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1 第 卷第 期!" 年 月 # 水 # 产 # 学 # 报!!" 文章编号! $ %!"!" $!%! $! "! &' # $!!!""'" 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析 刘春云! # 傅明骏 # 张子平! # 邹志华! # 贾锡伟!! # 王艺磊! 集美大学水产学院 农业部东海海水健康养殖重点实验室 福建厦门 # %!! 中国水产科学研究院南海水产研究所 广东广州 #"! 摘要 为了探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- $ 1$/ 在拟穴青蟹免疫防御反应和精巢发育中的作用 实验从拟穴青蟹转录组数据库中筛选出 基因的 序列 利用 % 技术克隆得到该基因的全长 *" 命名为 通过相关生物信息学软件对该序列进行分析 运用实时荧光定量技术对 & 在成熟雌雄拟穴青蟹各组织 性腺不同发育时期以及 和脂多糖 $ 应激下鳃和肝胰腺组织中的表达情况进行分析 结果发现 基因的 *" 全长为! '!+ 编码! 个氨基酸 同源性分析和系统进化树分析表明 +%$ 1$/ 与其他物种的 $ 1$/ 1$/' 亲缘关系较近 实时定量 $ 结果显示 在成熟拟穴青蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达 其中精巢的表达量最高 在性腺不同发育阶段 在卵巢发育过程中的表达量差异不显著 而在精巢发育过程中 其表达量在精子细胞期 期 显著高于精母细胞期! 期 和成熟精子期 期 同时也显著高于卵巢发育各时期的表达量 在 $ 应激下 鳃和肝胰腺中 的表达量分别在 % 和!, 显著上调 应激下 鳃中的表达量在, 显著升高 肝胰腺中的表达量在被检测的各时相中无显著差异 研究表明 +%$ 1$/ 可能在免疫防御反应以及精巢的发育和成熟等过程中发挥着重要作用 关键词 拟穴青蟹 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 $ 1$/ 基因克隆 表达 性腺发育中图分类号 & " % ######## 文献标志码 # # 谷胱甘肽过氧化物酶 (0'0, +. / )'-1$/ 是一种重要的体内过氧化物分解酶 能以谷胱甘肽 1 或硫氧还蛋白./ 为电子供体 催化还原过氧化氢 和有机氢! 过氧化物等活性分子为水和相应的醇类 $ 在哺乳动物中 目前已发现 种 1$/ 根据其催化位点是硒代半胱氨酸 * 还是半胱氨酸 - 可分为硒依赖性 1$/ 1$/!%' 和人类的 1$/% 和硒非依赖性 1$/ 1$/"% 人类 1$/% 除外 同时根据其一级结构 组织分布和结合底物的特异性等又可分为典型的 1$/ 1$/! 肠胃型 1$/ 1$/ 血浆型 1$/ 1$/ 磷脂型 1$/ $ 1$/ #1$/' 附睾型 1$/ 1$/" 和嗅觉型 1$/ 1$/% 而 1$/& 和 1$/ 由于是新近发现 的 其功能和分布尚不明确 ' $% 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 $ 1$/ #1$/' 是 1$/ 家族中独特且重要的成员之一! 年 &.- 等首次从猪的肝脏中发现该酶 与其他 1$/ 家族成员相比 $ 1$/ 并不是通常的四聚体结构 而是单体结构 它能特异地还原磷脂氢过氧化物 从而保护卵磷脂脂质体和生物膜免受氧化损伤 随后该酶在猪的心脏和脑 老鼠的精巢和肝脏以及人的胎盘等组织中也被成功分离纯化 $ 1$/ 被认为是一种硒酶 含有硒代半胱氨酸 位于活性位点 通过对小鼠 基因 *" 的克隆 在该序列中发现由终止密码子 1 编码的硒代半胱氨酸 且位于活性位点 随后该基因相继在山羊 鲤 收稿日期!'%%'### 修回日期!'%! %!& 资助项目 国家自然科学基金! &!'&%% 集美大学创新团队基金!! 通信作者 王艺磊 %&' ' &()(*

2 ###!% 水 # 产 # 学 # 报 卷! 果蝇! " #$" % &$!! 微小牛蜱 ' " # "! 和盐芥 $" % $" " "$! 等中被成功克隆和分析 研究表明 $ 1$/ 广泛分布于生物体的各组织中 且在不同组织中的表达情况差异较大 可能!' 与其发挥的不同功能相关 等的研究发现 在大鼠的睾丸内 $ 1$/ 的活性最高 显著高!" 于肝脏和心脏等组织, 等发现 山羊 $ 1$/ 在精巢中表达量最高 其次是心脏和脑!% 1'. ' 等发现男性不育与精子中 $ 1$/ 的表!& 达水平有关 *,. 等研究发现 $ 1$/! 特异地表达于脑中的神经细胞 (' 等在硒化钠培养的兔大动脉平滑肌细胞中发现 大量表达的 $ 1$/ 可抑制由亚油酸过氧化导致的细胞凋亡 以上研究结果显示 $ 1$/ 可能在精巢的发育 神经系统的发育和细胞凋亡等过程中发挥一定的作用 目前关于 $ 1$/ 的研究主要集中在脊椎动物 如哺乳动物 中 而在无脊椎动物 尤其是甲壳动物中的研究相对较少 甲壳动物中现已被报道的 % 1$/- 有 凡纳滨对虾 &$$ #$! 中国明对虾 $$ $$$ 罗氏沼虾 # $ $ %! 斑节对虾 $$ # ( 刀额新对虾 $&$$ $ 和拟穴青蟹 " ## ' 等 而关于 $ 1$/ 的研究仅发现在丰年虫 ) &$# * 和海水鱼虱 $$ & $"# 中 同时 关于甲壳动物中 1$/ 家族的分类和系统分析仍不完善 拟穴青蟹隶属于节肢动物门.0,. + )' 甲壳纲.(-0'*' 是我国东南沿海重 " 要的经济养殖蟹类 $% 有关拟穴青蟹 $ 1$/ 在免疫防御反应和性腺发育中的研究尚未有报道 本实验根据已有的拟穴青蟹转录组数据库 筛选出 基因的 序列 通过 % 等分子生物学方法首次克隆获得该基因的 *" 全长 并利用生物信息学的方法对其结构和功能进行预测分析 命名为 同时 对其在拟穴青蟹雌雄各组织 性腺不同发育时期的表达情况以及脂多糖 $ 和 应激下鳃和肝胰腺组织中的表达变化进行分析 旨在为研究 $ 1$/ 在拟穴青蟹的免疫防御机制和性腺发生过程中的作用等提供理论依据 也为研究甲壳 动物 1$/ 家族的进化过程和分类积累重要资料!# 材料与方法 实验材料 实验动物 ## 拟穴青蟹购自漳浦某青蟹养殖场 解剖前对其体长 体宽 体质量和性腺重进行测量 其中雌蟹体质量为!! '% 不等 雄蟹体质量为 % " 不等 性腺不同发育阶段的 & 分期参照本实验室常规方法进行 $ 即根据性腺的外部形态 颜色 性腺指数 ') %- &'0 * ) /1 以及组织切片等进行分期 卵巢分为 " 个时期 增殖期! 期 卵黄生成前期 期 卵黄生成早期 期 卵黄生成中期 ' 期 和卵黄生成晚期 " 期 精巢分为 个时期 精母细胞期! 期 精子细胞期 期 和成熟精子期 期 不同发育阶段的雌雄青蟹各取 " 只 对于成熟个体除分别取卵巢和精巢外 另外取肝胰腺 鳃 肌肉 眼柄 胸神经节 脑 胃及肠等组织 立即放入液氮中速冻后置 $ 保存备用 血淋巴先置于含抗凝剂的离心管中 离心后去上清保留血细胞 $ 保存备用 $ 和 应激实验参照本实验室 ( ' 等的方法进行 实验蟹体质量为 " 实验组为用改良的蟹生理盐水 稀释的 $ " & # 和! # 分别注射于青蟹第五步足基部 对照组为注射等量 的青蟹 空白对照组为未注射的健康青蟹 注射后分别于 %! 和 ', 仅 $ 实验组 取鳃和肝胰腺组织 ' 保存于 '0. 中 用于 的提取 主要试剂 ## 总 提取试剂. 购自美国 3 0. 公司 逆转录 $ 试剂盒购自,.& 公司 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物公司 + "!% 载体连接试剂盒购自 '4'' 公司 感受态 " " 菌株为实验室保种 '0 & $ '-0. / 购自 $. & ' 公司 引物 ## 根据本课题组青蟹转录组测序 数据库 筛选获得 基因的部分 *" 序列 使用 $. &." 软件分别设计 特异性引物和定量引物 本实验所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成 表! 实验方法 总 的提取和第一条 *" 链的合成 #

3 期刘春云 等 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析 ##!% 7 用. 试剂提取拟穴青蟹成熟各组织以及不同发育时期的精巢和卵巢的总 & 用分光光度计测定总 浓度和 " % #" 值 同时用!" 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性 经检测 合格后 可用于接下来模板链的合成 "8 8% 模板和定量模板的合成按照逆转录试剂盒的具体操作说明进行 模板合成后 用内参引物!.%# 检测其制备效果 表 本实验所用的主要引物及其序列! 引物名称 +. &. '& 8% " "8% " $ $ % $ %-,.0! %! % $ 1$/% 8 (0. $ 1$/% 8. $ 1$/%"8 (0. $ 1$/%"8. $ 1$/% $ 1$/%!.%!.% 引物序列 "8% 8 +. &.-( * " # # 8% 和 "8% # # 根据 8% 和 "8% *" 第一条链为模板 利用 特异引物 1 $! 和 1 $ 和通用引物 $ 和 $ 进行两轮 $ 退火温度根据 引物而定 注 本实验中 8% 和 "8% 的退火温度一样 反应条件也一样 第一轮 $ 扩增反应条件 " & " -% -& -! 个循环 0 (*,)! " -" -& -" 个循环 &! &!% " & 第二轮巢式 $ 以第一轮产物稀释 " 倍为模板 扩增反应条件 " & " -%" -! & " 个循环 &! &!% " & 基因 *" 全长的获得 ## 将 8% 和 "8% 扩增的目的产物经电泳检测 割胶回收后 连接入 + "!% 载体中 送往上海生工生物工程公司测序 分别对 个不同个体进行测序 最终确定该片段 将已知的 序列和测序正确的 "8% 和 8% 获得的片段进行拼接后 进而获得该基因的全长 *" 序列 同时设计, ') 0 0 引物 验证其开放阅读框 +.') ;.'& 的正确性 实时荧光定量 $ ## 使用的定量模板是用随机引物逆转录合成的 同时以!. 作为内参基因 ' 内参引物序列见表! 每个样品做 " 个个体重复 的反应体系! 561. '0 & $ '-0. /! & # 的 $ 1$/% 和 $ 1$/% 表! 各 " *" 模板 反应条件为 "! & '" 个循环 "!" - %! & 先检测该基因的扩增曲线和熔解曲线 并对定量产物进行割胶测序 以验证其是否为基因特异产物 然后再进行定量实验 根据罗氏 ' 仪器分析得到的 0 值计算各个样品的 值 即为 $ 0 其中 0 目的基因的 0 值 $ 对应的内参基因的 0 值 0 每个样品的 0 值 $ 基准样品的 0 值 基因的表达水平由 平均值 标准误的平均值 & ' 来表示 利用 $ 软件进行单因素方差分析 % ' 或 &% 检验 &% 0-0 分析 同时用 *. - ;0; *! 对统计结果进行作图分析 显著性差异表示为 " 生物信息学分析 # # 序列的拼接采用 $, 0+ ) ('+.'! ;.#- ;0 '.#*'+ 进行 开放阅读框的确定采用 )., 0+

4 ###!%' 水 # 产 # 学 # 报 卷 *! &, 3 #.;#.;,0& 进行 之后采用以下不同的在线分析软件对 及其推导的氨基酸序列进行一系列的生物信息学分析 蛋白等电点和分子量的预测 &+(0 $# 0, 0+!/+'-. #* &+(0(+ # 糖基化位点和磷酸化位点的预测 01 *!.3., 0+ *!- )0( ) #-.3 *-# 01 *# 和 0$, -, 0+ )0( ) #-.3 *-# 0$, -# 信号肽预测 '$'!.3., 0+ *!- )0( ) #-.3 *-# '$# 蛋白功能结构域的预测 0.$. *' - ;0 '., 0+! '*( # 0.$. *' # 三维结构的构建和分析 % ", & ) /+'-. # 和 $ & 3. 软件 序列的同源性比对 使用 6 ) 0 软件进行比对分析 系统进化树的构建 使用 1" 软件中的邻接法,!.% # 结果与分析 基因的全长克隆和序列分析通过 技术克隆获得 的全长 *" 序列 1 6' 登录号 4 &"! 图! 图 基因的 "#$% 全长及其推导的氨基酸序列起始密码子 '0 和终止密码子 0'' 用加粗标出 加尾信号 用双波浪线标出 个糖基化位点 '" 5 '! 1 "! " 和! 4!! 用灰色阴影标出 ' 个丝氨酸磷酸化位点 %!!!!'"! 个苏氨酸磷酸化位点!% 个酪氨酸磷酸化位点 5 " 5!% 均用圆圈标出 保守的催化四联体 &'!&! 用方框标出 基序 & " 414 ' %' $ &! 和!& 4! 分别用双下划线 单下划线和单波浪线标出 & '"#$% " " ", 0 '0 * ) '0 ' ) 0, -0 + * ) 0'' '. '*,'.'*0. )! ), + ') '0 - '-( * -! ) ' ) ) (! '3, 0,. * - '0-0-'..' (.-. +, -+,. '0-0 +, -+,. '0-0 ;0,. ' ) , -+,. '0-0 '. '&'. )! *.*, '& '* ).- )('- &'!&! 3 3 ) 0, ; /'0 ;- (& '. &'. )!! /, & 0 ; ; & " 414 ' %' $ &! ' )!& 4! '. ) *'0) ) (! ( ). ) - ( ). ) ' ) '3

5 1期 刘春云"等!拟穴青蟹!"#!$基因的克隆及其表达分析 该序 列 包 括 3 3C 的 4V 非 编 码 区 = 0 A 守性也很高# 图 /$ ( > /="#J$$ "4/ 3C 的 开 放 阅 读 框 和 /3 3C 的 /V #J$# 包 含 60 /;& 尾 $ ( /V 7 #J$含 有 典 型 的 加 尾信号 &&J&&&( 该 4%& 序 列 可 编 码 3; 个 氨基酸"预测的蛋白分子质量约为 11 / O@"等电 点约为 8170( 该 蛋白 的第 /0 个 氨基酸为硒 代半 胱氨酸# * $ "由终止密码 子# JI&$ 编码"其 与 氨 基酸残基# 8 L) 318 Z) 31; %$ 构 成 催 化 四 联 体"参 与 硒的固定( * >= 0 6分析未发现有信号肽%JK+KK 分析 发现其无跨膜区( % 6D/11 * Q 预 测 显 示" 其含有 个丝氨酸磷酸化位点# *7 "*33 "*13 "*34 $ " 3 个 苏 氨 酸 磷 酸 化 位 点 # J37 $ 和 1 个 酪 氨 酸 磷 酸 化位点 # S14 " S370 $ % % %I0 ;31 * Q 推 测 其 含 有 / 个 糖 基 化 位 点" 分 别 为 # 4 %SJ,; $ ) 图 $#拟穴青蟹?@A? 的空间结构模拟 # 31 %I*434 $ 和 # 31; %(JR3/3 $ %* =6 / 分 析 显 螺 旋 和 $7 折 叠% 活 性 位 点 * # /0 #$ 和 "和 $分 别 代 表 "7 示"6+I6G 蛋 白 的 第 3 <34 位 氨 基 酸 为 磷 脂 氢 I0 =# 8 L$ "J C# 318 Z$ "& =# 31; %$ 位于 袋 状 蛋 白 的 表 面"通 过 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 的 功 能 域" 其 基 序 氢键相连"参与硒# * $ 的固定 18 1 # 4$.-)..%.&*R#IRJ $ 为 6+I6G 活 性 位 7 8+ " $#%()-. ) 1+ 4 ) 1 (. ) ) > 1+ *),/ +,&D/ -&4 ) / )<=->?@A? 83 点基序" # '&(6-%L( $ 为 标 签 序 列"其 中 硒 代 半胱氨酸# #/0 $ 在中心活性位点上# 图 3$ ( $" $#=->?@A? 的空间结构模拟 采用 *Z) **7 K"4,'在 线 同 源 建 模 软 件"将 *C7 6+I6G 的氨 基 酸 序 列 提 交 至 服 务 器" 系 统 会 =A $ =A 7 D 0 =A 37 D " C Q 0 ;1JD Q " # /0 #$ A@ " /> D < D 8 =# 8 L$ " 0 =/ ; = ;C /CD =# 318 Z$ =A & C > =# 31; %$ " 0 / A = C/ O " =A 3/=A A < D D;A /> =" <D D /= D C / Y =Q/0 Q A = DY G /= /Y 0 自动将 * # #$ 识 别 为 -; # -$ # 注!以 下 6+I6G 三维结 构 的 第 /0 位 氨 基 酸 是 -; $ "经 同 源 分 析 $" #=->?@A? 系统进化树的分析 发现 其 蛋 白 结 构 与 人 类 的 I6G 相 似 度 最 高" 达 根 据 %-T)上 已 注 册 的 部 分 物 种 不 同 亚 型 到 717/P( 以 人 类 I6G 的 三 维 结 构 作 为 模 板 的 I6G # 主 要 为 I6G3 7 I6G 和 甲 壳 动 物 中 已 报 & 64T /A!1/3 1 31&# 3144 [$ ' "用 三 维 结 构 查 道 的 I6G$ 的 氨 基 酸 序 列 " 采 用 K,I& 4 1 软 看软件 6;K"'"对 *C7 6+I6G 的蛋 白 序 列 进 行 空 件 "以 邻 接 法 构 建 系 统 发 育 树 " T// C 值为 间三维结构的 模 拟 # 图 1 $ ( 结 果 显 示"该 蛋 白 由 3 ( 4 个 "螺旋和 8 个 $折 叠 片 组 成( 其 中 * # #$ 结果显示"不同物种 的 I6G37 I6G 明显地 各 位于 $/ 和 "/ 之 间 的 蛋 白 表 面"I0 =# L$ 位 于 $ 自聚 为 一 支% *C7 6+I6G 与 其 他 物 种 的 6+I6G 和 " 之间的 蛋 白 表 面"J C # Z$ 和 & = # %$ 位 于 # I6G$ 聚为一大支"在 6+I6G 这一大支中"拟穴 "4 和 $7 之间 的 蛋 白 表 面" 个 氨 基 酸 残 基 通 过 青蟹和丰年虫单独聚为一小支"果蝇)斑马鱼以及 氢键相连"参与硒的固定( 其他哺乳动物分别聚为一小支%除了丰年虫"虾蟹 $" C#=->?@A? 氨基酸序列的同源性分析 中已报道的 I6G 与 6+I6G# I6G$ 的亲缘关系均 将拟穴青蟹的 6+I6G 与 其 他 物 种 的 6+I6G 较远# 图 $ ( 凡纳滨对虾)拟穴青蟹)罗氏沼虾和 # I6G$ 进行 多 重 比 对 后 发 现" *C7 6+I6G 具 有 构 日 本 沼 虾 的 I6G 聚 为 一 小 支" 与 哺 乳 动 物 中 成催化四联体 的 个 保 守 氨 基 酸 # * 5 -; ) J C) I6G3 和 I6G1 亲 缘 关 系 相 对 较 近( 刀 额 新 对 虾 I0 = 和 & = $ " 且 在 I6G 的 催 化 活 性 区 和中华绒螯蟹 分 别 聚 为 一 小 支"且 与 其 他 物 种 相 # %.&*R-I'J$ "标志 性 基 序 # '&(6-%L($ 以 及 距较远( 6+I6G 特有 的 序 列 & RZ%(# J5 \$ R('' 区 域 保!" " #!!$$$%& ' ( )* +, -%'.

6 ###!%% 水 # 产 # 学 # 报 卷 图 + 拟穴青蟹和其他物种 () * 氨基酸序列的多重比对 所用的氨基酸序列的物种名和相应的登录号分别为 拟穴青蟹 4 &"! 果蝇 $(& &! 人类 $(! ' &! 斑马鱼 $(! "'! 野猪 $("&! 小家鼠 6 %"!!! 黄牛 $(&&&!"! 褐家鼠 $( " %! 红光熊峰 $'' &!! 非洲爪蟾 $(!!%"!"! 丰年虫 65%&'! 微小扇头蜱 6% "! ' 个保守氨基酸 *# 和 - 用黑色三角形标出 1$/ 的催化活性区 4 1 标志性基序 $ 以及 $ 1$/ 特有的序列 4 # 4 区域用灰色方框标出 & '+.,,, ' () * " "/ ", + * -' ) 1 6' **-- (&!.- ;'& '* ) -( *-'. -0) '-; - " ## 4 &"!! " #$" % &$ $(& &! # $ $(! ' &!! $ $(! "'! * $("&! # " 6 %"!!! ' & $(&&&!"! + & $% $( " %! ' # % & $'' &!!,$ "$ $(!!%"!"! ) &$# *65%&'! + $ " # " 6% "!, ; (.* -.3 ) '& '* ).- )( - *# -.+1 ' ) - '. &'. )!!'* 0. ' -, '*0 3 %- 0 & 0 ; 4 1 0, - '0(. & 0 ; $ ' ) 0, -+ * '-( * 4 # 4 ;$ 1$/ '. ) *'0)!.'.*0' -

7 期刘春云 等 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析 ##!%& 甲壳动物 1$/- 用下划线表示 拟穴青蟹 $ 1$/ 用三角形标出 图 - 不同物种 ) * 氨基酸序列的系统进化树 所用的氨基酸序列的物种名和相应的登录号分别为凡纳滨对虾 1$/5'!''!! 中华绒螯蟹 1$/ '! "! 拟穴青蟹 1$/ %''! 罗氏沼虾 1$/ % '! 日本沼虾 1$/ "!&%%!! 刀额新对虾 1$/ 6' %! 人类 1$/! & %" 褐家鼠 1$/!$(!! '" 小家鼠 1$/!$(! % 野猪 1$/!$( %%! 黄牛 1$/!$(&&%"!! 斑马鱼 1$/!$(! & 人类 1$/ 褐家鼠 1$/$( %" 小家鼠 1$/$(! % 野猪 1$/ 6%! 黑猩猩 1$/$(!! % %! 人类 1$/ $( &" 褐家鼠 1$/ $( &!& 野猪 1$/ $(!! %&! 黄牛 1$/ $(&&%"! 斑马鱼 1$/ $(!!! &! 其余物种名和登录号见图 ' & '-!, ' " ) * " " " 1$/- ;*.(-0'*' -'. &'. ) 0, ( ). - ## &'. )! 0. ', + * -' ) 1 6' **-- (&!.- ;'& '* ) -( *-'. -0) '-; - &$$ #$ 1$/5'!''!!. $ $ 1$/ '! "! " ## 1$/ %''! # $ $ % 1$/ % '! # $ $1$/ "!&%%!! $&$$ $ 1$/ 6' %! # $ 1$/! & %" + & $% 1$/!$(!! '" # " 1$/!$(! % * 1$/!$( %%! ' & 1$/!$(&&%"!!! $ 1$/!$(! & # $ 1$/ + & $% 1$/$( %" # " 1$/ $(! % * 1$/6%! & %"(&$ 1$/$(!! % %! # $ 1$/ $( &" + & $% 1$/ $( &!& * 1$/ $(!! %&! ' & 1$/ $( &&%"!! $ 1$/ $(!!! &!.0, + * -' ) 1 6' **-- (&!.- ; 0,.-* -(0 ' 0 基因在雌雄各组织中的表达情况 以!. 为内参基因 实时定量 $ 结 果显示 基因在所检测的雌雄拟穴青蟹各组织中均有不同程度的表达 图 " 其中精

8 ###!% 水 # 产 # 学 # 报 卷 巢的表达量最高 且显著高于其他各组织 " 雌性的鳃 脑和心脏以及雄性的脑中均有较高水平的表达 在雌蟹中 鳃和心脏的表达量显 著高于雄蟹 " 而在雄蟹中 精巢的表达量显著高于雌蟹的卵巢 " 图 " 图 0 基因在雌雄各组织中的表达情况 1 性腺 卵巢和精巢 6 脑 胸神经节 血细胞. 心脏 1 鳃 肠 + 肝胰腺 眼柄 ( 肌肉 0 胃 柱上不同字母代表具有显著性差异 " & '0* ',, 1 ') 3'. ' ) !.' 0,.'* * ' ','& * , +'0 +' *.'- -0' ( &(-* 0-0 &'*,6'. 0, ) ; ) *'0-- ; *' 0) ;. *- " 1 基因在性腺不同发育时期的表达情况在卵巢不同发育阶段 的表达量相对较恒定且各时期之间无显著性差异 而在精巢不同发育阶段 的表达量呈先上升后下降的趋势 在 期 精子细胞期 的表达量最高 显著高于! 期 精母细胞期 和 期 成熟精子期 " 同时发现 在精巢发育的 期 精子细胞期 的表达量显著高于卵巢发育各时期的表达量 " 图 % 和 ( 应激下 基因在鳃和肝胰腺组织中的表达变化在 $ 诱导应激下 鳃中 基因在 %, 表达量显著升高 与对照组有显著性差异 " 之后表达量逐渐下调 接近正常水平 图 &%' 肝胰腺中该基因在!, 表达量显著升高且达到峰值 与对照组之间差异显著 " 之后开始下降 在 ', 时基本恢复到正常水平 图 &%! 在 诱导应激下 鳃中 基因在, 表达量明显上调 显著高于对照组 随后开始下调并趋于正常水平 图 &%* 而肝胰腺中该基因在被检测的各时相中 表达量均没有显著差异 图 &%) 图 1 基因在拟穴青蟹性腺发育各时期的表达情况! " 表示卵巢发育各时期! 增殖期 卵黄发生前期 卵黄发生早期 ' 卵黄发生中期 " 卵黄发生晚期! 表示精巢发育各时期! 精母细胞期 精子细胞期 成熟精子期柱上不同字母代表具有显著性差异 " & '1, *,, ' ' ',,! $" ) ;. 0-0' - ; 3'. ) 3 +& 0! $. ;.'0 $ $. &' ' * )' ".0 ' !% ) ;. 0-0' - ; ) 3 +& 0!, -+.&'0 * 0-0', -+.&'0 ) -0' 0, &'0(. -+.& -0' 6'. 0, ) ; ) *'0-- ; *' 0) ;. *- "

9 期刘春云 等 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析 ##!% 图 基因在 和 ( 应激下鳃和肝胰腺组织中的表达情况 表示与对照组有显著性差异 " & ', *,, ", ' ( ', " ) *'0-- ; *' 0) ;. * * &+'.) 0, * 0. " # 讨论 $ 1$/ 是目前发现的唯一能将细胞膜上的有机氢过氧化物还原成相应的醇类 从而保护生 $ 物膜免受氧化损伤的酶 根据转录位点的不同 $ 1$/ 有 种不同类型 分别为细胞质型 *1$/' 线粒体型 &1$/' 和精核型 - 1$/' ' 由于 $ 1$/ 催化底物的复杂性 使其在抗氧化 细胞凋亡和精子发生等过程中发挥着重要作用! 本实验从拟穴青蟹中成功克隆获得 的 *" 全长 可编码! 个氨基酸 分子量约为 ' ( 在该基因的第 "" "& 位含有通常编码终止密码子的 1 编码硒代半胱氨酸 * 对其 8% 预测显示 其不含硒插入性片段 这与哺乳动物中 1$/' 家族成员有所差异 在已研究过的大多数节肢动物和植物中 $ 1$/ 的活性位点为 - 为硒非依赖的 1$/ 但也有例外 如微小牛 蜱含有 * 和 结构! 丰年虫 65%&'! 只含有 * 但不含 结构 本研究结果与丰年虫 $ 1$/ 的结果相似 表明不同物种间 $ 1$/ 的组织分布 催化机理和功能等均有所差别! 生物信息学分析显示 该序列不含信号肽和跨膜结构 表明该蛋白不是分泌蛋白 可能分布在细胞质中 与某些大分子物质结合 发挥着一定的生物学作用 这与植物盐芥的结果相似! 预示 可能为细胞质型 1$/' *1$/' 多重比对结果显示 +%$ 1$ 具有 1$/ 家族典型的结构 如活性位点基序 # # 1 标签序列 # $ 和 $ 1$/ 特有的序列 4 # 4 其中硒代半胱氨酸 位于中心活性位点上 与保守的氨基酸残基 &'!&! 构成催化四联体 对硒的固定起着重要的作用 系统进化树分析表明 +%$ 1$ 与 1$/' $ 1$/ 聚为一支

10 ###!& 水 # 产 # 学 # 报 卷 且与丰年虫的亲缘关系最近 而与甲壳动物中其他已报道的 %1$/ 亲缘关系相对较远 这一结果预示 甲壳动物的 1$/ 家族可能具有不同于哺乳动物 1$/ 家族的进化过程 分类也有所不同 有待进一步深入研究 实时定量 $ 结果显示 基因在成熟拟穴青蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达 其中精巢的表达量最高 显著高于其他各组织 " 表明 基因的表达具有一定的组织特异性 该基因在精巢中的高表达与脊椎动物中已报道的人 ' " % 山羊以及小鼠的结果相一致 说明 +%$ 1$/ 在精巢中不仅具有抗氧化功能 而且对雄性生殖系统可能也发挥着重要作用 在精巢不同发育阶段 基因的表达量在精母细胞期! 期 表达量最低 之后表达量显著升高并在精子细胞期 期 达到峰值 在成熟精子期 期 开始降低 期显著高于其他各时期 " 这一结果与拟穴青蟹 $ 基因在精巢发育过程中的表达情况相一致 ' 原因可能是由于在精子发生过程中尤其是精子细胞期 期 细胞代谢旺盛 大量的代谢产物需要被清除 & 此时大量的 基因开始表达 以保证精子的正常发育和成熟 同时发现 在精巢发生中后期 期和 期 其表达量显著高于卵巢发育各阶段的表达量 这一现象也进一步说明 $ 1$/ 对精子的发生起着更为重要的作用 鳃组织是拟穴青蟹的氧交换中心 直接与外界环境接触 肝胰腺为拟穴青蟹重要的代谢和免疫器官 二者均被认为参与虾蟹类的免疫防御反应 在 $ 应激下 鳃组织中 基因的表达量在 %, 显著上调并达到最高 与对照组有显著性差异 在肝胰腺组织中其表达量在!, 达到峰值 且与对照组差异显著 这可能是由于机体受到病原体应激后 激活第一道免疫防线 导致呼吸爆发 产生过量的活性氧簇.'*0 3 / -+ * - 此时 % 基因的上调表达对清除体内过剩的 可能具有一定的作用 在 应激下 鳃组织在, 出现显著上调 肝胰腺组织的表达量在检测的时相内没有显著变 ' 化 ( 等在研究拟穴青蟹 $ 基因在 应激下的表达情况时发现 鳃组织在被检测的时相内 表达量没有显著性差异 肝胰腺组织的 表达量却在 和 %, 分别出现显著和极显著的上调 这一结果可能是因为在甲壳动物中 当机体受到外界应激后 不同亚型的 1$/ 在不同组织中发挥的效应可能有所不同 本实验首次从拟穴青蟹中克隆获得 基因的 *" 全长 通过生物信息学的分析 并结合其在成熟拟穴青蟹雌雄各组织 性腺不同发育时期的表达情况以及 $ 和 应激下的表达变化 初步显示其在拟穴青蟹的免疫防御反应和精巢发育等过程中发挥着重要的作用 同时也为不同物种间 1$/ 家族的进化研究和分类积累了一些重要资料 参考文献! #.0,(., (0'0, +. / )'-- ('. ' ) *('. ; * *- "&! $!'! " $! " #,' 5 ' 1 6 $&"6 ;.&'0 *- ' ' - - ; (0'0, +. / )'- +'.'- 0 * 0.&'0 ) -, - (. ' ;--! %' $ 章莹 蔡国斌 何立 等 寄生性吸虫谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析 中国人兽共患病学报! %' $ #6' 5 ' & $&" )('. 3 (0 ; (0'0, +. / )'- - '-- * '0 0, ) ;. 0! *, & *' ; 0,. * ) ) !.'0 ' &'- 6 3 (0 '. 6 & ' #6. (-%, '. 1(0'0, +. / )'-- 6 *, & *' 06 +, - *' *0'!! " $ " # ++ ' 6 - $&" 3 (0 '. ' ) -0.(*0(.' -,0-0 0, &(0 ;'*0) (0'0, +. / )'- 1+/ -(+.;'& 0 / )' 0- ) / '!!"! $!"!' % # ',,' 1 $&" ' ) ;( *0 '' ' - - ; (0'0, +. / )'-.) - '&+ *.' ; -, #" / -,, ; -, &&(! '%!" & $!"" & #.- '. ' 0 $&"$(. ; *'0 ;. & + 3. ;'+. 0, *, +. 0* & - ' )! & &!.' -;. & +. / )'0 3 ).')'0 ' ) /,! 0- (0'0, +. / )'- '* , -+,'0 ) *,, ). +. / ) - 6 *, & *' 0 6 +, - *' *0' 66 % + )- ' ) + ) 0'! -&! &!!& $!!

11 期刘春云 等 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析 ##!&! # 3. '..- &'0 * ' ) &&(*'& '-(.& 0- ;- (!' ) & &!.' %! ( ) +, -+, + )%, ). +. / ) (0'0, +. / )'- 0, )- &!' $! #, 1 (, ( $&"6 ;.&'0 - ' ' - - ;$ 1$/ '0 6 0*, 6( 0!!! % $!! 施力光 荀文娟 周汉林 等 山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析 生物技术通报!!! % $!!! #.& -. * ) 0 ; *'0 ; 0 +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- +/' - * && *'.+ &+'.'0 3 6 *, & -0. ' ) $, -%$'.0 / * $,'.&'*!"!!! $! %!!# " 6'-3 *,, + ) $&"$ --! ;( *0 ;0 -*0+, -+, + )%, ). +. / ) (0'0, +. / )'-- (. ' ; -*0 $, - '!! $!# -- %6' ( '..' )' &' $ *('.* ;'+, -+, + )%, ). +. / ) (0'0, +. / )'- ;. & 0, 0 * ' " # " *'. / ) )' -*06 *, & -0. ' ) *('.6 " "!! & $! &! # ', ( 5 1' $&" ' ) /+.-- ' ' - - ; (0'0, +. / )'- %,1$ % $" % $" " "$ (. ' ; $' 01 0 * - (.*-!! " $" 马亭亭 周宜君 高飞 等 盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因,1$ % 的克隆及表达分析 植物遗传资源学报!! " $"!'# 1 3-4, &+- 4 $&" 1(0'0, +. / )'- ' ) +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- '. ) ;. 0 '. ('0).'0-! ) 0'. - (& (. ' ; (0. 0!"!"%!' $!''%!"#, 1 ( 5( 6 $&" *,'.'*0. '0 ' ) /+.-- ' ' - - ; '0 +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- $ 1$/ 0. '0 ' (. ' ;6*' * *-! %'!%!%#1'. ' '. 3.'0 $&".' *'. 0 -(++& 0'0 *.'---+.& & 0 0 '-0, -+.& * & 0,.&' -+.& +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )' " "" $ %!!&# *,.6. (. 4<,. $&" (& ' )!.' ;( *0 +..*) ' - 6.' -'.*, 3 - ''"!%' $!&! # (',', 3 3 & 0 ;.'*0 3 / -+ * - '.- 0% )(*) ). ('0 ; +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'-,(&' + ).& ) *'.* &''! * -. ') *'6 ' ) ) * % %' $ &!# ( -, ) 0 ; *'0 ' ) * ; 0, ' 0 / )' 0 & (0'0, +. / )'- ;, 0 -,. &+ &$$ #$ ' ) 0- /+.-- ; 0 "% "& ;*0 -,, ; -, &&( &! ' $'" # (,' $&" - (&% ) + ) 0 (0'0, +. / )'- %1$/ ' ) 0 (0'0, %0.' -;.' ;. &, - -,. &+ $$ $$$ &+'.'0 3 6 *, & -0. ' ) $, -%$'.0 / * $,'.&'*!'' %! $%!#5, $ ( 4, ( $&") 0 ; *'0 ' ) * ; ' - (& ) + ) 0 (0'0, +. / )'- ;. & ' 0 ;.-, '0. +.' # $ $ % -,, ; -, &&( &!! $!! # ( 4 5, 4 ( 1 $&") 0 ; *'0 ' ) * ; ' - (&%) + ) 0 (0'0, +. / )'- ;. & 0.-,. &+$$ # ( ' ) 0-0.' -*. +0 ; +'0, ;*0 ' ).'0) 0 0, & 0-0' - " 3 +& 0'' ) &+'.'0 3 &&(! ' " $'' # (,( 4,'.'*0. '0 ;' 3'. % -+ * ; * (0'0, +. / )'- ;. & 0, -,. &+ $&$$ $ ' ) 0-. *.(-0'*'.+. )(*0 &+'.'0 3 6 *, & -0. ' ) $, -%$' *, & -0. ' ) *('. 6!!""! % $ '#( ( ( $&" (&%) + ) 0 (0'0, +. / )'- /+.-- )(. ') ) 3 +& 0' ) $ ' ) *,' " ## -,, ; -, &&(! " $"' "# 6$&" + * -* &+ - 0 (- " ;. & 0, * '-0 ;- (0, '-0, ' (. ' ; -,. - ;, ' &!! $! 林琪 李少菁 黎中宝 等 中国东南沿海青蟹属 " 的种类组成 水产学报 &

12 ###!& 水 # 产 # 学 # 报 卷!! $! %# (' (' 55 $&" ' ) ' ' - - ;%'*0 ;. & " ## (. ' ; '& '0(.' * *!"! &' $& 黄静茹 黄辉洋 叶海辉 等 拟穴青蟹 % 肌动蛋白基因的克隆与分析 厦门大学学报 自然科学版!"! &' $& &#"' 5 ' 4 ( $&" %! ;&() *.'! " ## '& !" % $% #1' ( ' $&" *('.* ' ) /+.-- ' ' - - ; 6 )(. ')' ) 3 +& 0 " ##, - (. ' ;! ' ' & $'!% 高洁 邹志华 贾锡伟 等 拟穴青蟹 6 的分子克隆及其在性腺发育过程中的表达 动物学杂志! ' ' & $'!% # 1( $&" *. ;+, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- - +' 0- (. ' ; -,(' * * ' ) *, '!!! $!' 李文君 谷硕 金岚 等 植物谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶基因的筛查 清华大学学报 自然科学版 '!!! $!' #.- & 4 -- $&""(';( *0 ; 0, $ 1$/ )(. -+.& &'0(.'0 * *! ""'! $! %!#0 & ' (.(0' $&") 0 ; *'0 ;' 3 +(0'0 3 %- * -0 * 0' +, -+, + ), ). +. / ) (0'0, +. / )'- $1$/ -- 0 ';.'3 '0 / )' '0) ;. & + ( -'0(.'0) ;'0 '* )-!.'-0 *' *.* - (. ' ;6*', & -0. '&' ' " $' " # ( 4, 5 $&" *('. *,'.'*0. '0 ; ' +, -+, + )%, ). +. / ) (0'0, +. / )'- ;. & 0,!(&!! ' # % & &+'.'0 3 6 *, & -0. ' ) $, -%$' *, & -0. ' ) *('. 6!!""! "' $%! # ( 4 ' 5 $&" *('.* *,'.'*0. '0 ' ) 0 --( ) -0.!(0 ; (0'0, +. / )'-! ' ) ' ;. & '+' - )% " 1 (. ' ; -,. * *- ;, '!!& ' $''& 刘振兴 柯浩 曹艳林 等 日本鳗鲡谷胱甘肽过氧化物酶! 和 ' 的克隆 分析和组织表达分布 中国水产科学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施力光 荀文娟 岳文斌 等 山羊 $ 1$/ 基因在不同组织中的表达特点及性腺中的定位 中国农业科学! '!& %" $ %"

13 期刘春云 等 拟穴青蟹 基因的克隆及其表达分析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