2 技术与方法 cultured in 3D collagen. It is possible that the 3D culture model of MRC-5 cells will contribute to cellular biology, cell morphology and vira

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1 :37:11 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2017, 39(3): DOI: /cjcb 三维胶原培养模型中 MRC-5 细胞的生长状态及病毒感染何兵陈国敏 * 曾毅 * ( 传染病预防控制国家重点实验室, 中国疾病预防中心病毒病预防控制所, 北京 ) 摘要该研究以鼠尾 I 型胶原为支架构建了人胚肺成纤维 (MRC-5) 细胞三维立体培养模型, 探索在此模型中常规培养液和 (platelet-derived growth factor) 培养液对 MRC-5 细胞生长状态的影响, 以及这两种培养液对细胞在胶原表面上生长状态的影响应用此模型初步观察了人巨噬细胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV) 的感染结果显示, 常规培养液和培养液均能使细胞相互交错, 形成多层的三维立体网状结构培养液有利于早期促进细胞呈树突状扩展, 常规培养液更有利于细胞在较长时间内维持多层立体的网状结构常规培养液可促进细胞在胶原表面聚集, 培养液则有利于细胞以单个细胞方式进行迁移三维胶原体系内生长的 MRC-5 细胞感染 HCMV 病毒后, 也能呈现明显的细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE) 由此提示, 鼠尾 I 型胶原与 MRC-5 细胞构成的三维培养模型, 有望进一步应用于细胞生物学形态学以及病毒感染的研究中关键词人胚肺成纤维细胞 ; 三维细胞培养模型 ; 胶原 ; 巨噬细胞病毒 Growth and Viral Infection of MRC-5 Cells in A Three-Dimensional Collagen Culture Model He Bing, Chen Guomin*, Zeng Yi* (State Key Laboratory of Infection Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing , China) Abstract In this study, human embryonic lung fibroblasts (MRC-5) were cultured in the three-dimensional (3D) culture model with rat tail tendon collagen type I as a scaffold. The effects of conventional culture media and (platelet-derived growth factor) media on the growth status of MRC-5 cells were investigated in 3D culture model. And the effects of the cellular growth status on the surface of 3D collagen matrices with two kinds of media were analyzed. The infection of HCMV (human cytomegalovirus) was observed in the 3D culture model. The results showed that conventional culture media and media promoted cells to overlap each other and formed a multilayer three-dimensional network structure. media promoted cells to protrude dendritic extensions in the early time. Conventional culture media helped cells to keep multilayer network structure for longer time. Furthermore, MRC-5 cells in conventional culture media contracted into clusters, whereas cells in media were observed to migrate as individual cells. HCMV could induce the cytopathic effect (CPE) of MRC-5 cells 收稿日期 : 接受日期 : 国家传染病重大专项 ( 批准号 : 2014ZX ) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , guominch2013@163.com; zengyicdc@163.com Received: November 21, 2016 Accepted: January 20, 2017 This work was supported by the National Mega-Projects for Infectious Diseases (Grant No.2014ZX ) *Corresponding authors. Tel: , guominch2013@163.com; zengyicdc@163.com

2 2 技术与方法 cultured in 3D collagen. It is possible that the 3D culture model of MRC-5 cells will contribute to cellular biology, cell morphology and viral infection. Keywords human embryonic lung fibroblast; three-dimensional cell culture model; collagen; cytomegalovirus 当前研究 MRC-5 细胞主要是基于传统的二维细胞培养模型, 细胞在平面的塑料或玻璃基质上生长然而, 在体内组织中细胞生长的微环境是三维 [1] 立体的形态, 具有动态性和复杂性的特点许多研究表明, 二维细胞培养不能充分反映真实组织的生 [2] 理相关性三维细胞培养弥补了二维细胞培养的缺陷与不足三维细胞培养是指将具有三维结构的不同材料作为载体与各种不同类型的细胞在体外共 [3] 同培养, 以模拟体内的真实环境目前, 成纤维细胞三维培养最常使用的支架是胶原胶原是人体内含量最多分布最广的蛋白质, 其中 I 型胶原含量最为丰富, 成纤维细胞在其生物合成以及分泌方面扮演着重要的角色三维胶原体系培养的肺成纤维细胞能够渗透进入基质并形成纤维网状矩阵在这种微环境下, 为了达到相互平衡, 细胞与胶原基质会进行重塑, 来源于这种重塑基质的机械信号又会不断地反馈以调节细胞行为这种细胞与基质间的相互 [4] 作用更接近于体内组织的状态胶原纤维具有较高的抗张力强度, 特别是 I 型胶原, 这对促进肺成纤维细胞生长, 维持细胞结构的完整及生物力学特性非常重要此外, 当成纤维细胞在三维基质中培养 [5] 时, 没有基底端极性, 这类似于体内组织的情形三维胶原成纤维细胞培养模型有助于在更接近于真实组织环境的条件下分析细胞的形态和生理功能, 这种模型已经成为研究成纤维细胞生理学行为学和细胞与基质间相互作用的重要工具本研究目的是以鼠尾 I 型胶原为支架, 构建一个模拟体内组织环境的三维胶原 -MRC-5 细胞培养模型, 分别使用含有胎牛血清 (fetal bovine serum, ) 的常规培养液和含有血小板衍生生长因子 (plateletderived growth factor, ) 及牛血清白蛋白 (bovine serum aluminum, BSA) 的培养液培养 MRC-5 细胞, 观察细胞在三维胶原基质内的形态和分布, 进一步分析比较两种培养液对在胶原表面生长的 MRC-5 细胞形态变化的影响利用构建的三维胶原 -MRC-5 细胞培养模型感染人巨噬细胞病毒, 为进一步应用三维细胞模型探索细胞生物学细胞形态学和病毒感染及抗病毒药物等方面的研究提供实验依据 1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人胚肺成纤维 (MRC-5) 细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心 DMEM 培养基购自 Hyclone 公司胎牛血清 (fetal bovine serum, ) 购自浙江天杭生物科技股份有限公司血小板衍生生长因子 (platelet-derived growth factor, ) 购自 Peprotech 公司牛血清白蛋白 (bovine serum aluminum, BSA) 细胞培养级别购自 MRC 公司 TRYPSIN 0.25% EDTA 购自 Invitrogen 公司 2 DMEM 培养液购自 BI 公司鼠尾胶原蛋白 I 型 (5 mg/ml) 购自 Thermo Fisher 公司 4% 多聚甲醛购自上海翊圣生物科技有限公司牛血清白蛋白标准级别购自 MP 公司鼠抗微管蛋白 (tubulin) 单克隆抗体购自天津三箭生物技术有限公司 FICT 标记山羊抗小鼠 IgG 和 FITC 标记山羊抗人 IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽 DAPI 购自北京索莱宝科技有限公司人巨噬细胞病毒株 (human cytomegalovirus, HCMV) 人抗巨噬细胞病毒阳性血清由本室保存 1.2 方法二维细胞培养 MRC-5 细胞分为 2 组, 一组在含 10% 的 DMEM 常规培养液 ( 以下简称常规培养液 ) 中培养 ; 另一组在含 50 ng/ml 和 5 mg/ml BSA 的 DMEM 培养液 ( 以下简称培养液 ) 中培养细胞置于 37 C 5% CO 2 培养箱中培养构建三维胶原 -MRC-5 细胞培养体系将对数生长期的 MRC-5 细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后, 使用常规培养液制备单细胞悬液将细胞悬液鼠尾 I 型胶原和 2 DMEM 按1 的体积比充分混合后迅速置于冰浴中, 用 0.1 mol/l 的 NaOH 溶液调整 ph 值至 7.0, 细胞终浓度为 /ml, 鼠尾胶原终浓度为 1.5 mg/ml 将制备好的 MRC-5 细胞胶原混合液加入 24 孔板中, 每孔加入 300 μl( 细胞数量为 / 孔 ), 置于 37 C 培养箱孵育 30 min, 待胶原形

3 何兵等 : 三维胶原培养模型中 MRC-5 细胞的生长状态及病毒感染 3 成水凝胶后, 分别加入上述两种培养液, 继续培养于 37 C 5% CO 2 培养箱中细胞免疫荧光二维细胞的免疫荧光将无菌玻片置于 24 孔板底部, 用 0.25% 胰蛋白酶消化后, 分别使用常规培养液和培养液制备细胞悬液, 调整细胞密度为 /ml, 往 24 孔板中分别滴加上述两种细胞悬液, 1 ml/ 孔细胞培养 24 h 后弃培养液, PBS 润洗 ; 加入 4% 多聚甲醛室温固定 15 min, 用 PBS 润洗 2 次, 每次 5 min; 加入 1% BSA( 标准级 ) 处理 30 min 用 0.5% Triton X-100 作用 15 min; 标记微管 (microtubules): 添加鼠抗微管蛋白单克隆抗体 [ 使用含 1% BSA( 标准级 ) 的 PBS 200 按1 稀释 ], 37 C 孵育 60 min, PBS 润洗 5 次, 每次 5 min 加入 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG( 使用含 1% BSA( 标准级 ) 的 PBS 按 min 稀释, 37 C 孵育 45 min, PBS 润洗 5 次, 每次 5 标记肌动蛋白 (actin): 加入 TRITC Phalloidin[ 使用含 1% BSA( 标准级 ) 的 PBS 100 按1 稀释 ], 室温避光孵育 30 min, PBS 润洗 5 次, 每次 5 min 使用 DAPI 染色液 (10 μg/ml) 对细胞核进行复染 5 min, PBS 润洗 5 次, 每次 5 min, 于倒置荧光显微镜下拍照观察三维细胞培养免疫荧光 : 细胞 A 在三维胶原培养体系内分别生长至 h 时, 弃培养液, PBS 润洗细胞 2 次, 每次 5 min; 加入 4% 多聚甲醛室温固定 15 min, 剩余步骤同上述二维免疫荧光细胞培养于胶原表面首先, 建立无细胞的胶原培养体系, 然后将细胞加入此胶原体系表面进行培养具体方法 : 将 MRC-5 细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后, 使用常规培养液制备单细胞悬液, 将常规培养液鼠尾胶原和 2 DMEM 按2 的体积比充分混合后迅速置于冰浴中, 用 0.1 mol/l 的 NaOH 溶液调整 ph 值至 7.0, 鼠尾胶原终浓度为 1 mg/ml 将制备好的胶原混合液加入 24 孔板中, 每孔加入 300 μl, 置于 37 C 培养箱中孵育 30 min, 待胶原形成水凝胶后, 分别加入两种细胞悬液, 一种是常规培养液的细胞悬液, 另一种是培养液的细胞悬液当 MRC-5 细胞在常规培养液和培养液中分别生长 6 h 后, 弃掉原培养液, PBS 清洗后, 对常规培养液中生长的 MRC-5 细胞分别添加 1 ml 常规培养液和 1 ml 培养液, 对培养液中生长的 MRC-5 细胞也分别添加 1 ml 常规培养液和 1 ml 培养液, 然后于 37 C 5% CO 2 培养箱中继续培养至 24 h 人巨噬细胞病毒感染 MRC-5 细胞 MRC-5 细胞在三维胶原基质内生长 24 h 后, 弃掉培养液, 以 MOI(multiplicity of infection)=0.1 接种 HCMV 病毒, 设置对照组, 于 37 C 5% CO 2 培养箱中孵育 2 h, 每隔 30 min 轻轻摇晃数次, 2 h 后补加含 2% 的 DMEM 维持液, 分别在第 d 光镜下观察细胞病变的情况病毒感染检测采用间接免疫荧光法检测病毒感染, HCMV 病毒感染 MRC-5 细胞第 6 d, 弃掉维持液, PBS 润洗 ; 加入 4% 多聚甲醛室温固定 15 min, 用 PBS 润洗 2 次, 每次 5 min; 加入 1% BSA( 标准级 ) 处理 15 加入1 30 min 用 0.5% Triton X-100 作用 15 min 稀释的人抗巨噬细胞病毒阳性血清 ( 稀释液为含 10% 的 PBS), 37 C 湿盒中孵育 1 h, PBS 润洗 5 次, 每次 5 min; 100 加入1 稀释的 FITC 标记的羊抗人 IgG( 稀释液为含 10% 10% 伊文氏蓝的 PBS), 37 C 孵育 45 min, PBS 润洗 5 次, 每次 5 min, 于倒置荧光显微镜下观察 2 结果 2.1 三维胶原支架内 MRC-5 细胞的形态和分布在二维培养条件下, MRC-5 细胞培养 24 h 后, 光镜下观察到常规培养液中的细胞形态呈长梭形单层分布, 培养液中的细胞以板状伪足的方式扩展延伸 ( 图 1A) 培养三维细胞的胶原溶液呈透明状, 37 C 孵育 30 min 后形成胶原凝胶, 并紧密贴附于 24 孔板底部, 有一定的抗张力性能在倒置显微镜下观察发现, 三维胶原 -MRC-5 细胞培养模型构建 1 h 后, 在常规培养液中的细胞呈圆形, 均匀分布于胶原凝胶中, 未见伪足突起在培养液中的少部分细胞逐渐伸展, 出现褶边及丝状伪足培养 8 h 后, 可见常规培养液中的细胞已伸展延伸, 呈多突起的星形或不规则三角形, 培养液中的大部分细胞已形成较长的突起, 呈树突状结构, 并且相互层叠接触 12 h 时, 常规培养液中的细胞形态基本一致, 呈长梭形, 条索状或纺锤形, 伪足较长, 细胞可向各个不同的方向伸展, 培养液中的细胞呈网状和树突状结构, 向四处伸展延伸培养 24 h 时, 常规培养液中的细胞和培养液体系中的细胞密度均较高, 均能相互交织形成三维的网状, 可达数层分布于三维胶原中细胞培养 24 h 至 168 h(7 d) 期间, 常规培养液中的细胞能维持明显的三维立体网状结构, 培养液中的细胞也能很好地呈现三维立体

4 技术与方法 (A) (B) 1 h 4 h 8 h (C) 1 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h 72 h 120 h 168 h A: 二维培养条件下, MRC-5 细胞在常规培养液和培养液中的分布和形态 ; B: 三维胶原模型中, MRC-5 细胞在常规培养液中各个时间点的形态及分布 ; C: 3D

4 4 技术与方法 (A) (B) 1 h 4 h 8 h (C) 1 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h 72 h 120 h 168 h A: 二维培养条件下, MRC-5 细胞在常规培养液和培养液中的分布和形态 ; B: 三维胶原模型中, MRC-5 细胞在常规培养液中各个时间点的形态及分布 ; C: 3D 胶原模型中, MRC-5 细胞在培养液中各个时间点的形态及分布 A: the morphology and distribution of MRC-5 cells in conventional culture media and media on 2D culture plates; B: the morphology and distribution of MRC-5 cells inconventional culture media in 3D collagen scaffolds; C: the morphology and distribution of MRC-5 cells in media in 3D collagen scaffolds. 图 1 二维培养板上和三维胶原支架内 MRC-5 细胞的形态和分布 Fig.1 The morphology and distribution of MRC-5 cells on 2D culture plates and in 3D collagen scaffolds 结构, 但是当细胞在培养液中生长 72 h(3 d) 后, 细胞的三维立体形态开始逐渐减弱, 细胞也开始逐渐衰老, 细胞碎片增多 ( 图 1B 和图 1C) 2.2 三维胶原支架中细胞的微管和肌动蛋白的状态细胞骨架由微管 ( m i c r o t u b u l e s ) 微丝 (microfilament) 及中间纤维 (intermediate filament) 所组成, 其中微丝主要由肌动蛋白 (actin) 构成, 因此可以通过鼠抗微管蛋白单克隆抗体标记的微管和 TRITC Phalloidin 标记的肌动蛋白来间接地反映细胞在三维胶原支架中的形态和分布在二维条件下, 24 h 后在荧光显微镜下观察常规培养液中的的细胞贴壁并呈单层极性生长, 形状为梭形或不规则三角形, 培养液中的部分细胞则呈现树突状, 部分细胞呈长梭形 ( 图 2A) 3D 胶原体系培养的细胞, 加入常规培养液 4 h 后, 大部分细胞呈圆形, 少部分细胞开始伸展延伸 ( 图 2B), 8 h 后细胞逐渐伸展延长形成多个星状胞质突起, 细胞呈星形不规则三角形或纺锤形, 并分布于不同的层次, 在镜下没有固定的胶平面 ( 图 2C) 24 h 后可见不同层面的细胞已交织成三维的立体网状 ( 图 2D) 加入培养液 4 h 后, 细胞很快开始伸展延伸, 突起较明显, 层次立体感较强 ( 图 2B); 8 h 后细胞呈现树突状结构并向四周延伸生长 ( 图 2C); 24 h 后细胞密度较大, 并且相互层叠形成网状结构 ( 图 2D) 总之, 在 24 h 内培养液体系中的细胞伸展延伸速度快于常规培养液体系中的细胞 2.3 胶原表面 MRC-5 细胞形态的变化在参考国内外相关文献 [14-15] 的基础上, 结合预实验结果 ( 实验数据未列出 ), 观察到细胞在胶原终浓度为 1 mg/ml 的胶原表面培养时生长状态最佳常规培养液和培养液对在 3D 胶原表面生长的细胞可能显示出了不同的作用常规培养液促进细胞在胶原表面形成聚集, 且随着培养时间的延长, 聚集效应越明显 ( 图 3A); 培养液则有利于细胞在胶原表面以单个细胞的方式进行伸展迁移 ( 图 3B) 当细胞在胶原表面生长 6 h 时, 将原来的常规培养液更换为培养液继续培养 18 h 后, 细胞由聚集状态转变为单个细胞方式伸展, 而未更换常规培养液的细胞则仍显现聚集状态 ( 图 4A) 另一方面,

何 5 兵等: 三维胶原培养模型中MRC-5细胞的生长状态及病毒感染 (A) Microtubules Microtubules (B) Microtubules (C) (D) Microtubules A: 二维培养条件下, MRC-5细胞分别在常规培养液和培养液中生长24 h; B C D: 分别表示细胞在三维胶原基质内孵育4 8 24 h 绿色为微管, 红色肌动蛋白, 蓝色为细胞核

scaffolds, respectively. Green represented microtubules positive, actin was shown in red while nuclei were blue. 图2 在二维培养皿上和三维胶原模型中细胞微管肌动蛋白的生长状态 Fig.

5 何 5 兵等: 三维胶原培养模型中MRC-5细胞的生长状态及病毒感染 (A) Microtubules Microtubules (B) Microtubules (C) (D) Microtubules A: 二维培养条件下, MRC-5细胞分别在常规培养液和培养液中生长24 h; B C D: 分别表示细胞在三维胶原基质内孵育 h 绿色为微管, 红色肌动蛋白, 蓝色为细胞核 A: cells were incubated for 24 h in conventional culture media and media on 2D culture plates, respectively; B,C,D: cells incubated for 4, 8, 24 h in two media mentioned above in 3D collagen scaffolds, respectively. Green represented microtubules positive, actin was shown in red while nuclei were blue. 图2 在二维培养皿上和三维胶原模型中细胞微管肌动蛋白的生长状态 Fig.2 Microtubules and actins on 2D culture plates and in 3D collagen scaffolds (A) (B) 1h 4h 12 h 8h 24 h 72 h 12 h 24 h 72 h 8h 168 h 4h 48 h 120 h 1h 48 h 120 h 168 h A: 常规培养液促进MRC-5细胞在3D胶原表面聚集; B: 培养液有利于MRC-5细胞在3D胶原表面以单个细胞方式进行迁移伸展 A: conventional culture media promoted cells contraction into clusters on 3D collagen scaffolds; B: media promoted cell migration as individuals on 3D collagen scaffolds. 图3 常规培养液促进细胞聚集和培养液促进细胞迁移 Fig.3 Clusteringin serum medium and cell migration in medium

6 技术与方法 (A) (B) 6 h 24 h 24 h 6 h 24 h 24 h A: MRC-5 细胞在 1 mg/ml 的三维胶原表面生长, 添加常规培养液培养 6 h, 随后立刻用 PBS 清洗细胞, 分别加入常规培养液和培养液继续培养 18 h; B: 添加培养液培养 6 h, 随后立刻用 PBS 清洗细胞, 分别加入培养液和常规培养液继续培养 18 h 细胞培养 6 h

media. Subsequently, the samples were rinsed with PBS and placed into conventional culture media and media as indicated for an additional 18 h.

6 6 技术与方法 (A) (B) 6 h 24 h 24 h 6 h 24 h 24 h A: MRC-5 细胞在 1 mg/ml 的三维胶原表面生长, 添加常规培养液培养 6 h, 随后立刻用 PBS 清洗细胞, 分别加入常规培养液和培养液继续培养 18 h; B: 添加培养液培养 6 h, 随后立刻用 PBS 清洗细胞, 分别加入培养液和常规培养液继续培养 18 h 细胞培养 6 h 和 24 h 时, 样本用 TRITC Phalloidin 标记 ( 红色 ), DAPI 复染细胞核 ( 蓝色 ), 细胞在常规培养液和培养液中的形态可发生逆转 A: MRC-5 cells were cultured for an initial period of 6 h on 1 mg/ml collagen matrices in conventional culture media. Subsequently, the samples were rinsed with PBS and placed into conventional culture media and media as indicated for an additional 18 h. B: MRC-5 cells were cultured for an initial period of 6 h media. Subsequently, the samples were rinsed with PBS and placed into conventional culture media and media as indicated for an additional 18 h. At the end of the initial 6 h period and after 24 h, samples were fixed and stained for actin (red) and nuclei (blue). Cellular morphogenetic movement in and conventional culture media was reversible. 图 4 细胞形态变化的可逆性 Fig.4 Reversibility of cellular morphogenetic movement Control Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 Day 8 在 HCMV 感染三维胶原内的 MRC-5 细胞后, 第 4 d 至第 8 d 的细胞病变, 对照组为培养第 5 d 的细胞 The cytopathic effect of MRC-5 cells infected with HCMV from day 4 to day 8 in 3D collagen scaffolds, the cells cultured in 3D collagen for 5 days were as control group. 图 5 HCMV 感染 MRC-5 细胞的病变情况 Fig.5 The cytopathic effect of MRC-5 cells infected with HCMV 细胞在胶原表面生长 6 h 时, 将原来的培养液更换为常规培养液继续培养 18 h 后, 以单个细胞迁移伸展的细胞转变为细胞聚集状态, 而未更换培养液的细胞仍然以单个细胞方式进行迁移伸展 ( 图 4B) 2.4 三维胶原 -MRC-5 细胞培养模型应用于巨噬细胞病毒感染三维胶原支架内的细胞在感染 HCMV 病毒 4 d 时, 常规培养液和培养液中的细胞逐渐开始出现细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE), 病变的细胞变圆膨胀折光性增强, 分布在不同的层次 ; 第 5 d, 细胞肿胀更加明显 ; 第 6 d 和第 7 d, CPE 达到高峰 ( 图 5) 依据 MRC-5 细胞感染的程度, 选择病毒感染后第 6 d 进行间接免疫荧光检测, 图 6 显示了在三维胶原体系内培养的 MRC-5 细胞感染 HCMV 病毒后, 病毒抗原的表达情况 3 讨论三维细胞培养模型为肺成纤维细胞的体外培养提供了新的机遇目前, 国内外研究肺成纤维细胞三维培养的支架主要有聚对苯二甲酸乙二醇酯 (polyethylene terephthalate, PET) 静电纺丝多孔支架 (electrospun porous scaffolds) 细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 和胶原 (collagen) 等 [6-7] 当前以胶原为支架构建的三维 MRC-5 细胞培养模型的文献报道较少, 且多为共培养三维模型 [7] 本实验

何兵等 : 三维胶原培养模型中 MRC-5 细胞的生长状态及病毒感染 7 Control HCMV 三维胶原支架内的 MRC-5 细胞感染 HCMV 病毒后, 第 6 d 病毒抗原的表达情况对照组为培养第 6 d 的细胞 HCMV antigen expression in MRC-5 cells cultured in 3D collagen scaffolds on the sixth

7 何兵等 : 三维胶原培养模型中 MRC-5 细胞的生长状态及病毒感染 7 Control HCMV 三维胶原支架内的 MRC-5 细胞感染 HCMV 病毒后, 第 6 d 病毒抗原的表达情况对照组为培养第 6 d 的细胞 HCMV antigen expression in MRC-5 cells cultured in 3D collagen scaffolds on the sixth day. The cells cultured in 3D collagen for 6 days were as control. 图 6 HCMV 感染的间接免疫荧光检测结果 Fig.6 Indirect immunofluorescent test of HCMV 采用 I 型鼠尾胶原构建三维 MRC-5 细胞培养模型, I 型胶原具有良好的酶和细胞亲和性, 其来源广泛, 易于获取, 力学性能高, 具有较高的生物降解性和生物 [3] 相容性营养物质可以自由进出三维胶原培养体系, 便于细胞进行新陈代谢, 也易于添加各种生长因 [4] 子此外, 这种三维胶原培养体系透明度高, 便于在倒置光学显微镜下实时观察细胞的生长情况三维胶原 MRC-5 细胞培养模型有助于在更接近生理环境的条件下研究细胞的形态学行为 MRC-5 细胞体外培养的微环境对细胞的形态及分布有着至关重要的作用, 如细胞外基质环境的 [8] 机械性能以及物理特征细胞培养条件等本实验比较了常规培养液和培养液对 MRC-5 细胞在三维胶原体系内的形态和分布与二维条件下培养的细胞相比, 细胞在三维胶原体系内生长时, 常规培养液和培养液中的细胞都能形成良好的三维立体网状结构, 细胞可达数层或数十层这样的网状结构类似于体内间充质细胞和结缔组织成纤 [9] 维细胞的生长方式相关研究表明成纤维细胞在三维胶原基质内以树突状的方式扩展形成了纤维矩阵, 使得细胞与细胞细胞与基质间的相互作用更接近于体内的情形这种相互作用对于细胞和组织的生理有着重要的影响, 包括细胞形态细胞增殖 [10-11] 分化细胞行为以及细胞迁移和黏附等国外研究人员报道, 在二维条件下培养的成纤维细胞具有较高的张力, 细胞在二维平面生长, 并以板状伪足的单一方式进行迁移而在三维胶原基质内培养的成纤维细胞张力低, 细胞在三维立体空间内生长, 并以多种方式进行迁移, 这接近于成纤维细胞在体内 [10,12-13] 生长的情形本研究还观察到培养液有利于早期促进细胞扩展延伸, 常规培养液则更有利于较长时间维持细胞多层的三维立体网状结构这对进一步优化三维胶原 -MRC-5 细胞培养条件具有一定的指导意义本研究还进一步分析比较了常规培养液和培养液对在胶原表面生长的 MRC-5 细胞形态变化的影响 MRC-5 细胞在常规培养液的条件下, 分泌并形成了纤连蛋白 (fibronectin) 基质, 这种基质 [14] 可促进细胞发生聚集效应这种聚集现象在正常的组织间质纤维化组织和瘢痕组织以及伤口组织中都能观察到, 而且有研究表明, 成纤维细胞在三维胶原基质表面生长时能形成张力纤维, 虽然成纤维细胞在真实组织中没有张力纤维, 但在损伤修 [9] 复和纤维化过程中存在张力纤维 MRC-5 细胞在培养液的条件下, 细胞以单个方式进行迁移 [15] 生长, 说明培养液能促进细胞迁移胶原与

8 8 技术与方法组织的形成和损伤修复等生物学过程有着紧密的关系, 在调控细胞的黏附迁移增殖和分化中起着重要作用相关研究表明, 成纤维细胞能够在损伤修复过程中产生大量炎症介质, 如成纤维细胞与胶原基质相互作用呈现的不同细胞行为取决于 [16] 生长环境的因素在不同培养液的条件下细胞出现了聚集和迁移现象, 类似于体内组织损伤修复的过程, 这为进一步研究体内生长因子环境是怎样在生理条件下 ( 如损伤修复形态发生和恶性肿瘤 ) 调节成纤维细胞的形态行为提供了新的视角虽然国外有很多关于三维细胞培养模型应用 [17-18] 于人类病毒的研究报道, 但是目前尚未检索出利用三维胶原成纤维细胞培养模型研究病毒的文献本研究应用构建的三维胶原 -MRC-5 细胞培养模型进行了 HCMV 病毒感染, 结果显示在三维胶原基质内生长的 MRC-5 细胞仍能感染 HCMV 病毒, 而且还出现了明显的细胞病变效应, 说明三维胶原体系培养的 MRC-5 细胞没有改变其对 HCMV 病毒的易感性这对进一步应用三维胶原成纤维细胞培养模型研究病毒感染复制增殖以及抗病毒药物等具有参考意义参考文献 (References) 1 Cukierman E, Pankov R, Yamada KM. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol 2002; 14(5): Wang S, Wang Z, Foo SE, Tan NS, Yuan Y, Lin W, et al. Culturing fibroblasts in 3D human hair keratin hydrogels. ACS Appl Mater Interfaces 2015; 7(9): Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. Int J Mol Sci 2015; 16(3): Grinnell F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol 2003; 13(5): Yamada KM, Cukierman E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell 2007; 130(4): Htwe SS, Harrington H, Knox A, Rose F, Aylott J, Haycock JW, et al. Investigating NF-kappaB signaling in lung fibroblasts in 2D and 3D culture systems. Respir Res 2015; 16: Liu XQ, Kiefl R, Roskopf C, Tian F, Huber RM. Interactions among lung cancer cells, fibroblasts, and macrophages in 3D cocultures and the impact on MMP-1 and VEGF expression. PLoS One 2016; 11(5): e Rhee S, Jiang H, Ho CH, Grinnell F. Microtubule function in fibroblast spreading is modulated according to the tension state of cell-matrix interactions. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(13): Grinnell F, Ho CH, Tamariz E, Lee DJ, Skuta G. Dendritic fibroblasts in three-dimensional collagen matrices. Mol Biol Cell 2003; 14(2): Kim D, You E, Min NY, Lee KH, Kim HK, Rhee S. Discoidin domain receptor 2 regulates the adhesion of fibroblasts to 3D collagen matrices. Int J Mol Med 2013; 31(5): Engler AJ, Sweeney HL, Discher DE, Schwarzbauer JE. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. J Musculoskelet Neuronal Interact 2007; 7(4): Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci 2012; 125(Pt 13): Friedl P, Sahai E, Weiss S, Yamada KM. New dimensions in cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol 2012; 13(11): da Rocha-Azevedo B, Ho CH, Grinnell F. Fibroblast cluster formation on 3D collagen matrices requires cell contraction dependent fibronectin matrix organization. Exp Cell Res 2013; 319(4): Rhee S,Ho CH, Grinnell F. Promigratory and procontractile growth factor environments differentially regulate cell morphogenesis. Exp Cell Re 2010; 316(2): Grinnell F, Petroll WM. Cell motility and mechanics in threedimensional collagen matrices. Annu Rev Cell Dev Biol 2010; 26: He B, Chen G, Zeng Y. Three-dimensional cell culture models for investigating human viruses.virol Sin 2016; 31(5): Gardner JK, Herbst-Kralovetz MM. Three-dimensional rotating wallvessel-derived cell culture models for studying virus-host interactions. Viruses 2016; 8(11): 1-17.

,,, A ECs,, A ECs,,, A ECs,,,, ( 8) 213 3,,,,,, A ECs,, ( 9) 7,,,,,, ( 10),,, 28,,A ECs,,A ECs, A ECs 7 ;, ( ) ( 11) 3 BL M IPF, IPF [2

,,, A ECs,, A ECs,,, A ECs,,,, ( 8) 213 3,,,,,, A ECs,, ( 9) 7,,,,,, ( 10),,, 28,,A ECs,,A ECs, A ECs 7 ;, ( ) ( 11) 3 BL M IPF, IPF [2 512 Chinese Medical Journal of Metallurgical Industry,October 2005,Vol122 No1 5 3 1 1 1 2 1 ( 300020) 2 : : (5 mg/ kg), 3 7 28 : 3, ; 7 :,, ; 28 :,,, :, R 563 A 1005-5495 (2005) 05-0512 - 03 Ultrastructural