACCCAATCTACACG Se-GPx-rF2 GGAGGACCTGAAGGGGGACATCA Se-GPx-qF GAGGAATACCGAGGGAAG Se-GPx-qR AAGGGAAGCCAAGAATGA 18S-qF GAGACGGCTACCACATCTAAG 18S-qR ATACGCTAGTGGAGCTGGA

3 1666 水产学报 40 卷同一条件扩增扩增程序为 94 C 预变性 3 min; 94 C 变性 30 s,60 C 退火 30 s,72 C 延伸 3 min, 35 个循环 ; 72 C 延伸 10 min,4 C 保存 10 min 用浓度为 1.2% 的琼脂糖凝胶检测产物, 然后用 2% 的琼脂糖凝胶电泳, 对目的条带进行割胶回收 PCR 产物按与 pmd18-t 载体 16 C 连接过夜, 转化涂板, 挑取单克隆摇菌, 菌液 PCR 检测目的条带正确导入后送公司测序 [12] Pm Se-GPx 基因验证根据斑节对虾肝胰腺转录组中的 Pm Se-GPx 的部分序列及 3 RACE 结果, 设计 Pm Se-GPx 的上下游验证引物 Se-GPx- F 和 Se-GPx-R( 表 1) 以斑节对虾肝胰腺 cdna 为模板,Se-GPx-F 和 Se-GPx-R 为引物进行扩增, PCR 体系总体积为 25 μl, 分别为 18.2 μl RNase Free ddh 2 O,2.5 μl 10 Ex Taq Buffer,2 μl dntp Mix (10 μmol/l),1 μl 3 cdna,0.5 μl Se-GPx-F (10 μmol/l),0.5 μl Se-GPx-R (10 μmol/l),0.3 μl Ex Taq 扩增程序为 94 C 预变性 3 min;94 C 变性 30 s,55 C 退火 30 s,72 C 延伸 3 min,35 个循环 ;72 C 延伸 10 min,4 C 保存 10 min 琼脂糖凝胶检测 PCR 产物, 按上述方法进行克隆测序验证序列及系统发生分析利用 NCBI 数据库中 VecScreen Blast ORF Finder 等软件分析测序结果使用 DNAman 软件对已验证序列进行片段的拼接使用 ExPASY 软件 ( compute_pi/) 进行等电点及分子量的预测功能位点的查找使用 NetPhos 2.0 server( cbs.dtu.dk/services/netphos/) 查找磷酸化位点 ; 用 SMART 软件 ( 进行蛋白结构域和功能域的预测和分析用在线软件 SECISearch ( Search.html) 查找序列硒插入片段采用 SWISS- MODEL ( 在线软件进行蛋白质三级结构的预测用 Clustal-X 软件对不同物种同源序列进行多重序列比对, 用 MEGA 5.0 进行聚类分析, 并采用 Neighbour-joining 方法构建系统进化树 Pm Se-GPx 基因的表达情况以扩增得到的 Pm Se-GPx 基因和内参基因 18S 序列, 设计定量引物 Se-GPx-qF 和 Se-GPx- qr 18S-qF 和 18S-qR( 表 1), 对斑节对虾各组织卵巢发育各期 CuSO 4 胁迫和 ph9 胁迫下的 Pm Se-GPx 基因的表达量进行检测反应总体系为 10 μl,5 μl SYBR 1.5 μl 模板 0.3 μl 的上游引物和 0.3 μl 的下游引物, 双蒸水补足 10 μl 使用 Lightcycler 480II 定量 PCR 仪, 反应条件为 95 C 预变性 30 s;95 C 变性 20 s,60 C 退火 60 s,45 个循环 ;65 C 延伸 15 s; 溶解温度从 55 C 升至 97 C;37 C 冷却 5 min 每个样品进行 3 个重复操作, 基因表达量用 2 ΔΔCt 法计算, 实验数据用 SPSS 软件进行统计分析 2 结果 2.1 Pm Se-GPx 基因的克隆与序列分析 Pm Se-GPx 基因 (GenBank 登录号 :KR908787) 全长为 959 bp, 开放阅读框长 639 bp, 编码 212 个氨基酸,5' 非编码区 10bp,3' 非编码区 310 bp 在 28 bp 的 polya 尾前 14 bp 处有个加尾信号预测等电点为 4.61, 分子量为 ku( 图 1) 序列含有有 10 个磷酸化位点 (Ser 150 Ser 195 Thr 107 Thr 129 Tyr 35 Tyr 117 Tyr 145 Tyr 156 Tyr 164 Tyr 190 ),1 个糖基化位点 ( 43 NGS 45 ) 氨基酸序列第 67 位氨基酸为特殊的硒代半胱氨酸 (U 67 ) 2.2 Pm Se-GPx 硒插入片段 (SECIS) 预测用 SECISearch 2.19 软件预测斑节对虾 Se- GPx 基因的 3'-UTR 有 92bp 的硒代半胱氨酸插入片段 (SECIS), 形成一个茎环状二级结构 ( 图 2) 与人类 GPx3 的硒插入片段相比较可以看出相似度很高, 都属于二型硒插入片段 [12], 斑节对虾 Se- GPx 硒插入片段含有一个顶环,4 个内环,3 个折叠, 保守的腺嘌呤 (AA) 在内环上 2.3 Pm Se-GPx 蛋白三级结构预测利用 SWISS-MODEL 网站进行 Pm Se-GPx 蛋白质三级结构的预测, 以人类 GPx3 的三维结构 ( 图 3-a) 作为模板 [PDB code:2r37.1.a], 用三级结构查看软件 PyMOL 对 Pm Se-GPx 的蛋白序列进行空间三维结构的模拟 ( 图 3-b) 结果可知, 其蛋白结构由 6 个 β- 片层 6 个 α- 螺旋及连接的无规则卷曲构成, 与人类的 GPX3 蛋白三级结构相似性为 49.11%, 整体蛋白构像均呈袋状 2.4 进化树构建用 MEGA5.0 软件构建斑节对虾与其他物种 GPxs 系统发育树, 不同物种的 GPx1 GPx2 GPx3 和 GPx4 明显地分别聚为一支, 甲壳动物的 GPx( 拟穴青蟹凡纳滨对虾斑节对虾罗氏

4 11 期唐 1667 蕾等斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析图1 Pm Se-GPx基因的cDNA全长序列及编码的氨基酸序列双下划线为信号肽(M1-A19) 方框为谷氨酰胺还原酶活性位点(G55-T70) 加粗字体为起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA) 圆圈标注为硒代半胱氨酸(U67) 波浪线为加尾信号(TAATAA) 斜体为磷酸化位点 (S150 S195 T107 T129 Y35 Y117 Y145 Y156 Y164 Y190) 灰色阴影为糖基化位点(43NGS45) Fig. 1 The cdna and amino acid sequences of gene encoding GPx3 from P. monodon Double underline indicates the signal peptide (M1-A19). Glutamine reductase activity sites (G55-T70) are labeled in box. The translation initiation codon (ATG) and termination codon (TAA) are indicated in bold. Selenium cysteine (U67) is showed by circle. wavy line indicates the polyadenylation signals (TAATAA) in the UTR. The phosphorylation sites (S 150 S 195 T 107 T 129 Y 35 Y 117 Y 145 Y 156 Y 164 Y 190 ) are showed by italics, the glycosylation site (43NGS45) is marked by grey shade 图2 Fig. 2 斑节对虾(a)与人类(b)硒插入片段比较 Comparison of selenocysteine insertion sequence (SECIS) elements of H. sapiens GPx3 (a) with P. monodon GPx (b) 沼虾)单独聚为一支并与GPx1和GPx2聚为一个 2.5 多重序列比对大支斑节对虾Se-GPx与褶纹冠蚌的GPx聚为一用Bioedit进行多重序列比对斑节对虾Se- 小支然后与其他物种GPx3 刀额新对虾卵巢 GPx与其他物种的GPx3一致性较低但其催化四特异表达GPx聚为一支(图4) 联体(Sec 67 Gln 102 Trp 175 和Asn 176 )保守性很高

1668 水产学报 40 卷 CuSO4胁迫Pm Se-GPx基因的表达斑节对虾经浓度为7.73 mg/l的cuso4胁迫后不同时间段取样用实时荧光定量方法检测Pm Se-GPx基因水平的变化(图8) 表达结果总体趋势为先下调后上调后又下调暴露48 h后pm Se-GPx的表达量有一个显著上调的过程到 96 h又明显抑制 (P<0.

5 1668 水产学报 40 卷 CuSO4胁迫Pm Se-GPx基因的表达斑节对虾经浓度为7.73 mg/l的cuso4胁迫后不同时间段取样用实时荧光定量方法检测Pm Se-GPx基因水平的变化(图8) 表达结果总体趋势为先下调后上调后又下调暴露48 h后pm Se-GPx的表达量有一个显著上调的过程到 96 h又明显抑制 (P<0.05) ph9胁迫pm Se-GPx基因的表达斑节对虾经pH 9胁迫后不同时间段取样用实时荧光定量图3 Pm Se-GPx蛋白三级结构预测方法检测Pm Se-GPx基因在肝胰腺中的表达水平 (a)人类gpx3的三维结构 (b)斑节对虾se-gpx的三维结构 Fig. 3 的变化结果如图9所示 ph 9的胁迫条件下Pm Prediction of the tertiary structure of Se-GPx基因表达水平总体也是明显的下调趋势 Pm Se-GPx protein 在24 h左右有小幅度回升但在96 h左右又大幅 (a) indicates the three-dimensional space structure of human, (b) indicates the three-dimensional space structure of P. monodon 度回升一致性最高的矛尾鱼 (Latimeria chalumnae)为 % 与金领娇鰩(Manacus vitellinus) 青鰆 (Oryzias latipes)和正毛丝鼠(chinchilla lanigera)一致性为 41.98% 与红鳍东方 (Chinchilla lanigera)和金仓鼠(mesocricetus auratus)一致性为 41.51% 白斑狗鱼 (Esox lcius) 布氏鼠耳蝠 (Myotis brandtii)和短尾负鼠 (Monodelphis domestica)的一致性分别为 41.04% 40.09%和 39.62%(图5) 2.6 讨论 GPxs目前在人类中发现8种且每种亚型具不同的生物学功能 [13] 本实验从斑节对虾肝胰腺转录组中筛选获得了斑节对虾Se-GPx基因的一段序列克隆获得其全长并命名为 Pm Se-GPx (GenBank登录号 ALM ) 信号肽预测结果显示Pm Se-GPx有19个氨基酸的信号肽表明该蛋白是分泌性蛋白通过Blast比对和进化树分析发现斑节对虾Se-GPx其他物种的GPxs同属于 Pm Se-GPx基因表达情况 GPxs家族而且与GPx3亚型聚为一支可推测用实时其为GPx3亚型 Pm Se-GPx氨基酸序列与其他物荧光定量的手段检测Pm Se-GPx基因在不同组织种的GPx3氨基酸序列进行多重序列比对发现Pm 中表达水平的变化以18S为内参基因(图6) 由 Se-GPx与其他物种的GPx3一致性较差最高只图可知 Pm Se-GPx基因在斑节对虾所检测的9种有45.28% 结果预示着甲壳动物的GPxs家族可组织(脑胸神经心脏肝胰腺肌肉淋巴能与哺乳动物 GPxs家族的进化过程有一定差器官鳃精巢和卵巢等)中均有表达其中肝异其原因有待进一步深入研究 Pm Se-GPx基因在各组织的表达胰腺表达量最高为鳃的81倍卵巢次之与其他组织的表达水平都有显著性的差异(P<0.05) 台湾学者从斑节对虾血细胞中克隆表达出一个含硒GPx基因(GenBank登录号 GQ996722) 用实其 cdna全长为 1321 bp 开放阅读框为 564 时荧光定量方法检测Pm Se-GPx基因在斑节对虾 bp的编码187个氨基酸 [4] 该GPx与本研究的Pm 卵巢不同的发育时期的表达水平的变化 (图 7) Se-GPx两者均为含硒GPx 3'非编码区含有一个斑节对虾卵巢的不同发育时期呈上升趋势 Pm 硒插入片段与Pm Se-GPx氨基酸序列比对一致 Se-GPx在 I期时表达量较低在卵巢发育前期性仅为38.5% 进化树分析结果显示 PmGPx与 Ⅱ期中表达骤然升高(P<0.05) 为I期的2.2倍随脊椎动物GPxs家族中的GPx1和GPx2亚型聚为一后在III期继续升高达到峰值为I期的2.8倍支而Pm Se-GPx与脊椎动物GPxs家族中的GPx3 IV期略有下降但与其他时期无显著差异亚型聚为一支因此可推测它们为斑节对虾GPxs (P>0.05) 在成熟期V期时有升高趋势为I期的家族不同的GPx亚型 PmGPx经半定量检测结果 2.7倍显示其在各组织均有表达 Pm Se-GPx荧光定量 Pm Se-GPx基因在卵巢各期的表达

6 11 期唐蕾, 等 : 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析 1669 图 4 邻位法构建的 GPxs 系统发育树 Fig. 4 NJ phylogenetic tree based on GPxs Litopenaeus vannamei( 凡纳滨对虾 GPx: AAY ), Macrobrachium rosenbergii( 罗氏沼虾 Se-GPx: ACM ), Metapenaeus ensis( 刀额新对虾 GPx: ACB ), Scylla paramamosain( 拟穴青蟹 Se-GPx: AEN ), Penaeus monodon( 斑节对虾 GPx: predicted amino acid sequence from GQ , Se-GPx: ALM ), Homo sapiens( 人 GPx1: NP_ , GPx2: NP_ , GPx3: NP_ , GPx4: NP_ ), Mus musculus( 小鼠 GPx1: NP_ , GPx2: AAD , GPx3: NP_ , GPx4: NP_ ), Bos taurus( 牛 GPx1: NP_ , GPx2: NP_ , GPx3: AAA , GPx4: NP_ ), Drosophila melanogaster( 果蝇 GPx4: AAF ), Cristaria plicata( 褶纹冠蚌 GPx: ADL ), Danio rerio( 斑马鱼 GPx1: NP_ , GPx2: XP_ , GPx4: NP_ ), 本研究斑节对虾 Se-GPx 用黑色三角形标明结果显示其在各组织中均有表达, 在肝胰腺中表达量最高, 结果推测斑节对虾不同亚型的 GPxs 具有组织特异性表达目前对于 GPxs 的研究在人类哺乳动物及植物中较为深入, 解析了其在机体内的功能结构与作用机制, 脊椎动物中 GPxs 家族不同亚型具有组织特异性表达有研究表明 GPx3 主要在山羊的肾脏中表达, 其次是心脏肝胰腺和睾丸 [14], 而斑节对虾 Se-GPx 的组织表达结果显示, 其在各组织均有表达, 但在斑节对虾肝胰腺中表达量最高, 其次为卵巢, 与上述研究结果相似, 该基因除了抗氧化能力外还可能参与斑节对虾卵巢组织的发育而其在卵巢发育各期表达结果显示, 随着卵巢成熟,Pm Se-GPx 表达量呈上升趋势刀额新对虾 GPx 在卵巢发育过程中的表达量也是随着卵巢的成熟先上升后下降 [15], 与本实验结果相符结果推测可能是因为在卵巢的快速发育时期会产生大量的代谢产物需要进行清理, 因此 Se-GPx 表达量上升, 以保护卵巢免受氧化伤害 Cu 2+ 胁迫后 Pm Se-GPx 的表达量明显被抑制, 在 48 h 左右的明显上调可能是因为机体在 48 h 左右对外界毒性产生的适应性表现, 因此出现回升, 但由于毒性较强, 细胞结构受到破坏, 所

7 1670 水产学报 40 卷图 5 Se-GPx多重序列比对黑色阴影为相同序列箭头所指位置表示催化四联体(硒代半胱氨酸U/X 谷氨酰胺Q 色氨酸W和天冬酰胺N) Fig. 5 Multiple alignment of the Se-GPx Black shadows indicate the same sequences; the arrows indicate the sites of catalysis of couplet of four(selenocysteine U/X, glutamine Q, tryptophan W and asparagine N) 图6 斑节对虾 Se-GPx基因在各组织中的表达量 H 心脏 TN 胸神经 O 卵巢 T 精巢 L:淋巴器官 HE:肝胰腺 M:肌肉 B:脑 G 鳃相同字母表示差异性不显著(P>0.05) 不同字母表示差异性显著(P<0.05) Fig. 6 Distribution of Se-GPx gene expression in different tissues of P. monodon H heart, TN thoracic nerve, O ovary, T testis, L: lymphoid 图7 斑节对虾 Se-GPx基因在卵巢发育各期的表达量相同字母表示差异性不显著(P>0.05) 不同字母表示差异性显著 (P<0.05) Fig. 7 Distribution of Pm Se-GPx gene expression in organs, HE: hepatopancreas, M: muscle, B: brain, G gill. The same ovary developmental stages of P. monodon letter indicates no significant difference (P> 0.05), different letters mean The same letter indicates no significant difference (P>0.05), different significant difference (P<0.05) letters mean significant difference (P<0.05)

8 11 期唐蕾, 等 : 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析 1671 动物的 GPxs 家族差异较大, 因此还需要进一步的研究工作以验证其功能图 8 斑节对虾 Se-GPx 基因在 CuSO 4 胁迫后各时间的表达量相同字母表示差异性不显著 (P>0.05), 不同字母表示差异性显著 (P<0.05) Fig. 8 Distribution of Se-GPx gene expression in stress of CuSO 4 in P. monodon The same letter indicates no significant difference (P>0.05), different letters mean significant difference (P<0.05) 图 9 斑节对虾 Se-GPx 基因在 ph9 胁迫的表达量相同字母表示差异性不显著 (P>0.05), 不同字母表示差异性显著 (P>0.05) Fig. 9 Distribution of Se-GPx gene expression in stress in ph 9 in P. monodon The same letter indicates no significant difference (P>0.05), different letters mean significant difference (P>0.05) 以 Pm Se-GPx 的表达量随着时间延长又呈现被抑制的趋势 ph9 胁迫条件下斑节对虾 Se-GPx 表达量的结果显示, 表达量总趋势呈现明显的抑制, 在 24 h 左右小幅度回升, 然后继续受到抑制, 但是在 96 h 时有明显上调, 结果可推测, 碱性胁迫 [16] 可能诱导 Se-GPx 的表达, 结果与 Wang 等研究得到酸碱性均可诱导凡纳滨对虾 GPx3 基因表达上升的结果一致由以上结果我们可以推测斑节对虾的 Se-GPx 基因可能参与机体的胁迫应激反应 GPxs 家族成员在哺乳动物中的研究已相当透彻, 但在水产动物中研究还较为简单, 与哺乳参考文献 : [ 1 ] Epp O, Ladenstein R, Wendel A. The refined structure of the selenoenzyme glutathione peroxidase at 0.2-nm resolution[j]. European Journal of Biochemistry, 1983, 133(1): [ 2 ] Liu C H, Tseng M C, Cheng W. Identification and cloning of the antioxidant enzyme, glutathione peroxidase, of white shrimp, Litopenaeus vannamei, and its expression following Vibrio alginolyticus infection[j]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 23(1): [ 3 ] Yeh S P, Liu K F, Chiu S T, et al. Identification and cloning of a selenium dependent glutathione peroxidase from giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii[j]. Fish & Shellfish Immunology, 2009, 27(2): [ 4 ] Liu K F, Yeh M S, Kou G H, et al. Identification and cloning of a selenium-dependent glutathione peroxidase from tiger shrimp, Penaeus monodon, and its transcription following pathogen infection and related to the molt stages[j]. Developmental & Comparative Immunology, 2010, 34(9): [ 5 ] 王雪参, 王文锋, 刘方, 等. 日本沼虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶全长克隆及表达分析 [J]. 水生生物学报, 2012, 36(6): Wang X S, Wang W F, Liu F, et al. Full-length cdna cloning and expression analysis of selenium dependent glutathione peroxidase from Macrobrachium nipponense[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(6): (in Chinese). [ 6 ] 刘春云, 傅明骏, 张子平, 等. 拟穴青蟹 PHGPx 基因的克隆及其表达分析 [J]. 水产学报, 2015, 39(2): Liu C Y, Fu M J, Zhang Z P, et al. Molecular cloning and expression analysis of Sp-PHGPx in Scylla paramamosain[j]. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(2): (in Chinese). [ 7 ] 张晨捷, 张艳亮, 高权新, 等. 低盐胁迫对黄姑鱼幼鱼肝脏抗氧化功能的影响 [J]. 南方水产科学, 2015, 11(4): Zhang C J, Zhang Y L, Gao Q X, et al. Effect of low salinity stress on antioxidant function in liver of juvenile Nibea albiflora[j]. South China Fisheries Science, 2015, 11(4): (in Chinese) [ 8 ] Wang W N, Wang Y, Wang A L. Effect of supplemental L-ascorbyl-2-polyphosphate (APP) in enriched live food on the immune response of Penaeus vannamei exposed

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10 11 期唐蕾, 等 : 斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析 1673 Full-length cdna cloning and expression analysis of selenium-dependent glutathione peroxidase from Penaeus monodon TANG Lei 1,2, FU Mingjun 1,3, ZHAO Chao 1,3, QIU Lihua 1, LIU Wensheng 2, JIANG Shigui 1* (1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation &Utilization, Ministry of Agriculture; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou , China; 2. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou , China; 3. Tropical Aquaculture Research and Development Center of South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Sanya , China) Abstract: Selenium-dependent glutathione peroxidase(denoted as Se-GPx)plays an important role in the enzymatic antioxidant defense system. It clears the reactive oxygen species (ROS) to avoid the cellular damage. In order to study the function of Se-GPx in immune system and the ovarian development of Penaeus monodon, the full-length cdna sequence of Se-GPx from black tiger shrimps (denoted as Pm Se-GPx) was obtained by high-throughput transcriptome sequencing and RACE. The full-length cdna of Pm Se-GPx is 959 bp, including an open reading frame (ORF) of 639 bp encoding a polypeptide of 212 amino acids, a 5'UTR of 10 bp and a 3'UTR of 310 bp containing a conserved selenocysteine insertion sequence (SECIS) element. The molecular mass of the deduced amino acid (aa) sequence was kda with an estimated pi of Blast and phylogenetic analyses suggest that Pm Se-GPx is a new member of the shrimp GPxs family. The tertiary structure of Pm Se-GPx protein presents like a bag and there is a catalysis site, which contains couplet of four conservative residues (cysteine C/selenocysteine U, glutamine Q, tryptophan W and asparagine N). Pm Se-GPx mrna expression was detected in nine tissues by real-time PCR. Pm Se-GPx mrna expressed was the highest in the hepatopancreas and moderate in the ovary. The result showed that Pm Se-GPx was expression mainly in hepatopancreas which plays an important role in detoxification. At different stages of ovary development, Pm Se-GPx was expressed highly at StageⅢ and Stage V, which indicated a large number of ROS may be produced during these development stages. Pm Se-GPx may protect the ovary from the oxidization damage. Under the stress of Cu 2+, the expression of Pm Se-GPx showed a trend of decline, but recovered at 48 h, and then decreased. The result showed that the stress of Cu 2+ may inhibit the expression of Pm Se-GPx. Under the stress of ph 9, expression trend of Pm Se-GPx first declined, but recovered at 24 h, then rose significantly at the 96 h. The result showed that neutral environment may inhibit the expression of Pm Se-GPx but aqueous alkaline medium may promote it. Presumably, Se-GPx plays an important role during the ovarian development and immune regulation of P. monodon. Our study provides a basis for further research in reproduction and immunology of P. monodon. Key words: Penaeus monodon; Se-GPx; ovarian development; stress of Cu 2+ Corresponding author: JIANG Shigui. jiangsg@scsfri.ac.cn Funding projects: China Agriculture Research System (CARS-47); Guangdong Province Project of China (2014B ); Hainan Applied Technology Research and Development and Demonstration Projects(ZDXM ); Development of Biology lndustry in Shenzhen (NYSW )

2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, (

2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, ( 12 2 2 0 1 6 4 South China Fisheries Science Vol. 12, No. 2 Apr., 2016 doi: 10. 3969/ j. issn. 2095-0780. 2016. 02. 016,,,, (,,, 510300) : ( Pinctada maxima),,,, 54. 55%, 0 0. 25 m - 2, 0 70. 31 gm - 2,