论文独创性声明及使用授权 本论文是作者在导师指导下取得的研究成果 除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果, 不存在剽窃或抄袭行为 与作者一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 现就论文的使用对云南大学授权如下 : 学校有

Transcription

1 分类号 Q7 密级公开 UDC 编号 博士研究生学位论文 题目鼻疽诺卡氏菌应对秀丽隐杆线虫捕食的生存策略和机制 Title The survival strategy and mechanism of Nocardia farcinica responses to Caenorhabditis elegans predation 学院 ( 所 中心 ) 省部共建云南生物资源保护与利用 国家重点实验室 专业名称生物化学与分子生物学 研究方向细菌与线虫互作机制 研究生姓名吴沁翼学号 导师姓名邹成钢 职称教授 2017 年 9 月

2 论文独创性声明及使用授权 本论文是作者在导师指导下取得的研究成果 除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果, 不存在剽窃或抄袭行为 与作者一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 现就论文的使用对云南大学授权如下 : 学校有权保留本论文 ( 含电子版 ), 也可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文 ; 学校有权公布论文的全部或部分内容, 可以将论文用于查阅或借阅服务 ; 学校有权向有关机构送交学位论文用于学术规范审查 社会监督或评奖 ; 学校有权将学位论文的全部或部分内容录入有关数据库用于检索服务 ( 内部或保密的论文在解密后应遵循此规定 ) 研究生签名 : 导师签名 : 日期 :

3 摘要 摘要 在自然环境中, 细菌作为最大的功能种群之一, 是几乎所有已知生态系统中的基础构件 细菌的生活史中充斥着来自生存环境中的各种压力, 其中捕食是细菌面临的主要逆境 线虫作为细菌最主要的捕食者之一, 在与细菌的协同进化过程中促使细菌进化出了多种抵御捕食压力的机制, 其中包括 : 感染机制 分泌毒素和蛋白酶 最近, 我们实验室证明, 细菌还可以通过在环境中分泌信号分子调动线虫天敌捕杀线虫, 间接地减轻来自线虫的捕食压力 土壤细菌与线虫共享相同的生态位 目前, 对土壤细菌与线虫相互作用的研究主要集中在致病性较强的细菌, 尤其是人类病原菌中, 而致病性较弱的土壤细菌抵御线虫的机制尚不清楚 在本研究中, 我们发现, 喂食鼻疽诺卡氏菌不会影响线虫成虫阶段的寿命 进一步的研究发现, 喂食鼻疽诺卡氏菌导致线虫 p38 MAPK 途径及其下游的转录因子 SKN-1 被激活, 从而介导了对鼻疽诺卡氏菌的耐受 线虫在经典天然免疫通路 p38 MAPK 途径的保护下, 可以将鼻疽诺卡氏菌作为食物终其一生 有趣的是, 成虫在鼻疽诺卡氏菌上所产的线虫卵不能孵化 我们发现, 鼻疽诺卡氏菌在成虫捕食胁迫下所分泌的产物能够有效地抑制线虫卵的孵化 在对诱导产物的作用机制研究中, 证明诱导产物不仅下调线虫卵中线粒体未折叠蛋白途径 (Unfolded Protein Response, UPR) 下游的分子伴侣 hsp-6 和 hsp-60 的表达, 导致线粒体损伤, 而且还下调第二相解毒基因 gst-4 的表达以及抑制自噬流 ROS(Reactive Oxygen Species) 水平在线粒体损伤和 gst-4 表达下调的作用下急剧升高, 致使溶酶体扩大和功能损伤 抗氧剂维生素 D3 和 α- 生育酚在阻止 ROS 升高的同时, 显著地恢复了在诱导产物作用下的溶酶体功能 相对应的, 线虫卵的孵化率也得到了回升 以上结果证明, 鼻疽诺卡氏菌在成虫捕食胁迫下所分泌的产物具有能够抑制线粒体 UPR, 导致 ROS 水平升高, 致使溶酶体功能受损, 抑制线虫卵孵化的能力 综上所述, 鼻疽诺卡氏菌虽然不能直接抵御线虫的捕食, 但以阻断线虫卵的孵化进程, 从子一代断绝线虫的种群繁衍和扩增, 我们将这种抵御方式称为 断子绝孙 机制 因此, 本研究揭示了一种存在于自然界中全新的土壤细菌 I

4 云南大学博士学位论文 抵御线虫捕食压力的机制 关键字 : 鼻疽诺卡氏菌 ; 捕食压力 ; 抑制孵化 ;ROS; 溶酶体功能受损 II

5 摘要 Abstract In the natural environment, bacteria, as one of the largest functional group, build up the fundamental ground for almost all known ecosystems. Bacterial life history is full of various stresses from the living environment. Of these stresses, predation is a major pressure for the survival of bacteria. Nematodes, one of the most important predators of bacteria, drive bacteria to develop a variety of mechanisms to reduce predation stress through coevolution process, including; infection mechanisms, secretion of toxins, and proteases. Recently, our laboratory has revealed that food bacteria reduce the predation pressure indirectly by secreting signaling molecules into the environment, mobilizing nematodes natural predators to reduced predation stress. Soil bacteria and nematodes share the same niche. The study of the interaction between soil bacteria and nematodes is mainly focused on pathogenic bacteria, especially human pathogens. The defense mechanism of less pathogenic soil bacteria have used in reduction of predation stress remains unknown. In this study, we have found Nocardia farcinica leave the life spans of adult C. elegans unaffected. Specifically, the p38 MAPK pathway through its downstream transcription factor, SKN-1 mediates the tolerance of adult nematode to N. farcinica. The protection effects of p38 MAPK pathway able nematodes to utilize N. farcinica as normal diet for its entire life. Interestingly, eggs laid by adult nematode on N. farcinica unable to hatch. We found the products were secreted by N. farcinica after inducing by predation stress effectively inhibits nematodes eggs from hatch. Induced product not only acts on down regulation of two mitochondrial unfold protein response chaperone hsp-6 and hsp-60 expression level, in turn cause mitochondria dysfunction, but also down-regulated the expression level of phase II detoxification gene gst-4 and autophagy flux. Mitochondria dysfunction and down regulation of gst- 4 expression have caused ROS level increase sharply, in turn mediates lysosome expansion and dysfunction. Antioxidant vitamin D3 and α-tocopherol effectively preventing the rise of ROS, consequently the lysosome function have restored while III

6 云南大学博士学位论文 treated with induced product. Correspondingly, the hatch rate of the nematodes eggs has also recovered. In this study, we have proved the increase of ROS level mediates the lysosomes dysfunction, in turn to affect the hatch ability of nematodes eggs. N. farcinica inhibits the hatch process of nematodes eggs, as the result, the expansion of nematodes population stopped since there is no offspring, in turn to efficiently lower the predation stress. This study reveals a novel mechanism which used by less pathogenic soil bacteria (N. farcinica) to conquer predation stress in nature. Key words: Nocardia farcinica; predation stress; hatch inhibition; ROS; lysosome dysfunction IV

7 目录 目录 摘要 Abstract I III 第一章绪论 微生物与秀丽隐杆线虫之间存在共生关系 微生物应对食菌线虫捕食压力而进化出的抵御机制 通过感染机制杀死线虫 通过释放毒素和蛋白酶等杀线虫 通过间接方式抵御线虫捕食 鼻疽诺卡氏菌概述 秀丽隐杆线虫作为微生物 - 宿主互作的研究模型 线虫的生理和发育特点概述 秀丽隐杆线虫作为研究对象的优势 秀丽隐杆线虫对微生物的防御机制 线虫的物理和生理保护机制 线虫通过逃避行为躲避有害微生物 线虫对细菌的识别机制 线虫对微生物的免疫机制 研究的目的与意义 21 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 前言 实验材料与方法 实验材料 实验用仪器 实验用试剂 实验用试剂盒 实验用培养基及配置方法 实验用溶液的配制方法 转基因和突变 C. elegans 线虫株 28 V

8 目录 菌株 定量 RT-PCR 引物 实验方法 线虫培养 线虫的冻存与复苏 线虫复苏 线虫同步化 线虫 RNAi 分析实验 鼻疽诺卡氏菌侵染线虫实验 线虫逃避实验 显微镜分析实验 RT-PCR 实验 线虫总 RNA 提取 cdna 合成 RT-PCR 操作流程 蛋白免疫印迹 线虫蛋白提取 蛋白含量测定 SDS-PAGE 蛋白电泳 转膜 封闭 抗体孵育 统计学分析 实验结果 鼻疽诺卡氏菌不影响线虫成虫寿命 成虫依赖 p38 MAPK 途径抵御鼻疽诺卡氏菌 抵御鼻疽诺卡氏菌激活成虫 p38 MAPK 途径 鼻疽诺卡氏菌通过 p38 MAPK 途径激活 SKN SKN-1 介导线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗 讨论 VI

9 云南大学博士学位论文 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 前言 实验材料与方法 实验材料 实验用仪器 实验用试剂 实验用培养基及配置方法 实验用培养基及配置方法 实验用溶液的配制方法 转基因和突变 C. elegans 线虫株 菌株 定量 RT-PCR 引物 实验方法 线虫培养 线虫的冻存与复苏 线虫同步化 线虫 RNAi 分析实验 线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 大剂量线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 小剂量线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 诱导发酵液萃取实验 未诱导 N. farcinica 发酵实验 未诱导发酵液萃取实验 诱导产物 / 未诱导产物浸泡线虫卵实验 ROS 检测实验 二氢乙啶 (DHE) 染色 DCFH-DA 染色 CellRox Deep Red 染色 溶酶体功能检测 LysoSensor Green DND-189 染色 60 VII

10 目录 组织蛋白酶 B 活性检测 ATP 检测 显微镜分析实验 RT-PCR 实验 线虫卵总 RNA 提取 cdna 合成 RT-PCR 操作流程 蛋白免疫印迹 统计学分析 实验结果 鼻疽诺卡氏菌抑制线虫卵的孵化 线虫诱导鼻疽诺卡氏菌产生的分泌产物抑制线虫卵的孵化 诱导产物导致线粒体机能受损 诱导产物导致溶酶体扩大和功能受损 线粒体功能受损导致溶酶体功能异常 诱导产物通过抑制 UPR mt 下游伴侣分子导致线粒体功能受损以及溶酶体功能受损 诱导产物抑制线虫卵中的自噬流 诱导产物增加 ROS 水平导致溶酶体功能受损致使线虫卵不孵化 讨论 第四章全文总结与展望 附录 参考文献 致谢 VIII

11 第一章绪论 第一章绪论 细菌是地球上分布最广泛的物种之一, 除了承担物质循环外还支撑着食物 链 其中, 针对线虫与细菌相互作用的研究, 因其对生态系统 农业以及人类 健康具有深远且广泛的意义而备受关注 1. 微生物与秀丽隐杆线虫之间存在共生关系 秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 的整个进化史都与细菌的相互作用紧密联系着 线虫与细菌相互作用既可以是互利共生的, 也可以是捕食者 - 被捕者的关系 在哺乳动物肠道中, 微生物为宿主提供生命所必需的微生物以及叶酸, 而宿主为微生物提供适合的生态位供其生长繁育 这样的关系被视为典型的互利共生 同样的, 在线虫中这样的共生关系也是存在的 例如 : 改变实验室线虫食物大肠杆菌 (Escherichia coli) 叶酸代谢途径会影响线虫寿命 (Virk et al., 2012) 此外, 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 是一种无荚膜革兰氏阴性菌广泛分布于土壤中 当作为食物喂食线虫后发现, 枯草芽孢杆菌能够在线虫肠道中合成一氧化氮, 相较于实验室线虫食物 E. coli OP50 而言, 能够有效增加线虫的寿命 (Gusarov et al., 2013) 再者, 比菲德氏菌 (Bifidobacter infanits) 通过细胞壁上的组份可以激活由线虫 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 途径调控的转录因子 SKN-1, 从而延长线虫的寿命 (Komura et al., 2013) 由此可见, 线虫与细菌互利共生是普遍存在的也是必须的 2. 微生物应对食菌线虫捕食压力而进化出的抵御机制 自然环境中,C. elegans 并非依赖特定细菌提供营养, 它的这种非专一性捕食细菌的特点导致许多细菌成为线虫潜在的猎物 (Freyth et al., 2010) 在这种捕食压力下, 促使细菌进化出了种类繁多的机制抵御线虫 根据这些机制的作用原理, 可大致分为以下三类 : 1

12 云南大学博士学位论文 2.1 通过感染机制杀死线虫 在第一种机制中, 是以细菌进入机体内或在机体上定植, 导致线虫机体损伤和病理反应为前提的 线虫捕食细菌过程中, 利用咽部摄入细菌 线虫的咽部肌肉根据功能分为 : 体部 (Corpus) 峡部 (Isthmus) 以及末端食道球肌 (Terminal bulb) 在线虫进食时, 体部 前峡部以及末端食道球的肌肉几乎同一时间收缩 由于咽部肌肉为径向, 所以收缩使管腔打开呈三角形截面, 细菌和液体同时抽吸进入口部 于此同时, 食道球肌收缩, 翻转咽磨器用于磨碎细菌, 细菌碎屑随后被运送进入肠道 (Bumbarger et al., 2003) 抽吸完成后, 肌肉几乎同时放松, 咽磨器翻转回静止状态, 排出液体 (Avery&Horvitz., 1989) 故而, 线虫每次抽吸动作是摄入一定量的细菌而非单体细菌 随着线虫年龄的增长, 研磨机的效率降低, 导致小部分活体细菌由于研磨不完全而进入肠腔 而一些种类的细菌便可借此机会, 定植于线虫肠道中进行增殖 (Portal-Celhay et al., 2012 ) 铜绿假单胞菌 ( Pseudomonas aeruginosa ) 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 和粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) 等 ( 表.1), 都能够定植于线虫的肠腔中 细菌在肠道中大量地增殖使线虫肠腔膨胀和堵塞, 通过微生物种群结构以及肠通透性地改变杀线虫 (Khalif et al., 2005) 而洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia cepacia) 可以通过产生几丁质酶, 降解线虫咽部的研磨机, 主动地促使研磨机机能下降, 从而进入线虫肠道定植 (Huber et al., 2001;Kothe et al., 2003) 感染机制杀线虫所需时间一般较长, 故而又被称为 慢杀模式 (Tan et al., 1999) 除了进入肠道外, 一些微生物还能通过在角质层上定植的方式感染线虫, 例如 : 微杆菌 (Microbacterium nematophilum) 能定植在线虫肛门周围区域的角质层上, 导致线虫肛门扩大和肿胀形成 Dar 表型 微杆菌的感染机制虽不能杀死线虫, 但能导致线虫生长和繁殖速率降低 (Hodgkin et al., 2000) 此外, 细菌可以通过改变自身形态杀线虫, 例如 : 假结核耶尔森氏菌 (Yersinia pseudotuberculosis) 和鼠疫耶尔森氏菌 (Yersinia pesti) 这两种菌能在线虫表皮, 尤其是头部形成生物膜 (bioflim) 生物膜通过包裹咽部从而阻塞线虫的进食, 导致线虫饥饿死亡 (Darby et al., 2002; Nascarella et al., 2005) 在自然界中, 两个同属或不同属的细菌还可以通过互相 2

13 第一章绪论 合作杀线虫, 例如 : 无色杆菌 (Leucobacter)Verde1 能通过线虫尾部将一群线虫粘附在一起, 形成 星星 形状, 通过无色杆菌 Verde 2 增加线虫尾部通透性杀线虫 (Hodgkin et al., 2013) 线虫通过改变角质层构成能增加对 Verde 2 的耐受能力, 但也会使线虫变得更易粘附, 增加 Verde1 的捕杀能力 (Hodgkin et al., 2013) 2.2 通过释放毒素和蛋白酶等杀线虫 在第二种机制中, 细菌分泌不同种类的毒素和蛋白酶杀死线虫 分泌蛋白毒素杀线虫的细菌有 : 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis), 其能通过产生成孔伴胞晶体毒素 (Cry) 杀线虫 晶体毒素作用于线虫肠道, 导致线虫肠道损伤 该过程中并不需要定植于线虫肠腔内 线虫受毒素影响, 出现咽部抽吸运动停止 发育抑制 颜色苍白以及运动减少的中毒特征 (Wei et al., 2003) 金色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus) 所产生的 毒素同样是成孔毒素导致细胞凋亡 (Essmann et al., 2003) 将负责编码 毒素的基因敲除后, 线虫生存率增加 (Sifri et al., 2003) 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) 造成线虫肠道膨胀, 损伤肠腔而形成圆形囊泡 之后的研究中发现, 敲除粘质沙雷氏菌成孔毒素 shlba 基因的启动子后, 线虫的存活率增加 (Kurz et al., 2003) ShlB 是一个外膜转运蛋白, 负责转运并激活 ShlA ShlA 特定的与真核细胞膜结合, 在膜上打孔从而导致细胞的降解 (Schiebel et al., 1989) 铜绿假单胞菌分泌的 ETA 毒素, 抑制线虫肠道表皮细胞内基因的翻译, 降低肠道修复受损机能 (Dunbar et al., 2012) 细菌产生的蛋白酶也是抵抗线虫捕食压力有效的武器 我们实验之前发现, 侧孢短芽杆菌 (Brevibacillus laterosporus)g4 粘附于线虫表皮后, 很快繁育扩增形成单克隆, 并在线虫表皮上形成孔状损伤, 降解消化线虫的表皮和组织 之后的研究表明, 侧孢短芽杆菌分泌的胞外碱性丝氨酸蛋白酶是其抵御线虫的关键因素, 将编码蛋白酶的基因敲除后, 细菌杀线虫的能力下降 (Huang et al., 2005) 除此之外, 我们实验室以前的研究发现, 杀线虫芽孢杆菌 (Bacillus nematocida) 同样能够分泌碱性蛋白酶, 但有别于侧孢短芽杆菌的是, 杀线虫芽孢杆菌需要进入线虫肠道, 通过降解损伤线虫肠道从而降低线虫种群 3

14 云南大学博士学位论文 数量 有趣的是, 杀线虫芽孢杆菌能释放挥发性有机物吸引线虫, 驱使线虫吞食菌体, 从而达到进入线虫肠道的目的, 正如当年希腊人使用木马计攻陷特洛伊城一般 (Niu et al., 2010) 在与芽孢杆菌属中其它细菌编码蛋白酶的基因进行比对后发现, 这类表皮降解蛋白酶的基因序列相似度极高, 揭示了这类蛋白酶在芽孢杆菌属中是高度保守的 (Tian et al., 2007) 而梭菌属细菌分泌的胶原酶也被证实能够降解线虫的表皮 (Cox et al., 1981) 在第二种机制中, 细菌除了分泌毒素蛋白或蛋白酶杀线虫外, 还可以通过产生小分子代谢产物杀线虫, 例如 : 铜绿假单胞菌产生脓菌荧光素 (Pyoverdin) 被证实能够杀线虫 (Mahajan-Miklos et al., 1999) 脓菌荧光素是铜绿假单胞菌中主要的铁载体之一 (Schalk et al., 2008), 当环境中铁元素缺乏时开始大量表达, 杀线虫能力提高 而当负责编码脓菌荧光素的基因被敲除后, 细菌杀线虫的能力大大降低 (Kirienko et al., 2013) 对铁的摄取是细菌致病性的构成因素 (Takase et al., 2000) 脓菌荧光素也是参与线虫 红色死亡 表型的主要毒力因子之一 当环境中的磷元素缺乏时,MvfR 系统开始大量合成 3,4- 二羟基 - 2- 庚基喹啉 (PQS), 同时脓菌荧光素也大量表达, 线虫肠腔内出现大量红色复合物, 最终导致线虫大量死亡 PQS 具有螯合铁元素的作用, 两个 PQS 离子结合 Fe 3+ 形成红色复合物 (Bredenbruc et al., 2006), 这也是造成线虫 红色死亡 的最主要原因 (Zaborin et al., 2009) 铜绿假单胞菌 PA01 分泌的氰化氢能抑制细胞中的线粒体呼吸链, 麻痹及杀线虫 (Gallagher and Manoil., 2001), 过程中并不需要细菌定植于线虫的肠道内 (Darby et al., 1999) 此外铜绿假单胞菌产生的吩嗪衍生物可以造成线虫体内蛋白质聚集, 造成机体损伤尤其是对多巴胺神经元的损伤 (Ray et al., 2015), 最终导致线虫生存率下降 化脓性链球菌 (Streptococcus pyogenes) 是一种自然界广泛分布的革兰氏阳性菌, 能够通过分泌过氧化氢直接导致线虫死亡 (Jansen et al., 2002) 屎肠球菌由无氧培养状态转为有氧状态时, 会产生大量的过氧化氢, 对线虫的生理机能造成损伤 (Moy et al., 2004) 相比感染机制, 毒素介导地杀线虫效率一般较高, 所用时间也较短, 故而又被称为 快杀模式 (Mahajan-Miklos et al., 1999) 拥有以上两种抵御捕食压力机制的细菌广泛分布于革兰氏阳性和阴性中, 4

15 第一章绪论 其中绝大部分为致病菌 ( 表 1) 表 1. 细菌抵御线虫捕食压力的策略图表根据图中所给参考文献进行统计和绘制 Table 1. The strategies of microorganism used in resistance nematodes predation stress Table was draw according to references listed in table. 2.3 通过间接方式抵御线虫捕食 对于那些没有防御机制的 食物 细菌来说, 也不是就完全束手就擒 这些细菌可以通过间接方式抵御线虫捕食 (Sonowal et al., 2013; Wang et al., 2014) 近来有研究发现, 一类肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 细菌可以水解植物分泌的芳香类 糖苷类化合物 ( 如马栗树皮苷 水杨苷和熊果苷 ), 产生的水解产物可 5

16 云南大学博士学位论文 以作用于线虫的多巴胺受体, 介导线虫死亡 (Sonowal et al., 2013) 最近, 我们实验室在研究牧场牛粪和土壤的细菌与线虫相互作用时, 发现了一个细菌抵御线虫捕食的 借刀杀敌 现象 (Wang et al., 2014) 即一些细菌在被线虫捕食胁迫下, 精氨酸酶 arca 表达升高, 产生小分子化合物 尿素 尿素通过转运蛋白 UTP79 转运至旁边的线虫天敌 捕食线虫真菌如寡孢节丛孢 (Arthrobotrys oligospora) 在真菌细胞中, 尿素通过脲酶 URE1 分解为 NH 3, 作为信号分子刺激捕食线虫真菌产生捕食器官, 杀死自己的捕食者 线虫 这些研究表明, 在自然界中, 细菌存在多种抵御线虫的机制 3. 鼻疽诺卡氏菌概述 鼻疽诺卡氏菌 (Nocardia farcinica) 作为放线菌门下诺卡氏菌属中一种, 广泛分布于土壤中以及腐败的物质中, 是一种需氧的革兰氏阳性腐生菌, 无气生菌丝但有营养菌丝生成 其能够合成类胡萝卜素样色素, 故而菌落展现出微黄色且拥有典型褶皱表面, 菌苔遇到液体后成片脱落 ( Lechevalier., 1989; Goodfellow., 1992) N. farcinica 是过氧化酶阳性的化能异养菌拥有氧化型代谢系统 (Goodfellow,1992) 细胞壁中含有内消旋二氨基庚二酸 (meso-dap) 阿拉伯糖 半乳糖和 N- 乙酰基甲酰氨基酸 分枝菌酸通过阿拉伯半乳聚糖聚合物与肽聚糖相连 (Yano et al., 1978), 同时细胞壁中还含有结核菌硬脂酸 (Lechevalier., 1989;Goodfellow., 1992) 另一个能够使 N. farcinica 快速增殖的特性是, 拥有溶菌酶的抗性 (Collins et al., 1988) 除酒石酸诺卡氏菌外, 几乎所有诺卡氏菌都拥有溶菌酶抗性 而放线菌门下的红球菌属 马杜拉放线菌属以及链霉菌属则不具有此特性 (Lechevalier., 1989) 除此之外,N. farcinica 能够在 45ºC 下生长, 耐受妥布霉素以及头孢霉素 (Lechevalier., 1989; Goodfellow., 1992; Wallace et al., 1990) 诺卡氏菌虽然是土壤细菌, 但可通过灰尘颗粒的媒介, 在空气中传播 宿主通过呼吸吸入诺卡氏菌导致肺部感染 (Schaal et al., 1978; Beaman., 1992) 此外, 创伤也能介导诺卡氏菌进入患者的脏器或血管中 (Vanderstigel et al., 1986) 不仅如此, 诺卡氏菌偶尔还可以通过口腔和消化道进入肺部造成感染 6

17 第一章绪论 (Terezhalmy et al 1978; Burton et al., 1990; Hickey et al., 1953) 自 1898 年首例肺部诺卡氏病在美国被报道以来, 每年几千例肺部诺卡氏病陆续被报道, 其中有发生在免疫系统受损个体, 也有健康个体 肺部诺卡氏菌感染通常为化脓性反应, 偶尔会出现肉芽肿反应, 甚至是化脓并伴生肉芽肿的综合反应 (Balikian et al., 1978; Feigin 1986) 诺卡氏菌不仅能造成肺部感染, 还能通过进入血管侵蚀其它脏器 当病灶出现在机体两个或多个位置时, 该种感染被定义为全身或弥散性诺卡氏菌病, 其中弥散性感染的位置主要包括 : 中枢神经 皮肤 皮下组织 视网膜 肾脏 关节 骨骼和心脏 (Beaman et al., 1994) 诺卡氏菌病的病灶特征是在感染早期脓肿的形式以及出现渗透型中性粒细胞, 因而诺卡氏菌被视为化脓性细菌 (Phillips et al., 1992) 此外, 由外伤创口进入的诺卡氏菌还会引起足菌肿 足菌肿初期多数情况下, 是先形成无痛结节, 而后伴随着结节地增大最终导致化脓性坏死 至少半数的足菌肿都是由放线菌门中细菌导致的, 其中大部分为诺卡氏菌 (Beaman et al., 1994) 诺卡氏菌甚至可能导致帕金森综合症, 通过皮下注射诺卡氏菌, 小鼠产生临床和病理上都与帕金森相似的综合症 (Kohbata et al., 1991) 诺卡氏菌除了在人体中造成感染外, 还能感染不同种类的动物, 如 : 牛 绵羊 狗 马 猫 灵长动物 鱼和甲壳类动物等 (Anderson et al., 1980; Sharma et al., 1977; Bradney,1985; Biberstein et al., 1985; Armstrong,1980; Al-Doory et al., 1969; Campbell et al., 1968; Alderman et al., 1986) 先天免疫是一个原始的预防系统, 用于清除非本体的物质 巨噬细胞通过非选择性吞噬侵入的细菌或者在荷尔蒙以及细胞介导的免疫作用调控下, 特异地清除大部分脏器中的细菌 被吞噬后细菌的命运一般由吞噬体代谢水平以及细菌是否产生能够抵抗吞噬体中依赖氧或不依赖氧的杀菌物质所决定 (Beaman et al., 1984) 体外实验证实, 在巨噬细胞中的诺卡氏菌通过形成无细胞壁 球形以及拥有 L 型细菌特性的菌体存活于巨噬细胞中, 说明诺卡氏菌可以通过转变细胞状态赋予其存活于巨噬细胞内的能力 (Bourgeois et al., 1974) 一些诺卡氏菌还可以抑制吞噬体与溶酶体的融合作用, 而且毒力越强的种群, 其抑制作用越明显 (Beaman et al., 1994) 中性粒细胞和单核细胞也显示出对诺卡氏菌的吞噬作用 中性粒细胞和单核细胞通过依赖氧或者是不依赖氧的杀菌机制清除大部分的微生物 这两种免疫细胞对单核细胞增多性李斯特菌和金黄葡萄球菌 7

18 云南大学博士学位论文 的杀菌率在感染四小时后可以达到 90%, 而对诺卡氏菌杀菌率仅能达到 10%-21% (Filice et al., 1980) 虽然研究发现, 当中性粒细胞和单核细胞吞噬诺卡氏菌后能引起氧化代谢爆发, 但是中性粒细胞和单核细胞并不能有效杀死诺卡氏菌 (Filice et al., 1980) 通过对星形诺卡氏菌( Nocardia asteroides) 的研究还发现, 星形诺卡菌能够分泌超氧化物歧化酶 SOD 用以扫除由激活中性粒细胞产生的活性氧 (Beaman et al., 1983) 不仅如此, 星形诺卡氏菌还可以阻碍吞噬小体的酸化程度 (Black et al., 1986) 使用 γ 干扰素和肿瘤坏死因子 α 预先处理单核细胞后发现, 这些因子可以促使星形诺卡氏菌在单核细胞中营养菌丝的生长 虽然这些因子可以增加溶酶体水解酶的合成, 但是星形诺卡氏菌可以使用水解酶中的酸性磷酸酶作为碳原子的来源, 从而促使营养菌丝的生长 (Beaman et al., 1988) N. farcinica 同样拥有能够抵御吞噬小体产生 ROS 的分子机制 在对 N. farcinica 基因组的研究中发现,N. farcinica 基因组中含有编码烷基过氧化氢还原酶的基因 ahpc 过氧化氢酶基因 katg 以及超氧化物歧化酶基因 sodf, 这些都是细菌抵抗 ROS 关键解毒酶 (Rodionov et al., 2004) 同时 N. farcinica 还含有编码硫氧还蛋白氧化还原酶的基因以及谷胱甘肽过氧化物酶的基因, 揭示 N. farcinica 拥有多重抵抗 ROS 的机制 除了抵御 ROS 的解毒机制,N. farcinica 同时具备修复 ROS 损伤蛋白的分子机制, 肽蛋氨酸亚砜还原酶在大肠杆菌和酵母中被证实响应氧化压力 (Moskovitz et al. 1995), 而 N. farcinica 拥有编码肽蛋氨酸亚砜还原酶的基因 Msr 促使鼻疽诺卡氏菌能够在低氧环境中生存, 例如 : 激活后的巨噬细胞 N. farcinica 还拥有编码硝酸还原酶的基因 narghij and nirbd(wu et al., 2005) 以上分子机制提供了 N. farcinica 入侵宿主机体和逃避宿主免疫机制的能力, 是造成慢性或急性感染的前提 细菌致病过程中, 除了有效逃避宿主的免疫防御机制外 成功入侵宿主非吞噬细胞对于细菌获取营养物质 离子等用于自身群体的存活, 扩增和迁移至关重要 在针对结核杆菌 H37Ra 的研究中发现, 结核杆菌基因组含有一个 450bp 的 DNA 片段, 将此片段通过转基因手段转入非致病的大肠杆菌后, 赋予其能够入侵哺乳动物细胞以及存活的能力 (Arruda et al., 1993), 通过扰动非吞噬细胞的细胞膜 (Chitale et al. 2001), 因此被命名为 mce( mammalian cell entry locus ) 其后在针对结核杆菌 H37Rv 全基因组测序中发现, 结核杆菌 8

19 第一章绪论 H37Rv 含有四个 mce 操纵子 mce1-mce4, 其拥有相似的基因组成以及 450bp 核心序列 (Cole et al., 1998) 研究证明 mce1-mce4 在致病过程中所表达的时间是不相同的,mce1 主要在感染的初期表达, 而 mce4 则主要表达在感染的后期 (Saini et al., 2008) 研究表明,mce4 编码的胆固醇运输系统使结核杆菌能够利用宿主细胞膜上普遍存在的组份胆固醇, 获得碳和能量 (Sassetti et al., 2008) N. farcinica 拥有六个 mce 操纵子 (Ishikawa et al. 2004) 虽然, 目前尚未有报道指出 mce 操纵子的数量是否与 N. farcinica 的致病性相关 但是, 非致病性阿佛曼链霉菌 (S. avermitilis) 以及天蓝色链霉菌 (S. coelicolor) 仅含有一个 mce 操纵子 (Bentley et al., 2002; Ikeda et al., 2003) 相对的, 拥有致病性的红球菌则含有三个 mce 操纵子 (Rahman et al., 2003), 由此可见 mce 操作子的数量与 N. farcinica 的致病性是相关的 同时, 研究发现,N. farcinica 含有编码铁运载蛋白的基因簇, 这个基因簇中共含有八个基因, 分别是 :nbta -B -C -D -E -F -G 和-H 其中 NbtA 与结核分枝杆菌的硫酯酶 MbtB 结构域同源, NbtB 和 NbtC 则可能与聚酮合酶基因 PKS 类似 NbtD NbtE 和 NbtF 是非核糖体多肽合成酶, 每个都含有至少一部分参与腺苷酸化或者肽基载体蛋白又或者缩合的功能 MbtG 是赖氨酸 N- 加氧酶催化赖氨酸 N6 羟基化,NbtH 与 MbtK 同源, 将酰基链转移到赖氨酸的 ε- 氨基 细菌的铁运载蛋白与致病性密切相关, 而 N. farcinica 的铁运载蛋白也被证实具有细胞毒性, 是 N. farcinica 的毒力因子 (Hoshino et al., 2011) 4. 秀丽隐杆线虫作为微生物 - 宿主互作的研究模型 4.1 线虫的生理和发育特点概述 秀丽隐杆线虫是一种非寄生性的土壤线虫, 广泛分布于自然界中 线虫以土壤或水体中的微生物为食, 其中又以细菌为最主要的捕食对象, 故而又被称为食菌线虫 线虫体形微小, 刚孵化的幼虫仅有 0.25 毫米长, 而成年线虫体长 1 毫米 同其它线虫一样, 秀丽隐杆线虫具有不分段的圆柱体形, 其尾部呈锥形, 身体由两个类似空心管的管状层沿着前后轴套叠而成 两个管状层之间由 9

20 云南大学博士学位论文 充满液体的假体腔隔开 内管中是消化系统, 由前端具有研磨食物功能的咽喉和沿着身体长度延伸的肠道构成 外管由角质层 皮下组织 体壁肌肉和神经系统构成 咽喉通过自身的基膜与外管组织以及假腔分隔开, 咽喉内腔与肠腔相连, 咽喉通过肠咽阀将食物送入肠道 肠道是线虫体内唯一个由单一细胞体系分化形成的组织 20 个肠细胞组成具有中心腔的管, 肠细胞顶端表面带有许多微绒毛 (Sulston, et al., 1977), 在微绒毛外是一层由高度修饰的糖蛋白构成的电子透明层, 其作用是定位消化酶以及保护微绒毛免受生理或毒素损伤 (Leung et al., 1999) 肠道除了消化食物吸收营养物质外, 还承担合成和储存大分子物质 启动天然免疫反应以及产生卵黄培育生殖细胞的功能 (Kimble et al., 1983; Schulenburg et al., 2004) 内管中除了消化系统还包括生殖系统, 由 U 型性腺 子宫和储精囊构成 (Kimble et al., 1981) 假腔中含有三对, 共六个体腔细胞, 其主要作用是提供免疫和清除功能 (Fares et al., 2002) 外管中含有的神经系统较为简单, 仅由 302 个神经细胞组成, 主要富集于线虫的头部, 围绕着咽部形成神经环 (White et al., 1976) 神经系统调控着线虫的各种行为, 包括对触碰的反应 趋食性运动以及对有害物质的逃避 (Corsi, 2006) 肌肉层位于神经系统和上皮层中间 线虫的角质层由上皮层分泌形成, 从外层包裹线虫提供对线虫的保护 维系体形以及充当外骨骼,(Nelson et al., 1983) 秀丽隐杆线虫的生命周期分为几个阶段 ( 图 1.1), 其中, 线虫胚胎发育又可以大致分为三个时期 : 细胞增殖阶段 形态形成阶段以及最后的细胞分化及角质层形成阶段 (McKeown et al., 1998) 细胞增殖期中, 胚胎受精卵由二细胞扩增为多细胞, 这个过程一般需要 4 个小时 随后胚胎细胞出现卵裂直至形成 comma, 因此时期的线虫胚胎形态犹如一个逗号, 故被称为 comma 从 comma 时期开始, 线虫胚胎发育进入形态形成阶段, 在此阶段中胚胎继续发育形成折叠形态, 折叠形态根据虫体延伸情况又可分为 :1.5 折叠 2 折叠 3 折叠以及 4 折叠 ( 图 1) 从 2 折叠期开始可以观察到线虫肌肉抽动,3 折叠期虫体开始运动至 4 折叠期后虫体延伸完成, 整个形态形成阶段持续 4 个小时 而后再经由 2 个小时的细胞分化以及角质层形成, 线虫幼虫孵化 (Sulston et al., 1983) 线虫胚胎与其它卵生动物一样由卵壳包裹, 卵壳由三层物质以及细胞外基质组成 (Rappleye et al., 1999) 卵壳最外层是卵黄层, 形成于卵母细胞受精前 10

21 第一章绪论 (Schierenberg et al., 1992), 在次氯酸钠的作用下可以被去除 (Benenati et al., 2009) 卵黄层的下面是几丁质层, 在几丁质酶的作用下被降解去除, 去除几丁质层后线虫卵形由椭圆变为球形 (Wharton., 1980) 最里面的一层由蛋白聚糖组成, 又被称为软骨素蛋白聚糖 (CPG) 层 (Olson et al., 2006) CPG 层与胚胎细胞之间的是胚胎细胞外基质层 (EEM), 这一层由液体填充并含有多种蛋白 (Johnston & Dennis., 2012) 在基质层下面的一层是渗透层, 富含脂肪, 在防止大多数小分子进入的同时维系胚胎中的水分, 是胚胎细胞的渗透屏障 (Johnston et al., 2006) L1 龄幼虫在食物的诱导下持续发育为 L2 龄,L3 龄, L4 龄,young adult 直至成虫 而当生存坏境较为严苛时, 例如 : 食物缺乏, L1/L2 龄幼虫线虫进入 dauer Dauer 时期幼虫对外界刺激具有很强的耐受能力, 并在生存坏境改善后进入正常的生命周期 (Corsi, 2006) 图 1.1 线虫的生命周期 ( 图片来自 Corsi, 2006) Figure 1.1 The life cycle of C. elegans(picture from Corsi, 2006) 4.2 秀丽隐杆线虫作为研究宿主 - 微生物互作的优势 秀丽隐杆线虫作为模式生物, 被广泛的运用到了各个研究领域, 尤其是与 微生物相互关系机制的研究中 秀丽隐杆线虫作为模式生物拥有很多优势, 其 11

22 云南大学博士学位论文 体现在 : 首先, 线虫拥有较快的生命周期 在适宜的坏境下, 线虫从卵发育到成虫仅需三天 (Corsi, 2006), 每条成虫能产生 个后代, 使得线虫具有非常快速的种群扩增能力 其次, 线虫基因背景清楚,1998 年秀丽隐杆线虫完成全基因组测序 分析后发现, 线虫与人类基因组的相似性是显著的 线虫中 40% 的基因与人类疾病相关基因同源 (Science, 1998) 此外, 线虫易于进行基因操控, 通过喂食 dsrna 便能进行对目标基因的 RNA 干扰, 快速对基因功能进行分析 (Timmons et al., 1998) 并且, 线虫的性二形性利于进行遗传性研究, 雌雄同体的线虫通过自体受精保持基因型的延续性, 而雄虫通过与雌雄同体的线虫交配实现遗传杂交从而改变后代种群的基因型 (Corsi, 2006) 5. 秀丽隐杆线虫对微生物的防御机制 5.1 线虫的物理和生理保护机制 线虫作为捕食者也进化出了一套耐受细菌的保护机制 首先, 线虫拥有物理和生理机制保护增加对细菌的耐受能力, 厚实的角质层以及咽磨机的物理作用避免微生物在表皮上和肠道内定植 (Engelmann et al., 2010) 线虫表皮外层组份会随着幼虫不同的发育阶段而产生改变, 也会随着环境中的信号而发生改变 (Grenache et al., 1996), 从而被认为是防御致病菌的一种方法 (Davies et al., 2011) 而线虫的蜕皮机制则是一种简单且直接去除粘附于表皮致病菌的方法 (Taffoni et al., 2015) 同时, 线虫的蠕动能够避免细菌粘附于表皮和肠道细胞上 (Khalif et al, 2005) 5.2 线虫通过逃避行为躲避有害微生物 当线虫遭遇致病菌时, 往往面临两种选择 一种是利用自身的物理防御和 细胞内的防御机制从而对抗致病菌, 这一机制往往需要启动抗菌肽的合成以及 一系列细胞体内的应激反应 虽然这种机制在抵御致病菌方面非常有效, 但是 12

23 第一章绪论 从代谢水平来说, 这一过程需要耗费大量的能量, 同时也会对自身产生不利影响, 例如 : 由细胞免疫因子所造成的病理损伤或自身免疫性疾病的发生 (Schmid-Hempel, 2003) 另一种方法则是躲开致病菌, 虽然在逃避过程中同样需要耗费能量, 但是可以最大限度地减少感染的风险, 节省用于自身修复的能量开支 (Schmid-Hempel, 2003) 线虫含有由 302 个神经元所组成的神经系统, 其中 32 个被认为是化学感受神经元, 能够感知外部环境以及区分病原细菌 (Bargmann, 2006) 化学感知机制涉及 G 蛋白偶联受体及 G 蛋白信号途径, 例如 : 线虫利用一对化感神经 AWB 感知 S. marcescens Db10 所分泌的表面活性剂型环状脂多肽 AWB 表达多种 G 蛋白偶联受体, 敲除 G 蛋白偶联受体 grk-2 会影响线虫对细菌的区分能力 G 蛋白受体的功能需要 Gi 类蛋白, 敲除 Gi 类蛋白 ord-3, 致线虫逃避行为废止 AWB 神经的感知行为要求 cgmp 通道的参与, 敲除通道蛋白 tax-4/tax-2 导致线虫逃避行为消失 此外 tol-1 的基因缺失也会导致线虫逃避能力的下降 (Pradel et al., 2007) 金黄葡萄球菌分泌的休克综合症毒素 1(TSST-1) 和球菌肠毒素 C(SEC) 被线虫的 ADF 化感神经特异性识别, 当使用 tir-1 和 5- 羟色胺 (5-HT) 生物合成缺陷的突变线虫时, 逃避行为减弱 TSST-1 或 SEC 处理线虫时,5- 羟色胺合成关键酶 tph-1 的表达和 5- HT 的合成被上调, 证明 ADF 神经通过 p38 MAPK 途径合成 5-HT 介导线虫对金黄葡萄球菌的逃避行为 (Osanai et al., 2012) 另一对化感神经 OLL 中的 HECW-1 则会抑制线虫对 PA14 的逃避行为,HECW-1 具有两个 WW 结构域和 HECT 结构域, 是一种 E3 泛素化连接酶, 通过抑制神经肽受体 NPR-1 从而抑制线虫逃避行为 (Chang et al., 2012) 研究证实,NPR-1 促进线虫对 PA14 的逃避行为 (Reddy et al., 2009) 由此可见, 由化感神经介导的线虫对病原细菌的逃避行为是普遍存在的, 且化感神经能特异性识别和区分不同的细菌 5.3 线虫对细菌的识别机制 识别细菌是诱导型免疫机制中的首要过程, 哺乳动物通过模式识别受体 (PRR) 特异地与病原菌上高度保守且不存在于宿主当中的组份 (MAMPs) 结 合, 从而区分异源物质 (Akira et al., 2006) PRRs 包含肽聚糖识别受体 13

24 云南大学博士学位论文 (PGRP) 革兰氏阴性菌结合蛋白(GNBP) 核苷酸结合寡聚化结构域 (NOD) 以及 NACHT 结构域蛋白 然而在线虫中并不存在编码这些蛋白的基因 TIR 是另一种 PRR, 在脊椎动物中, 用于识别细菌的 DNA 或 RNA 线虫中唯一含有 TIR 结构域的是 TOL-1 和 TIR-1 然而针对 TOL-1 的研究发现,TOL-1 似乎并不参与线虫抵御细菌的机制 (Pujol et al., 2001), 而是参与线虫的逃避行为 (Pradel et al., 2007) 也有研究发现, 当敲除 tol-1 后, 线虫抵抗鼠伤寒沙门氏菌的能力减弱 (Tenor et al., 2008) 但因不能完全区分 tol-1 敲除后, 是导致逃避行为丧失还是抑制线虫的免疫机制, 而不能作为 tol-1 参与线虫抵抗细菌侵染的直接证据 (Irazoqui et al., 2010) 同时, 在对线虫肿瘤坏死因子受体相关因子 -1 同源基因 tnf-1 的研究发现,TNF-1 并不参与线虫对细菌的抵抗 IL-1 受体相关激酶 PIK-1 以及 NF-κB 的抑制因子 IKB-1 也都不参与线虫的免疫 其它识别病原微生物以及参与免疫的关键组份, 例如 TLR 接头蛋白 MYD88 和 NF-κB 家族的转录因子在线虫的基因组中都未被发现 (Ermolaeva et al., 2014) 然而, 有研究证明将 tir-1 敲除或是突变后, 线虫对细菌高度敏感 (Liberati et al., 2004; Couillault et al., 2004; Shivers et al., 2009) TIR 含有 Toll / IL-1R(TIR) 蛋白质相互作用结构域, 是一个支架蛋白 支架蛋白并未被严格的定义其功能, 这一类蛋白被认为作用或者结合多组份信号通路原件, 将它们绑定在一起形成复合物从而调控信号的传导 虽然不能排除线虫拥有与哺乳动物相似的病原菌识别机制, 但是能够激活线虫免疫反应的 MAMPs 及其受体目前尚未被发现 (Pukkila-Worley., 2016) 5.4 线虫对微生物的免疫机制 同其他无脊椎动物一样,C. elegans 并没有适应性免疫系统, 也没有特异性的免疫细胞 (Fares et al., 2001) 但是线虫拥有一套天然免疫机制 线虫的天然免疫机制由复杂的诱导型免疫系统构成, 调控合成抗菌因子, 特异地作用于致病细菌 (Ewbank., 2006) 线虫因其所处环境及其食物特点, 极易受到微生物的攻击, 尤其是表皮和肠道 表皮和肠道损伤都能启动信号传导通路从而激活免疫基因的表达 而表皮和肠道所激活的信号传导通路中, 有些具有特异性, 而 14

25 第一章绪论 有些则是共有的, 例如 :p38 MAPK 所介导的信号传导通路是一条能够介导表皮和肠道免疫反应的通路 ( 图 1.2) 在昆虫和哺乳动物中,p38 MAPK 所介导的信号传导通路是位于 TIR 下游的一个重要信号途径 (Dong et al., 2002) 通过对线虫在侵染 P. aeruginosa PA14 时的基因敲除筛选发现,nsy-1( 人体当中 ask-1 的同源基因 ) 和 sek-1(mkk3/mkk6) 是线虫耐受 PA14 侵染时的关键基因 在使用 RNA 干扰和生化分析后发现 p38 MAPK 的同源基因 pmk-1, 其功能作用于 nsy-1 和 sek-1 基因的下游, 同样参与对 PA14 的抵抗 故 NSY-1 SEK- 1 PMK-1,p38 MAPK 信号途径是线虫免疫反应中的关键免疫途径 研究同时证明了由丝裂原活化蛋白激酶所介导的天然免疫途径在不同物种间是高度保守的 (Kim et al., 2002) NSY-1 SEK-1 PMK-1 通过逐级磷酸化激活对 PA14 的抵抗, 而 PMK-1 的完全激活则是由 c-jun 氨基末端激酶 (JNK) 途径中的 MEK-1 介导的 在 mek-1( 哺乳动物中 MKK7 的同源基因 ) 基因功能缺失的情况下, PMK-1 磷酸化水平降低 (Kim et al., 2004) JNK 途径中, 编码磷酸酶的 vhp-1 ( 哺乳动物中 MPK7 的同源基因 ) 负调控 PMK-1 的激活通过抑制 PMK-1 的磷酸化, 研究证明 MEK-1 和 VHP-1 在整合不同应激机制以对抗 PA14 中的作用, 揭示了 p38 和 JNK 两条不同信号途径在抵抗 PA14 中的交叉调控机制 (Kim et al., 2004) 基因功能敲除实验证明 NSY-1 SEK-1 PMK-1 的上游基因为 tir-1 而非 tol-1,tir-1 敲除后 PMK-1 的磷酸化受到抑制 (Liberati et al., 2004) 线虫表皮感染或者损伤后会诱导线虫的表皮防御机制, 其中包括 : 启动抗菌基因的表达 抗菌基因编码神经肽类肽 (NLPs) 或 Caenacins (CNCs)(Pujol et al., 2012) 诱导 nlp 基因表达的机制, 是先表皮特异性的激活 G 蛋白偶联受体 DCAR-1, 而 DCAR-1 的激活是由配体 3-(4- 羟基苯基 ) 乳酸 (HPLA) 所介导的 表皮感染以及敲除 dyp-10 导致角质受损的情况下 HPLA 会大量产生, 故而 HPLA 在线虫中的作用可能是一个损伤相关的模式分子 (DAMP) 介导下游修复机制的启动 值得注意的是,HLPA 作为酪氨酸的衍生物, 在所有物种中都有发现 (Mrochek et al., 1973) 研究表明,DCAR-1 作用于 G α 蛋白 GPA-12 和 G β RACK-1 的上游 (Zugasti et al., 2014) 甘油二酰 (DAG) 是通过磷脂酶 C(PLC) 催化磷脂酰肌醇 (PIP2) 产生的第二信使, 通过对线虫中六个 PLC 的 RNA 干扰实验后发现,plc-3 和 egl-8 参与 DAG 的合成, 同时敲除实验证明, 15

26 云南大学博士学位论文 plc-3 和 egl-8 位于 TPA-1 的上游 之后的上位分析表明 GPA-12 位于 PLC-3 EGL-8 和 TPA-1 的上游 (Ziegler et al., 2009) TPA-1 是线虫中四个蛋白激酶 (PKC) 其中的一个, 拥有与 DAG 结合的结构域, 能够直接与 DAG 结合, 上调 nlp 的表达 通过对除 TPA-1 外的三个 PKC 基因敲除后发现,pkc-3 参与调控下游 nlp 基因的表达, 然而并不含有能够结合 DAG 的结构域 (Ziegler et al.,2009) 同时研究证明 TPA-1 和 PKC-3 作用于 TIR-1 的上游, 通过线虫 p38 MAPK 途径启动与 NLPs 相关的免疫机制, 抵御表皮感染或损伤 研究同时证明 Tribbles 类激酶 NIPI-3 位于 TPA-1 的上游且与 GPA-12 平行 (Ziegler et al., 2009) 另有研究证明钙调素调控的肿瘤抑制相关蛋白激酶 DAPK-1 能够抑制由 TIR-1 介导的 p38 MAPK 途径 (Tong et al., 2009) cnc 同 nlp 基因一样都能够编码抗菌肽增加线虫对侵染的抵抗能力, 但 cnc 仅表达于表皮 有趣的是, 在对 cnc 的研究中发现, 调控 cnc 的信号途径有别于 nlp(p38 MAPK 途径 ), 是一条独立的信号途径 当敲除 pmk-1 后并不会改变 cnc 表达量, 但敲除转化生长因子 TGF-β 同源基因 dbl-1 后,cnc 表达量大幅下调 线虫通过 DBL-1 介导的信号途径控制体形, 当 dbl-1 敲除后线虫体形小于野生型 DBL-1 通过与两个跨膜丝氨酸 / 苏氨酸激酶 SMA-6 和 DAF-4 形成的异构二聚体结合, 调控线虫体形 值得注意的是, 当敲除 sma-6 或 daf-4 都能消除由侵染导致的 cnc 表达量的升高 细胞内 Smad 信号转导同源基因 sma-2 sma-3 和 sma-4 位于 sma-6 和 daf-4 的下游, 共同参与对线虫体形的调控 (Savage-Dunn., 2005) 当敲除这些基因后发现, 仅有 sma-3 参与了对 cnc 表达量的调控 DBL-1 由神经分泌, 通过旁泌的方式启动非经典信号途径, 从而调控 cnc 表达量 (Zugasti et al., 2009) 线虫桥粒 (CeHD) 受损以后会激活 nlp-29 和 cnc-2 的表达量升高 但是与由 DAG 所介导的免疫途径不同的是,CeHD 所激活的免疫途径并不依赖 p38 MAPK 研究发现, 当 CeHD 受体 mup-4 及其胞外伴体 bli-1 被敲除后, 抗菌肽的合成激增, 而敲除 CeHD 相关基因则不会对抗菌肽的合成产生影响 敲除与免疫途径相关基因 gpa-12 tir-1 sek-1 pmk-1 dbl-1 sma-6 wnk-1 elt-3 sta-1 和 sta-2 后发现, 除 sta-2 以外, 其它基因敲除后并不能阻碍由 mup-4 功能缺失所造成的 nlp-29 和 cnc-2 的表达量增加 通过进一步研究发现,STA-2 与 CeHD 以及 MUP-4 间的空间关系 : 表皮未受损状态下,STA-2 与 CeHD 相结 16

27 第一章绪论 合, 并与受体 MUP-4 形成蛋白复合体 当 mup-4 和 bli-1 敲除后, 减少 STA-2 向胞外迁移, 致使大量 STA-2 累积在胞质中, 激活下游转录因子, 从而升高抗菌肽的表达 但目前的研究还未证实 STA-2 具体激活的下游转录因子 (Zhang et al., 2015) 线虫在被铜绿假单胞菌感染时 thn-2 lys-7 和 spp-1 免疫相关基因的表达受到抑制 研究发现, 由神经系统合成的胰岛素类肽 INS-7 与线虫肠道中唯一同源于哺乳动物胰岛素 IGF-1 家族的受体 DAF-2 结合 (Evans et al., 2008), 激活磷脂酰肌醇 3- 激酶 (P13K)AGE-1 AGE-1 磷酸化 4,5 二磷酸磷脂酰肌醇 (PIP2) 生成 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇 (PIP3) 转而激活丝氨酸 / 苏氨酸激酶 PDK-1 PDK-1 通过 AKT-1/AKT-2 磷酸化 DAF-16, 致使 DAF-16 滞留在细胞质中, 从而抑制 DAF-16 下游基因 thn-2 lys-7 和 spp-1 的表达 (Evans et al., 2008) 突变 daf-2 或 age-1 基因, 致使 DAF-16 迁移入细胞核, 从而增强线虫对细菌的抵抗能力 (Garsin et al., 2003) 通过基因敲除以及转录组分析发现, DAF-2 DAF-16 类胰岛素信号途径与 p38 MAPK 途径平行 (Troemel et al., 2006) 细菌在线虫肠道中定植时激活蛋白酶 D(PKD)DKF-2, DKF-2 主要在肠道中积累, 调控基因表达从而保护肠道细胞 同时也是信号传导途径中的重要组成部分 DKF-2 位于 PLC 和 DAG 下游,DKF-2 的激活启动由 PKD 介导的信号途径 dkf-2 基因的缺失导致线虫对细菌极度敏感 转录组分析发现, 由 DKF-2 激活而转录的 mrna 中存在编码抗菌肽的基因, 而敲除 pmk-1 导致 15 个由 DKF-2 介导的 mrna 转录受到抑制, 证明 PMK-1 是 DKF-2 下游的主要效应蛋白 (Islas-Trejo et al., 1997) 线虫体内的三种 PKC(pkc-1 pkc-2 和 tpa-1) 都有可能是调控 DKF-2 的原件 PKC-2 的激活需要 DAG 和钙离子的参与, 而 PKC-1 和 TPA-1 的激活则不需要钙离子的参与 (Islas-Trejo et al., 1997) 基因敲除 pkc-1 pkc-2 和 tpa-1 后发现,pkc-1 和 pkc-2 不参与对 DKF-2 的调控, 而当 tpa-1 敲除后, 线虫的存活率与 dkf-2 敲除的线虫相同, 证明两个基因位于同一条通路上 细胞特异性基因表达和上位分析表明 TPA-1 位于 DKF-2 的上游, 此外 DKF-2 可能磷酸化上游病原菌识别受体 TIR-1(Ren et al., 2009) 而之前有研究表明,DKF-2 可能抑制 VHP-1 的激活 (Kim et al., 2004) Gq 蛋白 α 亚 17

28 云南大学博士学位论文 基 (EGL-30) 在肠道中激活磷脂酶 C(EGL-8) 合成 DAG 转而激活 p38 MAPK 信号途径从而抵御致病菌的感染 (Kawli et al., 2010) Powell 等在对 14 个富含亮氨酸重复序列结构的受体进行敲除筛选后发现, 敲除 fshr-1( 促卵泡雌激素受体 FSHR 同源基因 ) 后线虫抵抗病原菌的能力下降 FSHR-1 主要表达于线虫肠 道内, 是抵御革兰氏阳性菌和阴性菌的关键原件, 且与 p38 MAPK 信号途径 平行 (Powell et al., 2008) 图 1.2 线虫肠道和表皮的免疫通路图片根据文献 : Kim et al., 2004; Zugasti et al., 2014; Ziegler et al., 2009; Savage-Dunn., 2005; Garsin et al., 2003; Ren et al., 2009; Powell et al., 2008; Zhang et al., 2015 进行绘制 Figure 1.2 C. elegans immunity pathways in intestine and hypodermis Picture was draw according to references: Kim et al., 2004; Zugasti et al., 2014; Ziegler et al., 2009; Savage-Dunn., 2005; Garsin et al., 2003; Ren et al., 2009; Powell et al., 2008; Zhang et al., 近期研究认为, 线虫是通过监控由病原菌感染或毒素分泌所导致的自身机 体生理功能损伤从而激活逃避 免疫 和解毒机制的 (McEwan et al., 2012; Dunbar et al., 2012; Melo et al., 2012), 例如 : 由铜绿假单胞菌分泌的毒素 A 18

29 第一章绪论 (exotoxin A) ETA ETA 剪断 NAD + 上的 C-N 糖苷键, 随后 ADP- 核糖转移至位于 EF2 结构域 IV 的白喉酰胺基团 ( 一种通过转录后修饰的组氨酸 )N3 原子上, 白喉酰胺基团糖基化最终导致宿主的蛋白合成受阻 (Yates et al., 2006) 线虫在受到 ETA 影响作用下能够激活线虫的免疫反应, 上调了一系列由 PMK-1 ZIP-2 调控的基因, 且大部分上调基因 (74%-79%) 与 PA14 侵染时上调的基因相同 研究同时还证明了, 线虫并不是通过识别毒素本身或者糖基化 EF2 来激活相关基因表达上调的, 而蛋白质合成的被抑制才是激活免疫相关基因的根本 (McEwan et al., 2012) Toxin A 并不是线虫在自然界中唯一面临能够抑制蛋白质翻译的毒素 在自然界中, 存在着一类能抑制蛋白质合成的毒素, 例如 : 类鼻疽伯克霍尔德菌 (Burkholderia pseudomallei) 分泌的波林菌素 (bactobolin) 作为毒力因子触发线虫蛋白质翻译功能损伤, 大量上调编码 UDP- 葡糖醛酸转移酶 ( 第二相解毒酶 )ugt-29 的表达 (Wong et al., 2016) 放线菌属细菌分泌的放线菌酮 (Cycloheximide) 通过阻止由 EF2 参与的 trna 由 A 位至 P 位的转移, 从而抑制肽链的延伸 (Schneider-Poetsch et al., 2010) 链霉菌属中分离得到的新霉素和巴龙霉素, 研究证明它们能够抑制核糖体亚基的合成从而抑制蛋白质翻译 (Mehta et al., 2003; McGaha et al., 2006) 通过 RNA 干扰技术选择性地沉默编码蛋白质翻译的基因, 同样能激活线虫致病菌相关以及外源化学物介导的防御机制, 例如 : 逃避行为 这种逃避行为是由神经内分泌轴进行调控的, 其中包括 : 血清素信号途径以及 c-jun 氨基端激酶信号途径 (Melo et al., 2012) 基因敲除组织特异性表达的基因导致线虫 germline 蛋白质翻译被抑制, 激活除免疫因子 IRG-1 外的第二相解毒酶 GST-4 和第三相解毒转运蛋白 PGP-5 的高表达 (Govindan et al., 2015) 以上的研究证明, 线虫通过监控蛋白翻译水平启动包括 : 释放免疫因子 解毒酶以及逃避行为的保护机制 在线虫自然生长坏境中分离得到的 560 种细菌中,18% 的细菌能导致线粒体内稳态失衡 (Liu et al., 2014) 故而在线粒体内稳态被破坏的情况下重新恢复线粒体的稳态是线虫不得不面对的自然选择压力 线粒体功能出现波动后会激活解毒基因如 cyp-14a3 ugt-61 的高表达, 说明线虫识别线粒体的这种功能波动为外源物质攻击, 从而激活解毒机制 (Liu et al., 2014) 线虫不仅可以通过 ATFS-1 进核, 启动线粒体未折叠蛋白反应 (UPR mt ) 途径激活下游伴体蛋白协 19

30 云南大学博士学位论文 助错误折叠蛋白重新折叠恢复线粒体稳态 同时还可以通过 ATFS-1 进核, 激活免疫因子的表达增加线虫对细菌耐受力 研究发现, 在铜绿假单胞菌 PA14 侵染过程中,ATFS-1 同样进核 而效应免疫基因 abf-2 lys-2 clec-4 和 clec- 65 的激活则是依赖于 ATFS-1, 其中抗菌肽基因 :abf-2 和分泌型溶酶体基因 lys-2 被证明是线虫对 PA14 感染耐受中必不可少的 ( Kato et al., 2002; Nandakumar et al., 2008) 在 atfs-1 被敲除的情况下, 线虫对 PA14 的抵抗能力降低 相反, 当 ATFS-1 被过度激活时, 线虫清除 PA14 的能力增加从而增加线虫的存活时间 研究同时证明, 免疫基因 irg-1 的表达不仅受到 ZIP-2 的调控, 也受到 ATFS-1 的调控, 揭示多个转录因子同时影响线虫免疫基因的表达 (Pellegrino et al., 2014) 同 RNA 干扰蛋白质翻译会引起线虫逃避行为一样, 在 RNA 干扰线粒体核心组份后线虫同样出现逃避行为, 且抗霉素 A 也同样能够激活线虫的逃避行为 (Melo et al., 2012) 链霉菌属所产生的抗霉素 A 结合位于线粒体内的细胞色素复合体 bc1 上的还原位点, 阻止电子在该复合体中的转移, 导致电子传递链 (ETC) 功能受到抑制 (Pietrobon et al., 1981) 以上的研究证明, 当线虫线粒体的功能被扰动时, 激活线虫逃避 解毒和免疫机制, 从而揭示了线虫监控防御机制在线粒体功能扰动时同样被激活 蛋白酶体通过识别泛素化的靶蛋白, 对特定蛋白进行降解 泛素 - 蛋白酶体途径是介导细胞内蛋白质降解, 维系机体内蛋白质水平的主要途径 抑制泛素 - 蛋白酶体途径也能激活免疫因子表达以及线虫逃避行为 (Bakowski et al., 2014; Melo et al., 2012) 同时 RNA 干扰编码蛋白酶体中核心亚基的基因后, 激活依赖于 SKN-1 的第二相解毒酶 gst-4 的高表达 (Kahn et al., 2008) 在自然界中存在损伤泛素 - 蛋白酶体途径的毒素, 例如 : 乳胞素是链霉菌属分泌的天然产物, 特异地与 20S 蛋白酶体的催化亚基结合, 抑制蛋白酶体的三种经典肽酶活性 : 胰凝乳蛋白酶样活性 半胱天冬酶样活性和胰蛋白酶样活性 (Fenteany et al., 1995) 同时乳胞素抑制肽链的水解通过抑制 26S 复合体以及泛素化 / 蛋白酶体介导的降解途径 (Craiu et al 1997) 另外,DNA 损伤能够增加线虫对感染的耐受力 通过交叉分析生殖腺 DNA 损伤所上调的 mrna 与铜绿假单胞菌 PA14 侵染后的线虫表达谱发现,DNA 损伤与 PA14 激活的免疫基因是相似的, 且依赖于细胞外调节激酶 MPK-1 20

31 第一章绪论 (Extracellular Regulated protein Kinases, ERK)(Ermolaeva et al., 2013) 暗示线虫可能是通过监控基因组的完整性, 作为启动保护性免疫机制的手段 综上所述, 除对蛋白质翻译以及线粒体功能进行监控外, 其它细胞核心进程的异常同样激活监控机制, 使线虫从行为 免疫和解毒几个方面具备应对环境改变的能力 ( 图 1.3) 图 1.3 线虫的监控保护机制图片来自 (Ermolaeva et al., 2013) Figure 1.3 Surveillance protection mechanisms in C. elegans (Ermolaeva et al., 2013) 6. 研究的目的与意义 在自然界中, 细菌与捕食者之间的 军备竞赛 不仅使我们有机会了解协同进化在生物学中的意义, 对 武器 和 防御装备 的研究更是推动现代医学和农业技术长足发展的助力 然而, 细菌对人类健康的威胁致使多数研究有选择性地偏向于致病菌, 而对一些致病性较弱或没有致病性的细菌则研究较少 这种偏向性导致我们对自然界中存在的, 细菌 捕食者之间相互作用关系的了 21

32 云南大学博士学位论文 解仍存在一些盲区 鼻疽诺卡氏菌拥有较为清楚的基因背景, 其全基因组在 2004 年便已完成测序 (Ishikawa et al., 2004) 鼻疽诺卡氏菌作为机会型致病菌, 据之前研究报道称, 由其引起的诺卡氏病多集中于免疫缺陷型和老年人群 在自然界中, 鼻疽诺卡氏菌面对拥有健全天然免疫系统的自身捕食者 秀丽隐杆线虫的捕食压力时, 是坐以待毙成为捕食者的牺牲品? 还是会响应捕食压力而启动相应的抵御机制? 其抵御机制是如何作用于线虫的? 这些疑问因目前尚未有研究探讨鼻疽诺卡氏菌与线虫的相互作用机制而仍然未知 相对的, 线虫拥有的天然免疫系统虽被证实能够抵抗多种致病菌, 例如 : 铜绿假单胞菌 鼠伤寒沙门氏菌和粘质沙雷氏菌等 (Ermolaeva et al., 2014) 然而, 我们对线虫所拥有的天然免疫系统是否足以抵抗鼻疽诺卡氏菌? 具体是通过哪种免疫机制进行抵抗的却知之甚少 本研究针对鼻疽诺卡氏菌和秀丽隐杆线虫的相互作用展开研究, 意在探索鼻疽诺卡氏菌应对线虫捕食压力的策略和机制, 在揭示存在于自然界中基础生物学现象的同时, 为开发鼻疽诺卡氏菌作为生防资源和致病机理的分析, 提供依据和理论基础 22

33 云南大学博士学位论文 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻 疽诺卡氏菌 1. 前言 秀丽隐杆线虫是一种非寄生 以细菌为食 生活在土壤中的线虫 (Wood et al., 1988) 1974 年, 从 Sydney Brenner 对线虫在分子以及发育方面的研究开始, 线虫便被当作模式生物广泛地运用于探索细菌致病因子 环境有害物 先天免疫以及长寿机制的研究中 基于这些研究目的, 线虫从自然栖息地被分离出来 特定的细菌被选择性地喂食给线虫, 作为单一的食物来源 在此前提下, 多种致病菌对线虫的影响得到了大量研究 自 1999 年开始, 大批这样的研究证实人类 动物 植物以及昆虫的致病菌都能杀线虫 (Sifri et al., 2005) 然后, 对于在自然状态下, 线虫所处微生物环境中非致病菌以及毒力较弱的致病菌则研究较少 近几年来, 随着野生线虫以及相关联微生物分离研究的增加, 野生线虫的生态得了更多的关注 (Félix and Duveau, 2012) 在法国北部以及西班牙南部, 不同的地理位置上, 从腐烂水果以及植物中分离得到线虫 通过 16S rrna 测序的方法, 验明自然环境中的线虫体内存在各类细菌, 其中最主要的是 : 变形菌门 拟杆菌门 厚壁菌门以及放线菌门中的细菌 80% 分离出的细菌显示, 在不引起线虫应激反应的条件下能够支撑线虫的生长繁育, 其中一些甚至优于实验中常采用的 E. coli OP50 饮食 而 20% 的细菌则会导致线虫的生长缓慢 死亡以及压力和病原菌效应基因的高量激活 (Samuel et al., 2016) 鼻疽诺卡菌作为土壤腐生放线菌的一种, 与线虫共享相同的生态位 虽然, 鼻疽诺卡菌被证实是一种机会性致病菌, 但目前尚未有相关研究探索其与线虫的相互关系 在本章中, 我们将对鼻疽诺卡与线虫成虫阶段的相互关系进行研究 2. 实验材料与方法 2.1 实验材料 23

34 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 实验用仪器 表 2.1 实验用仪器仪器名称 型号 厂家 生化培养箱 HP150S 武汉瑞华仪器 恒温培养箱 DNP-9162 上海精宏 恒温摇床培养箱 ITS-2102 天呈 生物显微镜 CX31 奥林巴斯 正置荧光显微镜 Axioskop 2 plus 蔡司 研究级显微镜 BX53 奥林巴斯 汞灯 EBQ 100 JENA GmbH ISOLATED-Z 荧光定量 PCR 系统 LightCycler 480 罗氏 超净工作台 SW-CJ-1FD AIR TEC 漩涡振荡器 MS3 IKA 低速冷冻离心机 5810R Eppendorf 移液器 0.5µl-1ml Eppendorf PCR 仪 Veriti Applied Biosystems 微波炉 EM-851B SANYO 纯水制备系统 Biocel Millipore 超低温冰箱 8800 Thermo science 高温烤箱 NDS-400 EYELA 蛋白质电泳仪 Bio-Rad 多功能酶标仪 SpectraMax M5 Tecan 实验用试剂 胰蛋白胨, 酵母粉, 氯化钠, 氯化钙, 七水硫酸镁, 七水磷酸氢二纳, 磷酸二氢纳, 磷酸二氢钾, 磷酸氢二钾, 氢氧化钠, 次氯酸钠, 无水乙醇, 异丙醇, 三氯甲烷, 甘油均购自上海生工 脑心浸出液肉汤 (BHI) 购自青岛 琼脂粉购自 BD 胆固醇,5- 氟脱氧尿苷 (FUDR), 异丙基 -β-d- 硫代半乳糖苷 (IPTG) 均购自 Sigma-Aldrich 羟苄青霉素 ( Carbenicillin ), 卡那霉素 (Kanamycin), 两性霉素 B(Amphotercin B), 焦炭酸二乙酯 (DEPC) 均购自索莱宝 TRIzon 购自 TAKARA 24

35 云南大学博士学位论文 实验用试剂盒 cdna 合成剂盒, 荧光定量试剂盒均购自 TAKARA 实验用培养基及配置方法 表 2.1:NGM 培养基 (1L) 试剂名称 计量 (g) 蛋白胨 2.5 氯化钠 3 琼脂粉 17 将除去琼脂粉的其余试剂溶于 800 ml 去离子水中, 溶解完成后定容为 1L, 分 装为 300 ml 于每个锥形瓶中并按比例加入琼脂粉, 高温高压灭菌 表 2.2:BHI 固体培养基 (1L) 试剂名称 计量 (g) 脑心浸出液肉汤 30 琼脂粉 10 同样先使用去离子水溶解脑心浸出液肉汤, 并定容至 1L, 分装为 300 ml 于每 个锥形瓶中按比例加入琼脂粉, 高温高压灭菌 表 2.3:LB 固体培养基 (1L) 试剂名称 计量 (g) 胰蛋白胨 10 氯化钠 10 酵母粉 5 琼脂粉 20 使用去离子水溶解除琼脂粉外的其它试剂, 溶解完成后定容为 1L, 分装为 300 ml 于每个锥形瓶中, 并按比例加入琼脂粉, 高温高压灭菌 RNA 干扰用培养基 : 在 300 ml NGM( 其制备方式同上 ) 培养基中, 加入 300 µl 浓度为 100 µmol/l 的 IPTG 以及 300 µl 浓度为 100 mg/ml 的氨卡青霉素, 混合 均匀后倒入培养皿中, 待其凝固后方可使用 25

36 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 LB 液体培养基 (1L) 同 LB 固体培养基配置方法相同, 仅除去琼脂粉成份, 分装入锥形瓶中进行高 温高压灭菌, 备用 BHI 液体培养基 (1L) 同 BHI 固体培养基配置方法相同, 仅除去琼脂粉成份, 分装入锥形瓶中进行高 温高压灭菌, 备用 实验用溶液的配制方法 表 2.4: 磷酸盐缓冲液 (1L) 试剂名称计量 (g) 磷酸氢二钾 21.5 磷酸二氢钾 119 使用去离子水溶解后定容至 1L, 然后用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 置于高温高压灭菌处理过的蓝盖瓶中,4ºC 保存备用 1 M CaCl 2 (1L) 溶液 : 称取 111 g 无水氯化钙, 使用去离子水溶解后定容至 1L, 然后用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 置于高温高压灭菌处理过的 蓝盖瓶中,4ºC 保存备用 1 M MgSO 4 (1L) 溶液 : 称取 246 g MgSO4 7H2O, 使用去离子水溶解后定容 至 1L, 然后用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 置于高温高压灭菌处理过 的蓝盖瓶中,4ºC 保存备用 胆固醇溶液 (200 ml): 称取胆固醇 100 mg, 使用无水乙醇溶解后定容至 200 ml, 使其终浓度为 5 mg/ml, 因胆固醇较难溶解需要使用磁力搅拌器溶解, 溶解时间不易过长, 避免乙醇蒸发, 导致浓度误差 溶解完成后 0.22 µm 孔径的有机相滤膜进行除菌过滤, 置于高温高压灭菌处理过的蓝盖瓶中,4ºC 保存备用 26

37 云南大学博士学位论文 100 mg/l 羧苄青霉素 : 称取 1 g 羧苄青霉素粉末充分溶解于 10 ml 的去离子水 中, 使用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 分装于 2 ml 灭菌处理后的 EP 管中, 置于 -20ºC 中保存备用 50 mg/l 卡那霉素 : 称取 0.5 g 卡那霉素粉末充分溶解于 10 ml 的去离子水中, 使用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 分装于 2 ml 灭菌处理后的 EP 管中, 置于 -20ºC 中保存备用 0.25 mg/l 两性霉素 B: 称取 2.5 mg 两性霉素 B 粉末充分溶解于 10 ml 的去离 子水中, 使用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 分装于 2 ml 灭菌处理后的 EP 管中, 使用锡箔纸包裹 EP 管避光, 置于 -20ºC 中保存备用 100 µm IPTG : 称取 240 mg 异丙基 -β-d- 硫代半乳糖苷粉末溶解于 10 ml 的去离 子水中, 使用 0.22 µm 孔径的滤膜进行除菌过滤后, 分装于 2 ml 灭菌处理后的 EP 管中, 置于 -20ºC 中保存备用 表 2.5: 线虫裂解液 (5 ml) 试剂名称 剂量 (ml) 5M NAOH 0.3 次氯酸钠 1.2 去离子水 3.5 将上述试剂按计量混合均匀, 置于避光处, 现配现用 表 2.6:M9 缓冲液 (1L) 试剂名称 剂量 (g) 磷酸二氢钠 3 七水磷酸氢二钠 5.8 氯化钠 5 七水硫酸镁 0.25 先称取七水硫酸镁, 使用去离子水溶解后定容至 10 ml, 再使用 0.22 µm 孔径的 滤膜进行除菌过滤后备用, 称取除七水硫酸镁以外的其它试剂, 使用去离子水 溶解后定容至 990 ml, 分装后高温高压灭菌, 冷却后加入之前制备好的七水硫酸 27

38 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 镁溶液, 室温保存 三抗 M9 缓冲液 (1L): 在制备好的无菌 M9 中加入 100 mg/l 羧苄青霉素 1 ml 50 mg/l 卡那霉 1 ml 素和 0.25 mg/l 两性霉素 B 1 ml 混合均匀后置于 4ºC 保 存备用 表 2.7: 线虫冻存液 (1L) 试剂名称 氯化钠磷酸二氢钾 glycerol 1M NaOH 剂量 5.58 g 6.8 g 300 ml 5.6 ml 使用去离子水溶解后定容至 1L, 高温高压灭菌后, 加入除菌过滤处理过的 MgSO µl 按 1:1 的比例加入需保存的线虫中, 混合均匀后 -80 C 冻存 表 2.8:5X 电泳缓冲液 (1L) 试剂名称 剂量 (g) Tris-base 15 Glycine 72 SDS 5 使用去离子水溶解后定容至 1L, 再使用 HCL 调节 ph 至 8.3, 室温保存 表 2.9:5X 转膜缓冲液 (1L) 试剂名称剂量 (g) Glycine 72 Tris-base 15 使用去离子水溶解后定容至 1L, 使用时稀释为 1X 并加入 10% 的甲醇, 现配现用 表 2.10:10X TBS 缓冲液 (1L) 试剂名称 剂量 (g) 氯化钠 80 氯化钾 2 Tris-base 30 使用去离子水溶解后定容至 1L, 再使用 HCL 调节 ph 至 7.4 表 2.11:1X TBS-T 缓冲液 (1L) 试剂名称 1XTBS Tween-20 剂量 1 L 1 ml 28

39 云南大学博士学位论文 5% BSA 封闭液 (40 ml): 称取 2 g BSA 溶解于 40 ml 的 TBST 中, 混合均匀, 4ºC 保存 转基因和突变 C. elegans 线虫株 表 2.12: 转基因和突变 C. elegans 线虫株 C. elegans 线虫株 来源 C. elegans: N2 昆明动物所梁斌老师赠 C. elegans: KU25(pmk-1(km25)IV) CGC C. elegans: PJ1109(mpk-1(n2521)III;let-60(ga89)IV) CGC C. elegans: VC8(jnk-1(gk7)IV) CGC C. elegans: JIN1375(hlh-30(tm1978)IV) CGC C. elegans: skn-1(tm3411) 昆明动物所梁斌老师赠 C. elegans: AU3(nsy-1(ag3) II) CGC C. elegans: AU1(sek-1(ag1) X) CGC C. elegans: LD1(SKN-1b/c::GFP + rol-6(su1006)) CGC C. elegans: IG1107(nlp-29p::gfp + col-12p::dsred) CGC C. elegans: LD1171(gcs-1p::gfp + rol-6(su1006)) CGC C. elegans: CL2166((pAF15)gst-4p::gfp::NLS) CGC 菌株 大肠杆菌 E. coli OP50, 由昆明植物所罗怀容老师所赠, 鼻疽诺卡氏菌 Nocardia farcinica 由土壤中分离得到 定量 RT-PCR 引物 表 2.13: 定量 RT-PCR 引物 Gene nlp-29-f nlp-29-r F08G5.6-F F08G5.6-R F35E12.5-F F35E12.5-R Y37A1A.2-F Y37A1A.2-R gst-4-f gst-4-r Sequences 5 -TGTTCTTGTCGTCCTTCTCG-3 5 -CCATAGCCTCCATACATTCCTC-3 5 -TGTGGCAAAGGAGAGGATG-3 5 -ACGGTAGATTGCTAATGGGTTC-3 5 -ACTGTCAGAGCAGCAAATAACG-3 5 -AAAGCGGTGTAATCAGGTCC-3 5 -TTCTGTCGTCTGGATTGGC-3 5 -CGAGAGATAACGGCTTGGTG-3 5 -TTGATGCTCGTGCTCTTGC-3 5 -CAAATGGAGTCGTTGGCTTC-3 29

40 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 gcs-1-f gcs-1-r Actin-F Actin-R 5 -TGAATGCGATGCTTGGAACT-3 5 -ACTCCAAGAGATGGGAACGA-3 5 -TCCTGACCCAAAGAACACGGT-3 5 -ATCCACCTGCTCCTCCTGAG 实验方法 线虫培养 1) 接种 E. coli OP50 于 300 ml 液体 LB 培养基中, 置于恒温摇床培养箱中, 180 rpm,37ºc,24 小时 2) 300 ml NGM 培养基加热溶解后, 冷却至 60ºC, 加入磷酸盐缓冲液 6 ml 1 M MgSO µl, 1 M CaCl µl 和 5 mg/ml 胆固醇溶液 300 µl, 混合均匀后倒入 60 mm 培养皿中, 待其凝固, 期间打开紫外线灯照射 20 分钟 3) 每个培养皿中加入 1-2 ml OP50 菌液, 均匀涂布, 在超净工作台中吹干 如需培养的线虫数量较多, 可将 OP50 菌液收集于离心管中,7000 rpm, 22ºC, 离心 2 分钟, 去除大量上清, 留少许液体, 用移液器反复吹打使沉淀溶解后, 取 1 ml 菌液均匀涂布培养皿的 2/3 面积并吹干 4) 将线虫接种于涂布了 OP50 的 NGM 板上 可直接接种线虫, 也可将原含有线虫的培养基切下一块面朝下置于新准备的 NGM 板上 5) 放置于 20ºC 恒温培养箱中培养 线虫的冻存与复苏 线虫冻存 1) 将需要冻存的线虫置于含有 OP50 的 NGM 培养基上培养 3-4 天, 待有大量 L1-L2 幼虫出现时, 即可收集线虫进行冻存 2) 使用 M9 缓冲液将线虫从培养基上冲洗下来, 自然沉淀 1 分钟, 取上清, 弃沉淀, 将上清转移至新的离心管中, 自然沉淀 10 分钟 沉淀即为 L1-L3 幼虫 30

41 云南大学博士学位论文 3) 将收集的 L1-L3 线虫, 用 M9 冲洗 2-3 次 4) 取 500 µl 转移到高温高压处理过的 EP 管中, 加入 500 µl 冻存液, 混合均匀, 置于 -80ºC 保存 线虫复苏 1) 将冻存的线虫从 -80ºC 取出, 置于冰上, 待其完全溶解 2) 3000 rpm 22ºC 离心 2 分钟, 弃上清, 留沉淀 3) 将离心后的沉淀加入含有 OP50 的 NGM 培养基上, 培养 4-5 天 4) 待有 条线虫复苏后, 使用三抗 M9 缓冲液, 将线虫从培养基上冲洗下, 洗涤 3-4 次后, 置于新的线虫培养皿中, 继续培养 3-4 天后同步化线虫 线虫同步化 线虫不同生长时期在应对极端环境, 例如 : 暴露于化学品 低温 高温 病原微生物线以及饥饿时所表现出的耐受能力不同, 且异时基因的表达决定了 使用相同生长时期线虫为实验对象的重要性 1) 将培养 2-3 天的线虫置于显微镜下观察, 线虫母体中卵呈直线排列, 且培养皿中幼虫较少, 即为开始同步化的最佳时期 2) 使用 M9 缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来, 冲洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下, 从而影响线虫在裂解过程中的效率 3) 将冲洗下来的线虫装入 15 ml 离心管中, 再加入适量 M9 缓冲液至 14 ml, 自然沉淀 3-5 分钟, 去除上清, 再重新加入 M9 缓冲液至 14 ml 冲洗线虫 此步骤需重复 4-6 次, 直至上清变为清澈液体为止, 尽量将细菌洗涤干净 4) 将多余上清移除后, 向洗净的线虫中加入 1-2 ml 线虫裂解液 ( 裂解液不应超过 2 ml) 31

42 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 5) 剧烈振荡 (3000/min)2-5 分钟 ( 不应超过 5 分钟 ), 振荡 2 分钟后, 每 30 秒肉眼观察一次, 线虫出现断裂后, 每 15 秒观察一次, 直至线虫虫体完全消失 裂解完成后, 液体应充满颗粒状物体且无虫体 6) 向裂解完成的离心管中加入 M9 缓冲液至 15 ml, 离心 2 分钟,4000 rpm, 20 C 7) 用移液器吸除上清, 留 3 ml 液体 ( 注意不要吸到沉淀 ) 重新加入 M9 缓冲液至 15 ml 8) 重复步骤 次, 直至无次氯酸钠气味为止 9) 尽量将上清移除干净后, 加入 5 ml M9 缓冲液, 用移液器轻柔吹打, 使沉淀悬浮后, 将液体转移至 35 mm 培养皿中 10) 使用显微镜对完成同步化后的液体进行镜检, 此时线虫卵形态应为完整椭圆形, 内部结构清晰, 无破裂 20 C 恒温培养 18 小时后可达到 95% 以上的卵孵化 线虫 RNAi 分析实验 RNAi 是存在于许多真核生物中的一种天然细胞内调控机制, 利用这一特点, RNA 干扰技术被普遍地用于调控基因表达的研究中 RNAi 所包含的双链 RNA (dsrna) 与其互补序列结合, 达到对含有该段序列的特定基因进行选择性地沉默 RNAi 技术被广泛地用于线虫研究中, 因其 RNAi 基因沉默表型是可遗传的 ( 从亲本传递到后代的子代 ), 且易于操作, 将携带有目的片段质粒 (L4440) 的大肠杆菌, 置于含有 IPTG 的培养基上诱导产生 dsrna 喂食线虫后 dsrna 通过肠道转移至线虫体内达到对特定基因表达的调控 RNAi 质粒 (L4440) 通常包含两个 T7lac 启动子, 在启动子之间是一段编码靶基因的序列, 且质粒上携带有氨苄青霉素的抗性基因作为筛选标记 L4440 质粒转入 E. coli HT115, HT115 是一种核糖核酸酶 III 缺陷型大肠杆菌菌株, 通过 IPTG 诱导其 T7 聚合酶活性, 从而产生 dsrna 不携带靶基因序列的空白 L4440 质粒的 E. coli HT115 菌株则作为实验中的对照组喂食 32

43 云南大学博士学位论文 1) 将所需 RNAi 菌株从线虫 RNA 干扰文库中取出, 置于冰上, 之后在超净工作台中使用灭菌接种环, 将 RNAi 菌株接种于含有 100 µg/ml 羧苄青霉素青的 LB 固体培养基上,37 C 恒温培养过夜, 进行复苏 含有空白载体的 HT115 菌株的复苏方法以及所用培养基与 RNAi 菌株相同 2) 将复苏好的 RNAi 菌株以及空载体 HT115 菌株, 转接至含有 100 µg/ml 羧苄青霉素青的液体 LB 中, 放置于恒温摇床中,37ºC,180 rpm, 培养 16 小时 3) NGM 培养基加热溶解后, 冷却至 60ºC, 每 300 ml 培养基里加入 1 M 磷酸盐缓冲液 6 ml 1 M MgSO µl 1 M CaCl2 300 µl 以及 5 mg/ml 胆固醇 300 µl 1 M IPTG 诱导剂 300 µl 100 mg/ ml 的羧苄青霉素 300 µl, 混合均匀后倒入 35 mm 培养皿中, 待其凝固 4) 在超净工作台中, 向之前配置好的 NGM+IPTG 培养皿中, 加入 500 µl RNAi 菌液或空载体 HT115 菌液, 均匀涂布, 吹干 5) 将吹干后的培养皿置于 25ºC 恒温培养箱中, 培养 12 小时, 以诱导 dsrna 的合成 6) 将同步化后的 L1-L2 线虫, 移至 1.5 ml EP 管中, 离心,3000 rpm, 室温,3 分钟, 以便去除 M9 缓冲液 ( 此时 L1-L2 沉淀于 EP 管管底 ) 7) 将 L1-L2 线虫从管底吸出, 转移至含有干扰菌株或空载体 HT115 且已诱导完成的 NGM 培养基中,20ºC 恒温培养 小时直至线虫发育至 young adult, 之后用于文中所涉及的 RNA 干扰实验中 而针对线虫卵的 RNAi, 则是将发育至 young adult 的线虫继续进行 RNA 干扰直至产卵 鼻疽诺卡氏菌侵染线虫实验 1) 复苏鼻疽诺卡氏菌 Nocardia farcinica, 先将 N. farcinica 接种于固体 BHI 培养基,37ºC 恒温培养,48 小时, 因 N. farcinica 为需氧型细菌, 故而培养过程中不应使用封口膜封合培养皿 2) 将复苏好的 N. farcinica, 转接入 5 ml 液体 BHI 培养基中, 放入 37ºC 恒温摇床培养箱中, 180 rpm, 培养 48 小时 3) BHI 培养基加热溶解后, 冷却至 60ºC, 每 300 ml 培养基里加入 1 M 磷酸盐 33

44 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 缓冲液 6 ml 1 M MgSO4 300 µl 1 M CaCl µl 以及 5 mg/ml 胆固醇 300 µl, 混合均匀后倒入 35 mm 培养皿中, 待其凝固 4) 在超净工作台中, 向每个 BHI 培养皿中, 加入 200 µl N. farcinica 菌液或 OP50 菌液, 均匀涂布, 吹干 5) 将吹干后的培养皿置于 37ºC 恒温培养箱中, 培养过夜后, 转入 25 ºC 恒温培养箱中继续培养 12 小时以备后续实验使用 6) 使用三抗 M9 将 young adult 线虫从常规 NGM 培养基或干扰培养基上洗下, 用三抗 M9 缓冲洗涤线虫 4-6 次, 去除细菌 再使用 M9 缓冲液洗涤线虫 3-4 次去除残留抗生素避免影响后续实验 7) 在每个含有 N. farcinica 菌群或 OP50 菌群的 BHI 培养皿中加入 条 young adult 线虫 N2, 或基因突变线虫, 或 RNAi 后的线虫,25 ºC 恒温培养 8) 观察线虫形态 寿命或者生存率等 针对寿命以及生存率的统计分析 : 每 24 小时计数一次, 记录存活线虫数目 使用铂针刺激线虫, 无反应者既判定为死亡 9) 每次实验中的每个实验组设有三个平行, 且实验重复三次 线虫逃避实验 1) 在 BHI 培养基中央加入 20 µl 液体培养的 OP50 或 N. farcinica,37ºc 培养过夜, 细菌在培养基中央形成圆形菌苔后置于 25ºC 培养 12 小时 2) 将同步化后的线虫置于含有 OP50 的 NGM 板上培养直至发育到 young adult 3) 使用三抗 M9 将 young adult 线虫从常规 NGM 培养基上洗下, 用三抗 M9 缓冲洗涤线虫 4-6 次, 去除细菌 再使用 M9 缓冲液洗涤线虫 3-4 次去除残留抗生素避免影响后续实验 4) 将 条线虫加入 1) 中制备好的菌苔中央 5) 分别于 4 小时,8 小时和 24 小时后观察统计, 滞留在菌苔中的线虫数目以及离开菌苔的线虫数目 6) 每次实验中的每个实验组设有三个平行, 且实验重复三次 34

45 云南大学博士学位论文 显微镜分析实验 1) 使用 M9 缓冲液将需显微镜分析的线虫从培养基上冲洗下来, 自然沉淀后, 再用 M9 洗涤线虫 2-3 次, 移除上清 2) 条线虫置于载玻片中央, 盖上盖玻片, 将边缘多余液体用吸水纸擦净 3) 蔡司 Axioskop 2 plus 正置荧光显微镜用于检测带有荧光报告基因的线虫样本 针对线虫样本的形态变化及组织变化使用奥林巴斯 BX53 正置显微镜微干涉相差 (DIC) 检测, 目镜 10X 物镜根据整体/ 局部需要选择 10X, 20X, 40X 或 100X 4) 使用相同曝光时间以及放大倍数, 检测同一基因在实验组和对照组中的表达 而针对 DIC 检测则使用相同放大倍数, 镜检相同培养时间下, 线虫实验组和对照组的形态 组织和发育情况 5) 图片标尺以及荧光强度皆使用软件 IamgeJ 进行绘制及测量 RT-PCR 实验 线虫总 RNA 提取 1) 实验所用枪头 EP 管 PCR 管均使用 1 DEPC 水浸泡 24 小时后, 高温高压灭菌备用 用锡箔纸将研钵 研棒 不锈钢小勺包好后, 于高温烤箱中, 180ºC 烘烤 4 小时备用 2) 用 M9 将线虫从培养皿上洗下之后, 装入离心管, 再使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除细菌 3) 将线虫加入研钵中, 倒入液氮, 使用研棒快速研磨, 重复研磨 3-4 次 4) 将研磨好的粉末转移至 1.5 ml EP 管中, 加入 1 ml TRIzol, 混合均匀 5) 剧烈振荡 30 秒, 立即将 EP 管置于冰上 30 秒, 如此重复 4-5 次之后, 静置于室温 5 分钟 6) rpm 4ºC 离心 10 分钟, 弃沉淀, 将上清液转入新的 EP 管中 35

46 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 7) 加入 200 µl 三氯甲烷, 剧烈振荡 15 秒, 室温静置 3 分钟 8) rpm, 4ºC 离心 15 分钟, 吸取水相转移至新的 EP 管中 9) 加入 500 µl 异丙醇, 颠倒混匀, 室温静置 5 分钟 10) rpm, 4ºC 离心 10 分钟, 小心吸除全部异丙醇, 留沉淀 11) 加入 1 ml 75% 乙醇, 用移液枪反复轻柔吹打, 悬浮沉淀 12) 8000 rpm, 4ºC 离心 5 分钟, 尽量吸干上清留沉淀, 超净台里风干 3 分钟 13) 加入 30 µl-50 µl 无菌 DEPC 水, 用移液枪反复吹打, 溶解沉淀 如需保存, 需放置于 -80 ºC 保存 cdna 合成 1) 基因组去除所用试剂盒为 TAKARA PrimeScript RT reagent Kit with gdna Eraser, 反应体系 (10 µl) 如下 : 试剂名称 剂量 (µl) Total RNA 2 5X gdna Eraser buffer 2 gdna Eraser 1 RNase Free ddh 2 O 5 2) 设置 PCR 仪温度为 42ºC, 反应 2 分钟 ( 反应过程中不加热顶盖 ) 完成后 立即放置于冰上 3) 向上述的反应物中加入 : 试剂名称 剂量 (µl) 5 PrimeScript Buffer 2 4 RT Prime Mix 1 PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 RNase Free ddh 2 O 4 4) PCR 仪 37ºC 反应 15 分钟,85ºC 反应 5 秒 ( 反应过程中不加热顶盖 ) 完 成后 -20ºC 保存 RT-PCR 操作流程 1) 实验中荧光定量试剂盒为 TAKARA 反应体系 (20 µl) 如下 : 试剂名称剂量 (µl) 36

47 云南大学博士学位论文 SYBR Premix Ex Taq II 10 µl Primer F 0.8 µl Primer R 0.8 µl cdna 1.6 µl ddh 2 O 6.8 µl 2) RT-PCR 程序设置如下 : 循环 温度 时间 1 X 95ºC 5 min 95ºC 10 sec 40 X 60ºC 20 sec 72ºC 20 sec 熔解曲线分析 95ºC 5 sec 1 X 65ºC 1 min 97ºC N/A 蛋白免疫印迹 (Western blotting) 线虫蛋白提取 1) 使用 M9 将线虫分别从 OP50 板或鼻疽诺卡氏菌板上洗下, 自然沉淀, 去除上清, 反复洗涤 3-4 次, 将线虫洗涤干净 2) 液氮反复研磨 3-4 次, 将研磨后的粉末收集至 EP 管中, 按 100:100:1 : 10 的比例, 每 100 µl 线虫加入 100 µl 蛋白裂解液 1 µl 蛋白酶抑制剂 (PMSF) 和 10 µl 磷酸酶抑制剂 颠倒混匀后, 冰上静止 30 分钟 3) rpm,4ºc 离心 5 分钟, 此时 EP 管中分为三层, 最低层为沉淀, 最上层液相是线虫的脂肪为乳白色, 小心吸取中间液相转移至新的 EP 管中, 如最上层液相在吸取中间液相过程中与中间液相混合, 需重新离心 4) 除预留少量蛋白粗提液做蛋白含量检测外, 其余部分按比例加入含有 SDS 的上样缓冲液, 煮沸 5 分钟, 使蛋白完全变性 蛋白含量测定 37

48 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 使用二辛可酸 (BCA) 法测定蛋白含量 : 1) 按照 50:1 的比例将 BCA 试剂 A 和 B 混合均匀, 置于冰上备用 2) 每孔加入 200 µl 的 BCA 工作液 3) 按照下面表格的方式加入标准品 (0.5 mg/ml): 孔号 标准品 (µl) ddh 2 O(µl) ) 待测样品 2 µl 用去离子水补足 20 µl 后加入 200 µl BCA 工作液, 充分混匀 5) 37ºC 孵育 30 分钟 6) 使用酶标仪检测吸光度后, 绘制标准曲线, 再按照标准曲线计算出待测样 品的浓度 SDS-PAGE 蛋白电泳 根据所检测蛋白配置相应浓度的凝胶, 蛋白分子量越大需要的凝胶浓度越小, 反之亦然 1) 凝胶配置 : 先将胶板夹好后, 固定于架子上, 使用去离子水灌入胶板中, 静止 15 分钟, 检测无漏液情况后, 将去离子水倒出 将配置好分离胶快速加入胶板中, 注意加液过程中不能出现气泡 分离胶加至胶板 2/3 处即可, 随后缓慢均匀的加入去离子水压平液面 室温静止 45 分钟, 出现明显折线后, 倒出去离子水, 加入浓缩胶, 插入梳子, 静止 30 分钟 2) 上样 : 将配置好的胶板固定到胶槽中, 倒入 1X 电泳缓冲液, 轻缓拔出梳子, 蛋白上样量为 80 µg 加入样品, 在样品边上的孔中加入蛋白 Marker 以便标记蛋白大小, 同时便于观察电泳情况 3) 电泳 : 点完样品后, 安装好电泳装置, 接通电压, 恒压 80 V,30 分钟, 待样品从浓缩胶转移至分离胶时改为恒压 100 V, 当溴酚蓝迁移至胶底部, 且蛋白 Marker 充分分离后即可停止 转膜 38

49 云南大学博士学位论文 1) 根据目的蛋白的位置和大小, 裁剪 PVDF 膜, 将裁剪好的 PVDF 膜先置于甲醇中浸泡, 再放入配置好的含有甲醇的 1X 转膜缓冲液进行平衡 2) 将蛋白胶从电泳槽中取出, 从胶板上方小心将胶板撬开, 将浓缩胶切除, 再根据目的蛋白所在的位置, 切除周围多余的凝胶 将凝胶从玻璃板上轻轻取下浸泡于含有甲醇的转膜缓冲液中进行平衡 3) 转膜所需的转膜夹和海绵用含有甲醇的转膜缓冲液完全浸湿, 按照海绵, 滤纸, 胶,PVDF 膜, 滤纸, 海绵的顺序将转膜所需材料放置于转膜夹上, 过程中不能产生气泡, 扣紧转膜夹 4) 将转膜夹放入电转槽中, 白面对应电转槽的红面, 黑面对应电转槽的黑面, 安装好电转槽后, 将电转槽置于装有大量冰块的盆中 由于转膜期间会产生大量的热, 而冰块有助于在转膜过程中减低温度, 使整个转膜过程处于一个相对低温的环境 接通电源, 恒流 300 ma,2 小时 封闭 平衡过的 PVDF 膜带电, 故而在转膜过程中能够吸附蛋白, 而没有蛋白的部分在使用抗体孵育时同样会吸附抗体, 这样就会造成非特异性条带的产生以及背景杂乱 封闭的目的在于使用非抗原蛋白将 PVDF 膜上的空余部分填满, 避免非特异性地与抗体结合, 常用封闭试剂有 : 脱脂奶粉和 BSA 一般情况下, 两者都可以作为封闭试剂来使用, 但是由于脱脂奶粉中含有磷酸化蛋白, 当检测磷酸化水平时, 不能使用脱脂奶粉而仅能使用 BSA, 本研究所使用的封闭液为 5% BSA,4ºC 封闭过夜 抗体孵育 1) 将封闭好的膜取出, 使用 TBST 置于摇床振荡器上, 洗涤三次, 每次 3 分 钟 2) 一抗抗体按照厂家说明书以 1:1000 的比例使用 TBST 进行稀释 39

50 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 3) 将膜放入封闭袋中再将稀释好的一抗抗体, 缓慢加入封闭袋中, 过程中不能产生气泡, 在确认抗体均匀覆盖膜以及无气泡产生后,4ºC 孵育过夜 4) 一抗孵育完成后, 将膜从封闭袋中取出, 使用 TBST 洗涤三次, 每次 3 分钟 5) 二抗抗体按照 1:5000 的比例使用 TBST 进行稀释, 使用稀释好的二抗抗体孵育清洗好的膜, 室温孵育 2 小时 6) 二抗孵育完成后, 将膜取出, 再使用 TBST 洗涤三次, 每次 3 分钟 7) 将显色液均匀滴加至 PVDF 膜上, 使用凝胶成像仪对膜进行分析和拍照 统计学分析 在本研究中, 数据的统计分析使用软件 GraphPad Prism 4, 每组独立生物学重复中的平均数 (Mean) 和标准差 (SD) 被用于统计学分析 生存率统计使用 log-rank test Two-tail unpaired Student s t test 用于两组之间差异 P 值的计算 One-way ANOVA 和 Student-Newman-Keuls 用于分析多组之间差异的分析 3. 实验结果 3.1 鼻疽诺卡氏菌不影响线虫成虫寿命 许多机会性致病菌都能杀死线虫, 例如 : 铜绿假单胞菌 金色葡萄球菌以及粪肠球菌等 鼻疽诺卡氏菌作为机会性致病菌的一种, 是否具有相同的杀线虫能力, 目前尚未有研究报道 为了探究鼻疽诺卡氏菌是否能够杀线虫, 本研究实验组使用鼻疽诺卡氏菌在 25ºC 的条件下, 喂食幼年成虫阶段 (young adult) 的线虫 对照组则使用线虫食物细菌大肠杆菌 OP50, 在相同温度下喂食线虫以观察线虫的存活情况 结果发现, 线虫喂食鼻疽诺卡氏菌后与喂食 OP50 相比, 寿命相同 ( 图 2.1A) 之前研究表明, 线虫在面对致病菌时会展现出逃避行为 (Chang et al., 2011) 为了验证鼻疽诺卡氏菌是否同样会促使线虫逃避, 本研究使用鼻疽诺卡氏菌和 OP50 喂食线虫, 观察和统计 4 小时 8 小时以及 24 小时的逃避数量 结果发现, 喂食 4 小时后, 约 97% 线虫留在鼻疽诺卡氏菌的菌 40

51 云南大学博士学位论文 苔当中 ( 图 2.1B) 在喂食 8 小时后, 线虫滞留在鼻疽诺卡氏菌苔当中的数量几乎没有变化 ( 图 2.1B) 铜绿假单胞菌 PA14 在喂食初期会吸引线虫, 几个小时后线虫才会表现出逃避行为 (Chang et al., 2011), 为了排除鼻疽诺卡氏菌同样具备初期吸引线虫的能力, 我们将喂食的时间进一步延长至 24 小时 实验发现, 滞留在鼻疽诺卡氏菌苔上的线虫数目还维持在 92% 左右, 而喂食 OP50 的线虫并未出现逃避行为 ( 图 2.1B) 以上研究说明线虫在鼻疽诺卡氏菌上没有出现逃避行为 综上所述, 鼻疽诺卡氏菌并非线虫的病原细菌, 成年线虫可以以鼻疽诺卡氏菌为食物, 终其一生 图 2.1 鼻疽诺卡氏菌不影响线虫成虫寿命 (A) 线虫成虫喂食鼻疽诺卡氏菌与喂食大肠杆菌相比, 鼻疽诺卡氏菌并未缩短成虫寿命 (B) 喂食 E. coli OP50 的成虫在 4 8 和 24 小时几乎没有离开菌苔, 喂食鼻疽诺卡氏菌的成虫在 24 小时后有少数线虫 离开菌苔, 但与 E. coli OP50 相比没有统计差异 Figure 2.1 N. farcinica does not affect lifespan of adult C. elegans (A) Lifespan of adult C. elegans was not affected by feeding N. farcinica compared to E. coli OP50. (B) C. elegans fed on either OP50 or N. farcinica, while majority of nematodes retained inside of OP50 lawn after feeding for 4 hours, 8 hours and up to 24 hours, a few nematodes have left the N. farcinica lawn at 24 hours feeding but without significant difference in statistics. 3.2 成虫依赖 p38 MAPK 途径抵御鼻疽诺卡氏菌 虽然上述实验证明鼻疽诺卡氏菌并非线虫的病原细菌, 但鼻疽诺卡氏菌毕 41

52 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 竟是一种机会性致病菌 在一些免疫系统受损人群中, 尤其是 HIV 患者和接受器官移植的病人中感染风险都大大增加, 可见免疫系统对于抵抗鼻疽诺卡氏菌的重要性 线虫虽然没有适应性免疫系统, 但是其拥有的天然免疫系统被证实对多种病原微生物具有抵抗作用 线虫对抗病原菌是基于几条免疫信号途径, 例如 :ERK MAPK/MPK-1(Nicholas & Hodgkin, 2004) JNK MAPK/JNK- 1(Huffman et al., 2004) p38 MAPK/PMK-1(Kim et al., 2002) DAF-2/DAF- 16(Garsin et al., 2003) G 蛋白偶联受体 FSHR-1(Powell et al., 2009) 蛋白激酶 PKD/DKF-2(Ren et al., 2009) 转录因子 TFEB/HLH-30(Visvikis et al., 2014) 和 G 蛋白 EGL-30(Kawli et al., 2010) 我们设想, 鼻疽诺卡氏菌可能激活了线虫免疫系统导致线虫能够抵御鼻疽诺卡氏菌 本研究利用突变线虫以及 RNAi 干扰技术, 对以上几条免疫途径在线虫抵御鼻疽诺卡氏菌中的作用做了筛查 结果发现, 敲除 mpk-1,jnk-1,hlh-30 以及 RNAi 沉默 fshr-1,dkf-2,egl-30, 和 daf-16 的线虫在鼻疽诺卡氏菌板上生存时间与喂食大肠杆菌 0P50 没有显著差异 ( 图 2.2) 说明以上免疫途径并不参与线虫对鼻疽诺卡氏菌的免疫 图 2.2 成虫多条免疫途径未参与抵御鼻疽诺卡氏菌 42

53 云南大学博士学位论文 (A-G)25 C 下, 监测线虫在鼻疽诺卡氏菌 (NF) 或大肠杆菌 OP50 上的生存时间 jnk-1(gk7) (A), mpk-1(n2521) (B),hlh-30 (tm1978) (C), 突变线虫在鼻疽诺卡氏菌上生存时间与大肠杆菌 OP50 相当 沉默 dkf-2 (D),fshr-1 (E),egl-30(F) 和 daf-16(g) 不影响线虫在鼻疽诺卡氏菌或 OP50 上的存活时间, 与空载体干扰相比未增加线虫对鼻疽诺卡氏菌的敏感度 Figure 2.2 The role of adult immunity pathway in resistance to N. farcinica (A-G) Survival of C. elegans on either N. farcinica (NF) or E. coli OP50 plates were monitored over time at 25ºC. The surivibal rates of jnk-1(gk7) (A), mpk-1(n2521) (B), hlh-30(tm1978) (C) mutant were comparable to WT worms in the presence of N. farcinica. Knockdown of dkf-2 (D), fshr-1 (E), egl-30(f)and daf-16(g)by RNAi did not influence resistance to N. farcinica. 有趣的是,pmk-1 突变线虫在鼻疽诺卡氏菌上的最大存活时间为 9 天, 相比与野生型线虫展现出了大幅度的缩短 (p<0.001)( 图 2.3A) MAPKKK/NSY-1, MAPKK/SEK-1 作为 p38 MAPK 信号途径中的激酶, 位于 PMK-1 的上游, 通过逐级磷酸化激活下游 PMK-1(Kim et al., 2002) 我们发现,nsy-1 和 sek-1 突变线虫在鼻疽诺卡氏菌上的最大存活时间为 11 天和 10 天, 相对与野生型的 25 天有大幅下降 (p<0.001), ( 图 2.3B,C) 以上结果证明, p38 MAPK 途径对于线虫抵御鼻疽诺卡氏菌是必不可少的 图 2.3 成虫依赖 p38 途径抵御鼻疽诺卡氏菌 (A-C)25 C 下, 监测线虫在鼻疽诺卡氏菌 (NF) 或大肠杆菌 OP50 上的生存时间 pmk-1(km25) (A), nsy-1(ag3)(b) 以及 sek-1(ag1)(c) 突变线虫与野生型线虫相比在鼻疽诺卡氏菌上的生存时间大幅度缩短,(log-rank p<0.001) 43

54 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 Figure 2.3 p38 MAPK promotes adult C. elegans resistance to N. farcinica (A-C) Survival of C. elegans on either N. farcinica (NF) or E. coli OP50 plates were monitored over time at 25ºC. Mutations in pmk-1(km25) (A),nsy-1(ag3) (B),sek-1(ag1) (C)enhanced susceptibility to N. farcinica, (log-rank p<0.001). 3.3 抵御鼻疽诺卡氏菌激活成虫 p38 MAPK 途径 以上研究表明成虫耐受鼻疽诺卡氏菌依赖于 p38 MAPK 途径, 那么鼻疽诺卡氏菌是否激活 PMK-1? 针对此问题, 我们首先通过 Western blot 对 PMK-1 磷酸化水平 (PMK-1 激活的标志 ) 进行了验证 实验结果显示, 喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后, 线虫中 PMK-1 磷酸化的水平高于 OP50 喂食的线虫 1.8 倍 ( 图 2.4A,B) 以前的研究表明, 线虫抗菌肽基因 nlp-29 是 PMK-1 的靶基因 (Pujol et al., 2008) 我们用表达 Pnlp-29::gfp 报告基因的转基因线虫研究喂食鼻疽诺卡氏菌是否影响 nlp-29 的表达水平 结果表明, 喂食鼻疽诺卡氏菌后, Pnlp-29::gfp 报告基因表达显著升高 沉默 nsy-1,sek-1 或 pmk-1 后, 鼻疽诺卡氏菌不能上调 Pnlp-29::gfp 表达 ( 图 2.4C,D) 同时, 用定量 PCR 技术, 我们发现 nlp-29 的表达受 nsy-1,sek-1 和 pmk-1 的调控 ( 图 2.4E) F08G5.6 F35E12.5 和 Y37A1A.2 是经典的 PMK-1 下游的靶基因 (Troemel et al., 2006) 我们对这三个基因在喂食鼻疽诺卡氏菌后的表达量进行了检测 结果表明, 喂食鼻疽诺卡氏菌后 F08G5.6 F35E12.5 和 Y37A1A.2 表达显著地上调 相反, 在 nsy-1(ag3),sek-1(ag1) 以及 pmk-1(km25) 突变线虫中喂食鼻疽诺卡氏菌后, 这三个基因表达没有显著升高 ( 图 2.4E) 以上结果证明鼻疽诺卡氏菌激活 PMK-1 信号途径 44

55 云南大学博士学位论文 图 2.4 抵御鼻疽诺卡氏菌激活线虫成虫 p38 MAPK 途径 (A) p38 磷酸化水平在喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后上调 (B) 使用 ImageJ 对三次独立实验中的 Western blot 结果进行测量统计,***p<0.001 (C) 鼻疽诺卡氏菌上调 Pnlp-29::gfp 的表达, 沉默 nsy-1, sek-1 和 pmk-1 后 Pnlp-29::gfp 不被上调, 标尺 :100 µm ( D)GFP 荧光强度测量统计,*p<0.05(E) PMK-1 下游靶基因 nlp-29 F08G5.6 F35E12.5 和 Y37A1A.2 的 mrna 水平在喂食鼻疽诺卡氏菌后升高, 而在 nsy-1(ag3),sek-1(ag1) 和 pmk-1(km25) 中则没有升高,*p<0.05 Figure 2.4 N. farcinica activates the p38 MAPK pathway in adult worms (A) The phosphorylation of p38 was raised after feeding N. farcinica (NF) for 24 hours(b)the level of phosphorylated p38 in triple independednt experiments were quantified using ImageJ. ***p< (C) Pnlp- 29::gfp up regulated in WT worms but failed in worm subjected to nsy-1, sek-1 and pmk-1 RNAi after feeding N. farcinica, scale bar 100 µm. (D) The fluorescent intensity of Pnlp-29::gfp.*p<0.05. (E) The mrna levels of four PMK-1 targets nlp-29, F08G5.6, F35E12.5 and Y37A1A.2 after feeding on either OP50 or N. farcinica, in WT or nsy-1(ag3), sek-1(ag1) or pmk-1(km25). *p< 鼻疽诺卡氏菌侵染激活 p38 MAPK 途径下游转录因子 SKN-1 45

56 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 转录因子 SKN-1/Nrf2 是 p38 途径下游最主要的调控因子之一 (Papp et al., 2012), 其活性受核定位的调节 (An et al., 2003) SKN-1 作为一个协调线虫氧化和外源压力的转录因子, 除了抵抗氧化压力和有害物质外, 也介导对革兰氏阴性铜绿假单胞菌 PA14 和革兰氏阳性粪肠球菌的抵抗作用 (Papp et al., 2012) SKN-1 在氧化压力下 (Inoue et al., 2005) 和致病菌感染条件下都受 p38 MAPK 途径的调控 (Hoeven et al., 2011) 为了证实 PMK-1 下游的 SKN-1 是否被激活, 我们利用表达 Pskn-1::skn-1::gfp 的转基因线虫, 分别对喂食 OP50 或鼻疽诺卡氏菌 24 小时后线虫进行了研究 在喂食 OP50 的线虫中,SKN-1 很少表达于肠道的细胞核中 相反, 在喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后 SKN-1 大量进核 ( 图 2.5A,B), SKN-1 的核定位在沉默 nsy-1, sek-1 或 pmk-1 后消失, 表现为 SKN- 1::GFP 以弥散的状态分布于线虫肠道内 ( 图 2.5A,B), 以上实验结果证明鼻疽诺卡氏菌激活 SKN-1 进核, 其核定位受 p38 MAPK 途径的调控 图 2.5 鼻疽诺卡氏菌激活成虫 p38 MAPK 途径下游转录因子 SKN-1 (A)SKN-1B/C::GFP 转基因线虫在喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后, 表现出强烈的核定位信号, 白色箭头指示 SKN-1 核定位形态 在沉默 nsy-1,sek-1 或 pmk-1 后核定位信号消失,SKN-1::GFP 以弥散状态分布于胞浆中, 标尺 :50 µm ( B)SKN-1::GFP 进核程度依据文献 (Inoue et al., 2005; Hoeven et al., 2011) 中的方法进行统计,High 代表线虫肠道细胞核中出现强烈 SKN-1::GFP 信号,Low 代表线虫肠道中出现微弱的 SKN-1::GFP 信号 Figure 2.5 N. farcinica activates SKN-1 through p38 MAPK pathway (A) C. elegans carrying SKN-1B/C::GFP transgens fed with N. farcinica for 24 hours, showing strong SKN- 1::GFP signals appeared inside of intestinal nuclei. The white arrows were used to represent the pattern of SKN-1 46

57 云南大学博士学位论文 nuclear localization. The signal dissipated after worm subjected to nsy-1, sek-1 or pmk-1 RNAi. Scale bar 50 µm. (B) The degree of SKN-1 nuclear localization was counted according to previous report (Inoue et al., 2005; Hoeven et al., 2011), High: The intense SKN-1::GFP signals present in intestinal nuclei. Low: The faint SKN- 1::GFP signals present in intestinal nuclei. 第二相解毒基因 gst-4( 谷胱甘肽 S- 转移酶 -4,Glutathione S-transferase-4) 和 gcs-1( 谷氨酰半胱氨酸合酶,Glutamate-cysteine ligase) 作为 SKN-1 的下游靶基因, 其基因表达依赖 SKN-1 的活性 (Oliveira et al., 2009; Park et al., 2009) 应用表达 Pgst-4::gfp 和 Pgcs-1::gfp 报告基因的转基因线虫, 我们发现在 young adult 线虫喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后,Pgst-4::gfp 和 Pgcs-1::gfp 都出现了高表达 沉默 skn-1,nsy-1,sek-1 或 pmk-1 抑制 Pgst-4::gfp 和 Pgcs-1::gfp 的表达升高 ( 图 2.6A,B) qpcr 分析表明 young adult 线虫在喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后 gst-4 和 gcs-1 的表达量显著增加, 而突变 skn-1,nsy-1,sek-1 或 pmk-1 抑制了 gst-4 和 gcs-1 基因表达量的升高 ( 图 2.6C) 以上实验证明, 线虫在喂食鼻疽诺卡氏菌后通 p38 MAPK 途径调控 SKN-1 下游基因表达 图 2.6 鼻疽诺卡氏菌通过 p38 MAPK 途径上调 SKN-1 下游基因表达 47

58 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 (A) 线虫喂食鼻疽诺卡氏菌 24 小时后 Pgst-4::gfp 以及 Pgcs-1::gfp 在空载体,skn-1,nsy-1,sek-1 或 pmk-1 干扰条件下的表达, 标尺 :100 µm ( B)Pgst-4::gfp 和 Pgcs-1::gfp 的荧光强度在 OP50 板或鼻疽诺卡氏菌上, 空载体,skn-1,nsy-1,sek-1 或 pmk-1 干扰条件下的统计,n=40, *p<0.05 ( C) 野生型,skn- 1(tm3411),nsy-1(ag3),sek-1(ag1) 以及 pmk-1(km25) 突变线虫中 gst-4 和 gcs-1 在喂食 OP50 或鼻疽诺卡氏菌 24 小时后的 mrna 水平, 统计使用三次独立实验的平均值 (mean) 和标准偏差 (SD), *p<0.05 Figure 2.6 N. farcinica up-regulats SKN-1-dependent gene expression through p38 MAPK (A) The expression of Pgst-4::gfp and Pgcs-1::gfp in worm subjected to empty vector, skn-1, nsy-1, sek-1 or pmk- 1 RNAi in the presence of OP50 or N. faricinica for 24 hours, scale bar 100 µm. (B) Statistical analysis of Pgst- 4::gfp and Pgcs-1::gfp fluorescence intensity in worms, n=40, *p<0.05. (C) qpcr analysis of gst-4 and gcs-1 mrna level in wild type, skn-1(tm3411), nsy-1(ag3), sek-1(ag1) or pmk-1(km25) worms exposed to either OP50 or N. farcinica for 24 hours. The graph plotted with mean and SD from triplets of independent experiments. *p< SKN-1 介导线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗 为了证明 SKN-1 作为 p38 MAPK 信号途径的下游, 介导抵抗鼻疽诺卡氏菌 我们研究了 skn-1 突变线虫在喂食鼻疽诺卡氏菌后的生存时间 skn-1 突变线虫在喂食鼻疽诺卡后, 最大生存时间为 8 天 ( 图 2.7A), 与野生型相比展现出明显的下降,p<0.001 pmk-1 突变线虫沉默 skn-1 后在鼻疽诺卡氏菌上的最大生存时间为 9 天, 与单独敲除 pmk-1 相比没有差异 ( 图 2.7B) 证明由 p38 MAPK 途径介导的抵抗鼻疽诺卡氏菌的作用中依赖于下游 SKN-1 图 2.7 SKN-1 介导线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗 48

59 云南大学博士学位论文 (A) 野生型或 skn-1(tm3411) 突变线虫于 25ºC 下分别在 OP50 板或鼻疽诺卡氏菌板上的生存时间 突变 skn-1 增加线虫对鼻疽诺卡氏菌的敏感度, (log-rank p<0.001) ( B)pmk- 1(km25) 线虫沉默 skn-1 后在鼻疽诺卡氏菌上的存活时间与 pmk-1(km25) 线虫相当 Figure 2.7 SKN-1 promots worm resistance to N. farcinica (A) Survival of wild type and skn-1(tm3411) mutant worms fed either OP50 or N. farcinica at 25ºC. skn-1(tm3411) worms were more sensitive to N. farcinica than wild type. (log-rank p<0.001). (B) The susceptibility of pmk- 1(km25) worms subjected to empty vector was similar to that of pmk-1(km25) worms subjected to skn-1 RNAi in the presence of N. farcinica. 4. 讨论 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 所介导的信号传导通路广泛存在于细胞中, 主要作用是将细胞外刺激信号从胞外传递进入细胞核内, 通过与下游转录因子相互作用调控基因表达, 介导细胞应答外界环境改变 MAPK 所介导的信号传导系统中已确定的三条途径分别为 :c-jun 氨基末端激酶 (JNK), 胞外信号调控激酶 (ERK) 以及 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (Zhang et al., 2014) 其中 p38 MAPK 途径是一条高度保守的信号传递通路, 不仅存在于哺乳动物中, 也存在于昆虫和无脊椎动物中 线虫中的 p38 MAPK 途径被证实介导对多种病原细菌的抵抗作用, 其中包括 : 铜绿假单胞菌 PA14(Kim et al., 2002) 金黄葡萄球菌 8325(Sifri et al., 2003) 肠道沙门氏菌 (Aballay et al., 2003) 以及分枝杆菌 (Galbadage et al., 2016) 同时 p38 MAPK 被证实介导对真菌圆锥掘氏梅里霉的抵抗作用 (Ziegler et al., 2009) p38 MAPK 途径不仅介导对病原菌的抵抗还介导线虫对细菌毒素的抵抗, 例如 : 苏云金杆菌分泌的打孔毒素 Cry5B (Huffman et al., 2004) 和肠出血性大肠杆菌 O157:H7 分泌的志贺样毒素 1 (Chou et al., 2013) 除此以外,p38 MAPK 还介导线虫对环境压力的耐受作用, 例如 : 高温下的耐受 (Mertenskotte et al., 2013) 对重金属的耐受 (Kurz et al., 2007) 以及对氧化压力的耐受 (Inoue et al., 2005) 不仅如此,p38 通过调控下游免疫基因还介导线虫的长寿机制 (Troemel et al., 2006) 由此可见,p38 途径对于线虫抵抗病原菌 毒素 环境刺激以及衰老都扮演着至关重要的角色 SKN-1 是线虫中与哺乳动物 NRF-2 功能同源的转录因子,NRF-2 控制和诱 49

60 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 导多种参与解毒和抗氧化应激反应的基因表达 (Kwak et al., 2003) PMK-1 磷酸化 SKN-1, 是 SKN-1 进核的必要条件, 而 GSK-3 则是抑制 SKN-1 进核的激酶 (An et al., 2005) SKN-1 通过与其它锌指转录因子 (bzip) 不同的方式与 DNA 结合,bZIP 含有 ZIP 片段, 是二聚作用的原件, 协助 bzip 以二聚体的结构与 DNA 结合 而 SKN-1 并不含有 ZIP 片段, 且是以单体 高亲和的方式与 DNA 结合 (Blackwell et al. 1994) 线虫基因分析发现, 多个编码第二相解毒基因的上游 1kb 序列中, 存在 2-4 个 SKN-1 的结合位点, 这些解毒基因包括 : 谷氨酰半胱氨酸合成酶, 谷胱甘肽合成酶和四种谷胱甘肽 S- 转移酶 (GST)( An and Blackwell 2017) 脊椎动物中, 这些解毒基因的表达都是由 NFR-2 激活的 (Hayes and McMahon 2001) 线虫在氧化压力条件下, 突变 skn-1 导致 gcs-1 表达量减少 进一步研究证明,SKN-1 是通过结合 gcs-1 启动子序列中从而调控 gcs-1 在肠道和 ASI 神经中的表达 (An and Blackwell 2017) 在氧化压力条件下另一个第二相解毒基因 gst-4 的表达上调 在 skn-1 突变之后被抑制, 从而证明 gst-4 的上调是由 SKN-1 介导的 (Kahn et al., 2008) 本研究在对鼻疽诺卡氏菌与线虫成虫相互作用的研究中发现, 鼻疽诺卡氏菌上调线虫 PMK-1 磷酸化水平, 激活 p38 MAPK 途径 PMK-1 通过介导下游靶基因的上调, 从而介导线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗 突变 pmk-1 及 PMK-1 上游激酶基因 nsy-1 和 sek-1 降低线虫喂食鼻疽诺卡氏菌的生存率 因此,p38 MAPK 途径对于线虫抵抗鼻疽诺卡氏菌是必须的 换而言之,p38 MAPK 途径是赋予线虫健全免疫系统中不可或缺的信号通路 的确, 当 p38 MAPK 途径中的 NSY-1,SEK-1 或 PMK-1 出现功能缺失时, 线虫对多种细菌的抵抗能力都出现了下降 (Alper et al., 2007) 然而, 有研究报道发现 PMK-1 的磷酸化水平在病原细菌 PA14 侵染线虫的过程中并未升高 (Ren et al., 2015), 但 pmk-1 突变的线虫仍然增加了对 PA14 感染的敏感度 (Kim et al., 2004) 这暗示了 PMK-1 的激活对于线虫的免疫系统可能是非必须的, 虽然 nsy-1 和 sek-1 基因突变的确会降低 PMK-1 的磷酸化水平 (Kim et al., 2002), 但并不能以此作为 PMK-1 是以磷酸化状态参与线虫免疫的直接证据 反而可理解为 p38 MAPK 途径的功能完整性是支撑线虫免疫保护的基础机制 在此基础上, 线虫面对不同细菌所激活的免疫基因是不同的 的确,p38 MAPK 虽介导了线虫对铜绿假单胞菌和金黄 50

61 云南大学博士学位论文 葡萄球菌的抵抗作用, 但两种细菌所激活的免疫基因却不尽相同 (Alper et al., 2007) 同理, 鼻疽诺卡氏菌虽然激活了线虫中的 PMK-1, 然而激活的 PMK-1 还是 p38 MAPK 途径的完整性介导了线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗, 则需要今后进一步的探索 有趣的是, 鼻疽诺卡氏菌被报道可以通过激活 p38 MAPK 途径激活树突状细胞, 进而促进白细胞介素 IL-12/23p40 的释放 (Eisenblatter et al., 2012) 由此可见,p38 MAPK 介导的宿主对鼻疽诺卡氏菌的抵抗, 可能是进化保守的 SKN-1 是 PMK-1 下游最主要的转录因子之一 我们发现鼻疽诺卡氏菌在激活 PMK-1 的同时, 也促使 SKN-1 从胞质转移进细胞核, 并上调了 SKN-1 下游的靶基因 gst-4 和 gcs-1 的表达 在敲除 skn-1 后, 线虫对鼻疽诺卡氏菌的敏感度增加, 生存时间降低 在 pmk-1 突变的线虫中沉默 skn-1 后, 线虫在鼻疽诺卡氏菌上的生存时间与 pmk-1 突变的线虫相当, 提示 p38 MAPK 介导的线虫对鼻疽诺卡氏菌的抵抗是依赖于其下游转录因子 SKN-1 铜绿假单胞菌 PA14 和粪肠球菌分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌, 在对线虫的侵染过程中被证实都可以引起 SKN-1 进核 (Hoeven et al., 2011) gst-4 和 gcs-1 在金黄葡萄球菌的作用下也显现出高表达 (Hoeven et al., 2011) 而亲缘性较近的细菌所激活的免疫机制也可能是相似的 分枝杆菌与鼻疽诺卡氏菌在进化关系上较近, 研究表明, 线虫对分枝杆菌的抵抗同样依赖于 SKN-1(Galbadage et al., 2016) 这说明 SKN-1 介导的线虫对不同细菌的抵抗作用可能具有一定的普遍性 与其它致病菌相比, 鼻疽诺卡氏菌与线虫成虫的相互作用非常特殊 因为大部分致病菌与线虫常规食物大肠杆菌 OP50 相比, 都会造成线虫生存率的显著减少 (Sifri et al., 2005), 而野生型线虫在鼻疽诺卡氏菌板上的寿命与大肠杆菌 OP50 板相当 这或许跟鼻疽诺卡氏菌致病性较弱相关 根据临床报告由鼻疽诺卡氏菌造成的感染多见于免疫系统受损的病人中, 例如 : 获得性免疫综合症患者 (Goodall et al., 2012;Budzik et al., 2012) 和接受器官移植的病人 (Rinaldi et al., 2000) 健康人群中感染鼻疽诺卡氏菌的主要为年龄在 之间的老年人群 (Kageyama et al., 2004), 而健康的青年人群感染鼻疽诺卡氏菌的病例则较少被报道 因此, 线虫成虫与鼻疽诺卡氏菌的相互作用或许可以作为一个研究鼻疽诺卡氏菌毒力因子的模型 51

62 第二章秀丽隐杆线虫成虫阶段依赖 p38 MAPK 途径抵抗鼻疽诺卡氏菌 图 2.8 成虫耐受鼻疽诺卡氏菌的机制 Figure 2.8 The mechanism of adult worm mediated resistance to N. farcinica 52

63 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 1. 前言 线虫同其它哺乳动物一样拥有监控和稳态机制, 通过调整蛋白的合成以应答生长发育 衰老和环境压力 (Prahlad et al., 2009) 对单细胞生物如: 细菌 酵母和哺乳动物细胞的研究发现, 稳态机制是一种由细胞自主触发以响应胞内错误折叠蛋白存量以及伴随而来的生理或环境挑战的压力应答机制 (Balch et al., 2008; Morimoto., 2008) 错误折叠蛋白的升高被认为是触发压力反应的主要因素 (Hightower et al., 1991) 响应压力的分子机制从古生物到哺乳动物都是保守的, 其中以上调热激蛋白 (HSPs) 为核心, 伴随下调控制细胞正常功能的基因表达 而上调的热激蛋白足以保护细胞免受细胞毒性的影响 (Lindquist et al., 1988; Morimoto., 1998) HSPs 作为分子伴侣在压力条件下持续存在并与非天然构象的蛋白结合, 通过协助蛋白重新折叠以恢复蛋白的天然构象避免错误折叠蛋白的聚集 (Morano et al., 1999; Bukau et al., 2006) 因此, 在压力条件下, 分子伴侣与广泛底物的相互作用增强了蛋白质组的稳定性, 并通过增加蛋白质合成恢复信号传导和生长调控最终重建细胞稳态 (Prahlad et al., 2009) 尽管压力反应描述的是损伤蛋白在胞质和细胞核中的分子机制, 内质网和线粒体中的未折叠反应 (Unfolded Protein Response, UPR) 同样拥有去除错误折叠蛋白的功能 (Ron et al., 2007; Broadley et al., 2008) 线虫中的线粒体未折叠蛋白反应 (UPR mt ) 主要由转录因子 ATFS-1 调控 ATFS-1 氨基末端含有一段线粒体的靶向序列 (MTS), 一般情况下, 大部分 ATFS-1 将被转运进入线粒体, 由线粒体基质中的蛋白酶 Lon 降解 当线粒体功能被扰动, 错误折叠蛋白累积的情况下 ATFS-1 转运效率降低 由于 ATFS-1 带有的核定位信号区, 导致大部分的 ATFS-1 滞留在细胞核中, 在 DVE-1/UBL-5 复合体的协同作用下调控伴侣分子 HSP-6 和 HSP-60 的合成 (Haynes et al., 2007; Nargund et al., 2012) 线虫在对抗环境中威胁生存的细菌时, 除了启动免疫信号途径产生一系列抗菌肽清除细菌外 对于细菌产生的毒素, 解毒途径的激活则同样至关重要 线虫在自然界的分布非常广泛, 不仅在土壤中 水中, 对于一些拥有寄生能力 53

64 云南大学博士学位论文 的线虫还可以在动物以及植物中找到它们 Chitwood 曾经这样说过 : 想一个生物可以生存的地方, 然后去看看, 你将很大程度上找到线虫 (Chitwood, 1974) 这就意味着线虫除了需要面对细菌产生的毒素外, 还需面对在环境中同样广泛存在的各种化学物质 解毒途径中的酶家族主要由细胞色素 P450 (CYP) 短链脱氢酶 (SDR) UDP- 葡糖醛酸基转移酶 (UGT) 和谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 家族构成 线虫中含有大量编码这四个解毒酶家族的基因, 其中 :86 个基因编码 CYP 68 个编码 SDR 72 个编码 UGT 以及 48 个编码 GST (Lindblom and Dodd 2006) 解毒机制主要分为三个连续的阶段: 第一相解毒作用是通过催化作用将功能基团 ( 通常为羟基 ) 添加到有害化合物上, 经过功能基团加工的化合物, 极性增加, 更易被第二相的酶催化作用 第二相毒机制是催化共轭反应进一步增加化合物的溶解度 第三相由 ATP 结合盒 (ABC) 转运器构成 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白虽不是解毒酶, 但是同样在解毒机制中发挥着重要的作用, 其主要功能是负责将解毒后的分子排出 (Omiecinski et al., 2011) 将线虫中负责编码 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白的基因敲除或沉默后, 线虫对有害化合物 细菌毒素以及重金属的敏感度增加 (Broeks et al., 1995; Mahajan-Miklos et al., 1999) 每个阶段的解毒反应都是由特定的酶催化完成的 (Furge et al., 2006), 同时也需要大量的能量支出 (Gems et al., 2005) 第一相解毒反应主要由 CYPs 和 SDRs 催化完成 CYPs 是一个单加氧酶的超级家族, 直接在化合物上添加单氧原子 (Menzel et al., 2001), 而 SDRs 则是催化醛和酮中羰基的还原 (Gibson et al., 2001) 利用 RNA 干扰技术, 沉默 CYPs 或 SDRs 家族中的基因会不同程度的影响线虫的发育 行动和繁殖能力 (Kamath et al., 2003; Simmer et al., 2003) 第二相解毒进程为实际代谢有害物质的解毒阶段, 主要使用 UGTs 和 GSTs GST 催化谷胱甘肽与有毒化合物发生共轭反应从而产生无毒的衍生物 线虫通过调控编码这些解毒酶的基因表达从而适应环境的改变 活性氧 (ROS) 是一种具有高反应特性的小分子物质, 由辐射 光照 线粒体的电子传递系统或其它酶的作用通过氧原子转化而来, 抗氧化酶可以将 ROS 由高反应状态转化为无活性状态 (Kohchi et al., 2009) 高剂量的 ROS 会引起氧化应激反应, 尤其是造成蛋白稳态的失衡, 使细胞组份, 包括 : 蛋白 54

65 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 脂肪和 DNA 被氧化 环境刺激生成的 ROS 可造成多巴胺水平的降低 多巴胺是一种由神经元释放的重要神经递质 (Rodriguez et al., 2013), 通过对除草剂百草枯与线虫的相互关系研究中发现, 百草枯可导致 ROS 升高 (Moran et al., 2010) 以及神经突起生长的异常 (Samann et al., 2009) 本章中, 我们针对鼻疽诺卡氏菌抑制线虫卵的原理以及分子伴侣 应激反应和 ROS 在其中的作用进行研究 2. 实验材料与方法 2.1 实验材料 实验用仪器 发酵系统, 旋转蒸发仪, 冷冻离心机, 超声仪, 其它仪器同上, 详见第二章 实验用试剂 DAPI,DHE,CellRox Deep Red,H2DCF-DA,lysosensor Green DND-189, 乙酸乙酯, 丙酮,NAC,GSH-MEE, 维生素 D3,ɑ- 生育酚, 其它试剂盒同上, 详见第二章 实验用培养基及配置方法 ATP 检测试剂盒 (S0026) 购自碧云天生物科技公司, 组织蛋白酶 B 活性 检测试剂盒 (ab65300) 购自 Abcam, 其它试剂同上, 详见第二章 实验用培养基及配置方法 同上, 详见第二章

66 云南大学博士学位论文 实验用溶液的配制方法 同上, 详见第二章 转基因和突变 C. elegans 线虫株 表 3.1: 转基因和突变 C. elegans 线虫株 C. elegans 线虫株 来源 C. elegans: N2 昆明动物所梁斌老师赠 C. elegans: Mito::GFP 中科院杨崇林老师赠 C. elegans: SJ4100(hsp-6::gfp) CGC C. elegans: SJ4058(hsp-60::gfp + lin-15(+)) CGC C. elegans: CL2166 (paf15)gst-4p::gfp::nls CGC C. elegans: DH1033(vit-2::gfp + rol-6(su1006)) CGC C. elegans: DA2123 (lgg-1p::gfp::lgg-1 + rol-6(su1006)) CGC C. elegans: sgst-1::gfp 王晓晨老师赠 C. elegans: laat-1::gfp 王晓晨老师赠 菌株 同上, 详见第二章 定量 RT-PCR 引物 表 3.2: 定量 RT-PCR 引物 Gene hsp-60-f hsp-60-r hsp-6-f hsp-6-r gst-4-f gst-4-r Actin-F Actin-R Sequences 5 -ACGCCGTCTCTGTCACTATG-3 5 -TCTCCAGCCTCCTCATTAGC-3 5 -AGAAGATACGAAGACCCAGAGG-3 5 -GAACGAATGCTCCAACCTG-3 5 -TTGATGCTCGTGCTCTTGC-3 5 -CAAATGGAGTCGTTGGCTTC-3 5 -TCCTGACCCAAAGAACACGGT-3 5 -ATCCACCTGCTCCTCCTGAG 实验方法 线虫培养 56

67 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 同上, 详见第二章 线虫的冻存与复苏 同上, 详见第二章 线虫同步化 同上, 详见第二章 线虫 RNAi 分析实验 RNAi 双干扰基因实验, 通过对线虫 F0 代进行 gst-4 RNAi,RNAi 步骤详见第二章 再对由 gst-4 RNAi 产生的 F1 代线虫进行 nuo-1,mev-1 或 hsp-6 RNAi,RNAi 步骤详见第二章 2.2.4, 由此实现对线虫 F2 代的 RNA 双干扰 单个基因的 RNAi 步骤详见第二章 线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 大剂量线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 1) 线虫培养 : 野生型线虫 C. elegans N2 置于事先培养有 OP50 细菌的 20 cm 直径 NGM 培养基上 20 C 培养 4 天 2) 接种 N. farcinica 于 300 ml BHI 液体培养基内,37ºC 恒温摇床,180 rpm, 48 小时, 对菌株进行复苏 3) 对发酵系统进行空罐灭菌 30 分钟 4) 向发酵罐内注入去离子水 20 L, 倒入 1000 g BHI, 加入少量消泡剂, 重新注水至 40 L, 搅拌混合均匀之后, 重新灭菌 30 分钟 5) 接种之前复苏好的 N. farcinica 于灭菌好的发酵罐中,37ºC,180 rpm, 每小时通气一次, 发酵 48 小时后, 将温度改为 25ºC, 继续发酵 12 小时以备加入线虫 57

68 云南大学博士学位论文 6) 将培养好的线虫从培养基上用 M9 冲洗下来, 收集于 15 ml 离心管中, 自然沉淀后, 去除含有细菌的上清液 7) 使用三抗 M9 洗涤线虫 6-7 次, 洗涤总时长不应少于 3 小时 8) 使用灭菌 M9 洗涤线虫 4-5 次, 去除残留抗生素 9) 每隔 24 小时需要重复步骤 6-8 收集 40 ml 线虫 10) 将处理好的线虫, 接入发酵罐中, 每隔 24 小时加入 40 ml 线虫 25ºC,100 rpm, 继续发酵 72 小时, 每小时通气一次 11) 发酵液 rpm, 室温, 离心 3 分钟, 收集上清液, 弃沉淀 以备后续实验使用 小剂量线虫诱导 N. farcinica 发酵实验 1) 线虫培养 : 野生型线虫 C. elegans N2 置于事先培养有 OP50 细菌的 20 cm 直径 NGM 培养基上 20 C 培养 4 天 2) 接种 N. farcinica 于高温高压灭菌处理过的 300 ml BHI 液体培养基内,37ºC 恒温摇床,180 rpm,48 小时, 对菌株进行复苏 3) 48 小时候后, 将温度降为 25ºC, 继续培养 12 小时 4) 将培养好的线虫从培养基上用 M9 冲洗下来, 收集于 15 ml 离心管中, 自然沉淀后, 去除含有细菌的上清液 5) 使用三抗 M9 洗涤线虫 6-7 次, 洗涤总时长不应少于 3 小时 6) 使用灭菌 M9 洗涤线虫 4-5 次, 去除残留抗生素 7) 每隔 24 小时需要重复步骤 4-6, 收集 5 ml 线虫 8) 将处理好的线虫, 接入培养基, 每隔 24 小时加入 5 ml 线虫 25ºC,100 rpm, 继续发酵 72 小时 9) 发酵液 rpm, 室温, 离心 3 分钟, 收集上清液, 弃沉淀 以备后续实验使用 诱导发酵液萃取实验 58

69 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 1) 按体积 1:1 在上清液中加入乙酸乙酯 2) 将上述混合好的液体, 置于超声仪中, 超声 30 分钟, 超声 2 次 3) 将超声好的浑浊液体置于室温静置 12 小时, 澄清好的液体分为三层 : 最上层为透明液体, 中间为浑浊的乳白色液体, 最下层为上清液 取最上面透明液体, 转移至新的三角瓶中 4) 再向上清液中按体积 1:1 重新加入乙酸乙酯 重复步骤 2-33 次 5) 将收集到的所有透明萃取液, 置于旋转蒸干仪上蒸干 6) 按 2.5 mg/ml 的比例加入丙酮对旋蒸以后的产物进行溶解, 溶解完成后的液体使用脱脂棉过滤, 过滤完成后置于 -20ºC, 避光保存 未诱导 N. farcinica 发酵实验 未诱导 N. farcinica 发酵不加入线虫, 除此以外所用培养条件同上 ( 详见 2.2.5) 未诱导发酵液萃取实验 未诱导 N. farcinica 发酵不加入线虫, 除此以外所用培养条件同上 ( 详见 2.2.6) 诱导产物 / 未诱导产物浸泡线虫卵实验 1) 将培养 3-4 天的线虫置于显微镜下观察, 线虫母体中卵呈直线排列, 且培养皿中幼虫较少, 开始同步化 2) 使用 M9 缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来, 冲洗过程中应避免反复剧烈冲洗而将培养基中的琼脂带下, 从而影响线虫在裂解过程中的效率 3) 将冲洗下来的线虫装入 15 ml 离心管中, 再加入适量 M9 缓冲液至 14 ml, 自然沉淀 3-5 分钟, 去除上清, 再重新加入 M9 缓冲液至 14 ml 冲洗线虫 59

70 云南大学博士学位论文 此步骤需重复 4-6 次, 直至上清变为清澈液体为止, 尽量将细菌洗涤干净 4) 将多余上清移除后, 向洗净的线虫中加入 1-2 ml 线虫裂解液 ( 裂解液不应超过 2 ml) 5) 剧烈振荡 (3000/min)2-5 分钟 ( 不应超过 5 分钟 ), 振荡 2 分钟后, 每 30 秒肉眼观察一次, 线虫出现断裂后, 每 15 秒观察一次, 直至线虫虫体完全消失 裂解完成后, 液体应充满颗粒状物体且无虫体 6) 裂解完成的离心管中加入 M9 缓冲液至 15 ml, 离心 2 分钟,4000 rpm, 20 C 7) 用移液器吸除上清, 留 3 ml 液体 ( 注意不要吸到沉淀 ) 重新加入 M9 缓冲液至 15 ml 8) 重复步骤 次, 直至无次氯酸钠气味为止 9) 尽量将上清移除干净后, 加入 1000 µl M9 缓冲液, 用移液器轻柔吹打, 使沉淀悬浮后, 将液体转移至 5 mm 培养皿中 10) 按实验要求加入一定浓度的诱导产物或未诱导产物以及抗氧化剂, 20 C 恒温分别培养 8 或 18 小时 11) 8 小时后观察卵的发育形态和组织形态 18 小时后统计卵的孵化率 ROS 检测实验 1) 将诱导产物或诱导产物处理 8 小时或 18 小时的线虫卵, 用 M9 洗涤三次 2) 将洗涤好的线虫卵收集于离心管中, 自然沉淀去除上清, 之后加入 200 µl 的 TBST( 含 1% 吐温 20) 3) 将线虫卵进行超声破碎 4) 使用 BCA 试剂盒检测蛋白浓度, 详见第二章 ) 在 96 孔板中, 每孔按相同蛋白量加入线虫卵破碎液后加入 H2DCF-DA, 经由氧化剂氧化后形成 DCF 发出荧光 6) 使用多功能酶标检测仪在激发光 485 nm, 发射光 530 nm 下检测荧光强度 7) 每个实验检测三次, 每次实验设置三个平行, 收集数据进行统计分析 60

71 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 二氢乙啶 (DHE) 染色 1) DHE 使用 DMSO 溶解,DHE 初始浓度为 3 mm 2) 收集诱导产物或未诱导产物浸泡 8 或 18 小时后的线虫卵, 置于 1.5 ml EP 管中, 自然沉淀, 去除上清 3) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留上清液, 加入 M9 以及 0.1% Trixon-100 至总体积 1000 µl 室温静止 15 分钟 4) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留 Trixon-100, 加入 M9, 至终体积 999 µl 5) 向上述处理完毕后的混合液中, 加入 1 µl DHE, 使终浓度为 3 µm 6) 使用锡箔纸将 EP 管包好, 置于 20ºC, 避光染色 45 分钟 7) 染色完成后, 吸除上清, 加入 1 ml M9 缓冲液,2500 rpm, 室温, 离心 2 分钟, 如此反复 2-3 次 8) 将制备好的线虫卵样品置于荧光显微镜下观察 DCFH-DA 染色 1) 收集诱导产物或未诱导产物浸泡 8 或 18 小时后的线虫卵, 置于 1.5 ml EP 管中, 自然沉淀, 去除上清 2) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留上清液, 加入 M9 以及 0.1% Trixon-100 至总体积 1000 µl 室温静止 15 分钟 3) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留 Trixon-100, 加入 M9, 至终体积 999 µl 4) 向上述处理完毕后的混合液中, 加入 10 µl DCFH-DA, 使终浓度为 25 µm 5) 使用锡箔纸将 EP 管包好, 置于 20ºC, 避光染色 45 分钟 6) 染色完成后, 吸除上清, 加入 1 ml M9 缓冲液,2500 rpm, 室温, 离心 2 分钟, 如此反复 2-3 次 7) 将制备好的线虫卵样品置于荧光显微镜下观察 CellRox Deep Red 染色 61

72 云南大学博士学位论文 1) 收集诱导产物或未诱导产物浸泡 8 或 18 小时后的线虫卵, 置于 1.5 ml EP 管中, 自然沉淀, 去除上清 2) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留上清液, 加入 M9 以及 0.1% Trixon-100 至总体积 1000µl 室温静止 15 分钟 3) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留 Trixon-100, 加入 M9, 至终体积 499 µl 4) 向上述处理完毕后的混合液中, 加入 1 µl CellRox Deep Red 5) 使用锡箔纸将 EP 管包好, 置于 20ºC, 避光染色 45 分钟 6) 染色完成后, 吸除上清, 加入 1 ml M9 缓冲液,2500 rpm, 室温, 离心 2 分钟, 如此反复 2-3 次 7) 将制备好的线虫卵样品置于荧光显微镜下观察 溶酶体功能检测 LysoSensor Green DND-189 染色 1) LysoSensor Green DND-189 使用 DMSO 溶解,LysoSensor Green 初始浓度为 3mM 2) 收集诱导产物或未诱导产物浸泡 8 或 18 小时后的线虫卵, 置于 1.5 ml EP 管中, 自然沉淀, 去除上清 3) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留上清液, 加入 M9 以及 0.1% Trixon-100 至总体积 1000 µl 室温静止 15 分钟 4) 使用 M9 洗涤 2-3 次, 去除残留 Trixon-100, 加入 M9, 至终体积 999 µl 5) 向上述处理完毕后的混合液中, 加入 1 µl LysoSensor Green 使终浓度为 3 µm 6) 使用锡箔纸将 EP 管包好, 置于 20ºC, 避光染色 60 分钟 7) 染色完成后, 吸除上清, 加入 1 ml M9 缓冲液,2500 rpm, 室温, 离心 2 分钟, 如此反复 2-3 次 8) 将制备好的线虫卵样品置于荧光显微镜下观察 62

73 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 组织蛋白酶 B 活性检测 1) 将需要检测的线虫卵样品先用 M9 洗涤干净, 去除多余上清 2) 液氮研磨 4-5 次后, 置于离心管中按 1:3 的比例加入细胞裂解液 3) 冰上静止 30 分钟进行裂解, 裂解过程中不能加入蛋白酶抑制剂 4) 4ºC,12000 rpm, 离心 5 分钟 离心后粗提物分为三个液相层, 小心抽取中间液相层 5) 将收集到的中间液相层转移至新的离心管中, 置于冰上备用 6) 使用 BCA 试剂盒对提取物进行蛋白浓度检测, 详见第二章 ) 96 孔板中按每孔 50 µg 的蛋白量加入样品提取物, 使用细胞裂解液将最终体积补足至 50 µl 8) 再在每孔中加入 50 µl 的组织蛋白酶 B 反应缓冲液 9) 最后在每孔中加入 2 µl 10 mm 组织蛋白酶 B 反应底物 Ac-RR-AFC 底物在组织蛋白酶 B 的作用下裂解释放 AFC, 发出荧光 10) 将制备好的 96 孔板置于 37ºC 下避光培养 1 小时 11) 使用多功能酶标检测仪在激发光 400 nm, 发射光 505 nm 下检测荧光强度 12) 每个实验检测三次, 每次实验设置三个平行, 收集数据进行统计分析 ATP 检测 1) 将需要检测的线虫卵样品先用 M9 洗涤干净, 去除多余上清 2) 液氮研磨 4-5 次后, 置于离心管中按 1:2 的比例加入细胞裂解液 3) 冰上静止 30 分钟进行裂解, 裂解过程中不能加入蛋白酶抑制剂 4) 4ºC,12000 rpm, 离心 5 分钟, 离心后粗提物分为三个液相层, 小心抽取中间液相层 5) 将收集到的中间液相层转移至新的离心管中, 除小部分用于检测蛋白浓度外, 其余部分置于 100ºC 煮沸 5 分钟, 有助释放 ATP 6) 使用 BCA 试剂盒对提取物进行蛋白浓度检测, 详见第二章

74 云南大学博士学位论文 7) 按照试剂盒说明书将 ATP 标准溶液按浓度梯度 0.01,0.1,1,10 nm/ml 用 ATP 检测裂解液稀释 8) 按照 1:100 的比例使用 ATP 检测试剂稀释液稀释 ATP 检测试剂, 制备为 ATP 检测工作液 9) 先在 96 孔空板的待测孔中加入 100 µl ATP 检测工作液, 室温放置 5 分钟, 使本底的 ATP 全部消耗完 10) 再在待测孔中加入 100 µl 稀释好的标准溶液或样品提取液, 迅速用移液枪混匀, 间隔 2 秒后使用多功能酶标仪检测萤火虫荧光素 11) 每个实验检测三次, 每次实验设置三个平行, 收集数据进行统计分析 显微镜分析实验 同上, 详见第二章 RT-PCR 实验 线虫卵总 RNA 提取 实验中所使用样本为上清液浸泡的线虫卵 ( 使用诱导上清液或未诱导上清 液 ),RNA 提取方法与线虫 RNA 提取方法相同, 详见第二章 cdna 合成 同上, 详见第二章 RT-PCR 操作流程 同上, 详见第二章

75 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 蛋白免疫印迹 (Western blotting) 同上, 详见第二章 统计学分析 同上, 详见第二章 实验结果 3.1 鼻疽诺卡氏菌抑制线虫卵的孵化 虽然鼻疽诺卡氏菌对线虫成虫的生存时间没有显著影响 有趣的是, 线虫成虫喂食鼻疽诺卡氏菌后产生的卵几乎不孵化, 即板上没有观察到幼虫 作为对照, 线虫喂食大肠杆菌 OP50 产生的卵在 72 小时后, 绝大部分都能孵化出幼虫 ( 图 3.1A) 为了对这一现象定量, 我们将 OP50 或鼻疽诺卡氏菌与成虫共培养 72 小时后将成虫全部挑出, 含有线虫卵的培养基继续在 25ºC 下培养 48 小时后再观察卵的孵化情况 结果发现, 鼻疽诺卡氏菌组的线虫卵仅有 15% 的孵化率 ( 图 3.1B) 对没有孵化的卵形态与正常线虫卵形态观察后发现, 与鼻疽诺卡氏菌共培养的卵从立体的椭圆形转变为扁平且无立体感的形态, 卵质坍塌与卵壳之间的界限模糊并伴有空泡的产生 ( 图 3.1C) 这些结果证明, 鼻疽诺卡氏菌能够抑制线虫卵的孵化 65

76 云南大学博士学位论文 图 3.1 鼻疽诺卡氏菌抑制线虫的孵化 (A) 线虫与 OP50 或鼻疽诺卡氏菌共培养 72 小时后,OP50 板上出现大量孵化出的线虫幼虫而鼻疽诺卡氏菌板上除了大量线虫卵外, 未见线虫幼虫 (B) 鼻疽诺卡氏菌抑制线虫卵的孵化, 板上孵化出的线虫幼虫仅有 OP50 板的 15%,***p<0.001 (C)OP50 板上的线虫卵为立体椭圆形, 由清晰可见的外层物质以及内层细胞膜包裹 鼻疽诺卡氏菌板上的线虫卵扁平, 形态不规则, 而包裹线虫胚胎的外层物质几乎完全消失并伴有空泡产生 标尺为 50 µm Figure 3.1 N. farcinica inhibits embryos of C. elegans from hatch (A) DIC of hatched larva on E. coli OP50 compared to N. farcinica plates, which no larva were visible. (B) The embryos were incubated for 48 hours without maternal nematodes present which only 15% embryos able to hatch on N. farcinica plates, dramatically decreased in hatch rate. ***p< (C) The embryonic morphology appeared to be stereoscopic ovals surrounding with clear edged outer layer and distinguishable inner membrane barrier on OP50 plates while embryos were flatted, irregulate shaped ovals with vacuoles on N. farcinica plates. Scale bar 50 µm. 3.2 线虫诱导鼻疽诺卡氏菌产生的分泌产物抑制线虫卵的孵化 66

77 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 鼻疽诺卡氏菌能够产生和分泌多种具有生物活性的代谢产物 (Mikami et al., 2010) 为了验证鼻疽诺卡氏菌的分泌物是否能抑制线虫卵孵化, 将鼻疽诺卡氏菌单独培养, 对上清中乙酸乙酯的提取物经过丙酮溶解 ( 以下简称未诱导产物 ) 加入含有线虫卵的 M9 缓冲液中, 孵育 18 小时后统计卵的孵化比例 实验结果令人意外, 在 50 µg/ml 浓度下, 加入未诱导产物或加入溶剂丙酮与空白对照 M9 相比, 线虫卵的孵化率都达到 90% 以上并未产生差异 ( 图 3.2A,B) 证明鼻疽诺卡氏菌的未诱导产物并不能抑制线虫卵的孵化 既然鼻疽诺卡氏菌是在与线虫共培养时产生了抑制卵孵化的现象, 那么抑制卵孵化的分泌物则可能是受线虫的胁迫下产生的 的确, 将线虫诱导后的鼻疽诺卡氏菌上清, 经乙酸乙酯提取后使用丙酮溶解 ( 以下简称诱导产物 ), 加入含有线虫卵的 M9 缓冲液中, 卵的孵化率仅为 3% 左右 ( 图 3.2A,B) 诱导产物对线虫卵孵化的抑制效率依赖于其浓度,50 µg/ml 和 25 µg/ml 浓度对卵孵化的抑制效率都达到了 90% 以上,10 µg/ml 浓度的抑制效率为 70% 左右, 而在 5 µg/ml 和 2.5 µg/ml 浓度下没有抑制效果 ( 图 3.2C) 诱导产物不仅对线虫卵的孵化有抑制作用, 同时也会降低孵化后幼虫的存活率 在 50 µg/ml 和 25 µg/ml 浓度下, 孵化后幼虫的存活率仅为 0.2% 左右 ( 图 3.2D,E) 虽然 10 µg/ml 浓度下卵的孵化率达到了 30% 左右, 但是孵化后幼虫的存活率仅有 1% 左右 ( 图 3.2E) 5 µg/ml 和 2.5 µg/ml 的浓度与丙酮 未诱导产物以及空白对照一样, 不仅不影响卵的孵化, 同时也不影响孵化后幼虫的存活率 ( 图 3.2D,E) 以上实验证明, 诱导产物是鼻疽诺卡氏菌抑制卵孵化的主要成份, 同时具有潜在的杀幼虫活性 67

78 云南大学博士学位论文 图 3.2 线虫诱导鼻疽诺卡氏菌分泌的产物抑制线虫卵的孵化 (A-B) M9,50µl 丙酮 (5% V/V),50 µg/ml 未诱导产物以及 50 µg/ml 诱导产物作用下线虫卵孵化率统计, ***p<0.001 (A,C) 鼻疽诺卡氏菌诱导产物或未诱产物在 50 µg/ml,25 µg/ml,10 µg/ml,5 µg/ml 以及 2.5 µg/ml 浓度作用下对线虫卵的抑制效果不同, 而孵化率与诱导产物浓度成反比,***p<0.001 (D) M9,50 µl 丙酮,50 µg/ml 未诱导产物以及 50 µg/ml 诱导产物作用下线虫孵化后 L1 幼虫存活率的统计, ***p<0.001 (E) 鼻疽诺卡氏菌诱导产物或未诱导产物在 50 µg/ml,25 µg/ml,10 µg/ml,5 µg/ml 以及 2.5 µg/ml 浓度作用下对线虫孵化后 L1 幼虫存活率统计,***p<0.001 M9 缓冲液 : 培养线虫卵直至孵化所使用的常规缓冲液, 孵化后幼虫能在 M9 缓冲液中存活大于 48 小时, 在实验中作为空白对照使用 丙酮 : 溶解诱导或未诱导萃取物的溶剂 Non-induced: 鼻疽诺卡氏菌未诱导萃取分泌产物 Induced: 鼻疽诺卡氏菌诱导萃取分泌产物 Figure 3.2 Secretion product of N. farcinica inhibits C. elegans embryo hatch (A-B) 50 µg/ml Induced product of N. farcinica reduced remarkably the C. elegans embryo hatch rates compared to 50 µg/ml non-induced product, M9 buffer, and 50 µl Acetone (5%V/V). ***p< (A, C) Different concentration of induced N. farcinica product 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml and 2.5 µg/ml inhibited C. elegans embryos hatch rate accordingly, indicated induced N. farcinica product repressed embryos form hatch in a dose dependent manner. ***p< (D) Induced N. farcinica product lowered the survival rate of hatched L1 68

79 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 larva compared to 50 µg/ml non-induced product, M9 buffer, and 50 µl acetone (5% V/V). ***p< (E) Induced N. farcinica product reduced survival rate of hatched L1 larva in a dose dependent manner. ***p< M9: Standard buffer for incubating C. elegans embryos till hatch and able to support hatched L1 larva to survive without medium and food up to 48 hours,used as empty control for experiments. Acetone: Solvent to dissolve induced product and non-induced product. Non-induced: non-induced N. farcinica secretion product. Induced: induced N. farcinica secretion product. 3.3 诱导产物导致线粒体机能受损 我们用表达 Mito::GFP 的转基因线虫对由诱导产物导致的不孵化卵的形态进行研究, 发现线粒体的形态发生了改变 10 µg/ml 浓度的未诱导产物处理下线虫卵中, 线粒体以连续的管状网络形态围绕在细胞核周围, 尤其以前肠组织开始形成的 comma 时期以及二折叠时期的线虫胚胎最为明显 ( 图 3.3A) 相反, 相同浓度的诱导产物处理后, 线虫卵中线粒体网络出现断裂, 以点状形态分布于细胞核周围 线粒体网络形态的改变与线粒体机能受损相关 (Knott et al., 2008) 当线粒体机能受损时往往会影响细胞中 ATP 的水平 (Bach et al., 2003) 在检测线虫卵中 ATP 水平后发现, 未诱导产物以及空白对照的 ATP 水平相当, 而诱导产物导致线虫卵中 ATP 水平明显下降 ( 图 3.3B) 说明诱导产物对线虫卵中的线粒体功能产生影响 69

80 云南大学博士学位论文 图 3.3 诱导产物导致线粒体机能受损 (A)10 µg/ml 诱导产物处理 8 小时后, 线虫卵 500 细胞 + comma 和三折叠阶段的线粒体形态均从管状网络断裂形成点状形态围绕在细胞核周围, 尤以 comma 和三折叠期的胚胎最为明显 (B)10 µg/ml 诱导产物处理 8 小时后, 线虫胚胎 ATP 水平与未诱导产物和丙酮相比明显下降 而未诱导产物和丙酮处理下的线虫卵中 ATP 水平相当,***p<0.001 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺为 10 µm Figure 3.3 Induced product causes mitochondria dysfunction (A) The morphology of mitochondria in 500 cell+, comma and three fold stage of C. elegans embryos after treating with 10 µg/ml induced product or 10 µg/ml non-induced product for 8 hours. (B) ATP level of C. elegans embryos after treating with 10 µg/ml induced product for 8 hours were significantly lower than those with 10 µg/ml non-induced product and acetone, The ATP levels of C. elegans embryos after treating with 10 µg/ml noninduced product and acetone were comparable. ***p< Yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel, scale bar 10 µm. 通过使用三种不同的活性氧荧光染料 : 二氢乙锭 (DHE ) CellRox DeepRed 以及 2,7- 二氯二氢荧光素二乙酸酯 (H2DCF-DA,DCF) 检测了线虫 70

81 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 卵中 ROS 的水平, 三种染料的结果显示诱导产物处理后线虫卵中的 ROS 水平明显升高 ( 图 3.4A,B) 以前的研究发现, 当线虫受到氧化压力时会上调解毒基因 gst-4(fahey&talalay., 1999) gst-4 编码线虫中的谷胱甘肽 S 转移酶, 是参与抵抗 ROS 最主要的解毒基因之一 (Shore et al., 2012) 在诱导产物的作用下, ROS 升高是否会上调线虫卵中 gst-4 的表达呢? 我们分别对诱导产物和未诱导产物处理下的线虫卵中 Pgst-4::gfp 以及 gst-4 mrna 水平进行分析 结果发现,Pgst-4::gfp 在线虫胚胎各发育时期的 Pgst-4::gfp 表达是不同的 主要表现为, 多细胞阶段仅有少数细胞中出现 Pgst-4::gfp 的表达, 三折叠期后出现全肠表达 诱导产物处理后线虫卵中 Pgst-4::gfp 表达被抑制 ( 图 3.4C,D) 诱导产物处理后的线虫中 gst-4 mrna 总体水平是下降的 ( 图 3.4E) 以上实验证明诱导产物不仅致使线虫卵中产生大量 ROS, 同时抑制了第二项解毒基因 gst-4 的表达 图 3.4 诱导产物致使线虫卵中的 ROS 水平升高 (A)DCF 检测的线虫卵中 ROS 水平在使用诱导产物处理 8 小时后明显增高,***p<0.001 (B)DHE 和 CellRox Deep Red 进行染色后也表明 ROS 的水平同样高于未诱导产物 (C)10 µg/ml 诱导产物处理 8 小 71

82 云南大学博士学位论文 时后 Pgst-4::gfp 在线虫胚胎的多细胞阶段以及 comma 阶段明显低于未诱导产物处理下线虫卵, 三折叠时期与未诱导产物相比略低, 标尺 :10 µm (D)500 细胞 +,comma 和三折叠 + 胚胎阶段中的 Pgst-4::gfp 荧光强度统计,n=30,*p<0.05 ( E)10 µg/ml 诱导产物处理 8 小时后线虫总体卵中 gst-4 的 mrna 水平低于未诱导产物处理下的线虫卵,*p<0.05 Figure 3.4 Induced product stimulates ROS level in C. elegans embryos (A) ROS levels of C. elegans embryos were intensely increased after 10 µg/ml induced product for 8 hours. ***p < (B) The ROS levels were further confirmed by using DHE and CellRox Deep Red stainning. (C) Pgst- 4::gfp expression after induced product treatment were markedly lower than that after non-induced product treatment, especially at multiply cell and comma stage of embryogenesis, scale bar 10 µm (D) The statistical analysis of fluorescent intensity of Pgst-4::gfp in 500 cell+, comma and three fold+ embryonic stages, n=30,*p< (E) The mrna levels of gst-4 in total C. elegans embryos were lower than those after non-induced product. *p< 诱导产物导致溶酶体扩大和功能受损 诱导产物除导致线粒体形态发生改变外, 细胞中的其它细胞器形态是否同样发生了改变?laat-1 编码溶酶体的膜上蛋白, 其主要功能是负责转运由溶酶体降解产生的赖氨酸和精氨酸, 从而维系生物体中的蛋白稳态 (Liu et al., 2012) 利用 laat-1 的这一特点, 本研究使用 GFP 标记 LAAT 的线虫观察溶酶体的形态 结果发现, 对照组未诱导产物处理后的线虫卵在多细胞时期,comma 时期以及三折叠时期 80% 左右的溶酶体直径都位于正常范围 ( 直径 µm), 仅有少部分溶酶体直径达到 µm, 而直径大于 3.5 µm 的溶酶体则没有被发现 ( 图 3.5A) 相反, 诱导产物处理线虫卵 8 小时候后, 胚胎多细胞阶段中溶酶体 48% 左右直径处于 µm 之间,50% 左右直径大于 3.5 µm, 而拥有正常溶酶体直径范围 µm 的仅占胚胎溶酶体中总数的 2% comma 时期以及三折叠时期中溶酶体直径大于 3.5 µm 的比例有所下降, 分别为 22% 和 10% 左右, 但直径处于 µm 之间的溶酶体比例都超过了 50%( 图 3.5B) 这些结果表明, 诱导产物除改变线粒体形态外还导致线虫卵中溶酶体直径扩大, 而这种扩大并不局限发生于某个胚胎发育的阶段 72

83 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.5 诱导产物导致溶酶体扩大 (A)10 µg/ml 诱导产物或未诱导产物处理后 8 小时后的线虫卵中溶酶体的形态, 由 laat-1::gfp 标记的溶酶体在胚胎不同发育阶段出现增大 (B) 溶酶体增大的程度和数量在各胚胎发育阶段有所区别 通过测量溶酶体直径, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 +,comma 以及三折叠 + 时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示于图片右侧 柱状图上数字代表被测量的各发育阶段胚胎数量, 颜色代表不同的直径范围 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺为 10 µm Figure 3.5 Induced product causes lysosome expansion (A) The morphology of lysosomes after treating C. elegans embryos with 10 µg/ml induced product or 10 µg/ml non-induced product for 8 hours. Lysosomes size of C. elegans embryos expanded at different developmental embryonic stages by using laat-1::gfp as indicator. (B) Statistical analysis of lysosome size of each embryonic stage by measuring the diameter of lysosomes in 500 cell+ stage, comma stage and three fold+ stage. The size of lysosomes were categorized into three classes, with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5 µm. The proportions of each class were indicated using different color in histogram. The number of embryos measured in each stage was labeled on bar. The analysis indicates lysosomes expansion vary at different degreed in different embryonic stages. Yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel, scale bar 10 µm. 溶酶体功能的下降或是升高往往都会影响溶酶体的体积, 为了探究溶酶体 73

84 云南大学博士学位论文 功能在诱导产物影响下是升高还是下降? 本研究对溶酶体功能进行了一系列的实验分析 LysoSenor Green DND-189 是一种荧光染料, 对 ph 值敏感, 能够于细胞中的酸性区域进行特异性的染色 通常用于指示溶酶体的酸性状态,pH 值低时显示为强烈的黄绿色荧光, 而当 ph 值较高时显示为微弱的绿色荧光 分别对未诱导产物处理和诱导产物处理 8 小时候后的线虫卵进行 LysoSenor Green 染色后发现, 未诱导产物处理后的线虫卵中溶酶体显示为黄绿色细密小点 相反, 诱导产物处理后的各发育阶段的线虫卵均显示出微弱的绿色荧光 ( 图 3.6A) 分别统计 30 颗不同发育阶段卵的荧光强度后发现, 多细胞阶段的荧光强度仅为未诱导产物处理下相同发育阶段线虫卵的 12%,comma 为 14%, 二折叠为 23%, 三折叠为 30%( 图 3.6B) 同时 LysoSenor Green 的染色特性使其同样指示溶酶体形态, 而溶酶体扩大的现象在使用 LysoSenor Green 染色后依然是可见的, 且不同胚胎阶段中溶酶体的扩大程度与使用 laat::gfp 测量的结果相当 ( 图 3.6C) 组织蛋白酶 B 是一种溶酶体中的蛋白酶, 其活性通常可以用以指示溶酶体的功能 分别对未诱导产物和诱导产物处理后的线虫卵中组织蛋白 B 活性进行检测后发现, 诱导产物处理后的组织蛋白酶 B 的活性仅为未诱导产物的 1/3 ( 图 3.6D) vit-2 编码卵黄蛋白, 其功能类似于脂质转运蛋白用于将线虫母体肠道中的脂肪转运至胚胎当中 (DePina et al., 2011), 而 VIT-2 随着胚胎发育经由溶酶体降解消失, 是溶酶体的底物 未诱导产物处理后的线虫卵中, 标记有 GFP 的 VIT-2 呈绿色 点状 轮廓清晰的光点均匀分布于细胞核周围 多细胞阶段拥有非常多的光点数量, 当进入 comma 时期后, 光点数量开始下降直至三者折叠期后完全消失 ( 图 3.6E) 相对于未诱导产物, 诱导产物处理后线虫卵中光点数量并未随着发育而减少, 尤其在 comma 时期和二折叠时期中最为明显, 而三折叠时期中仍然可以看到光点 ( 图 3.6E) 与未诱导处理中轮廓清晰的光点相比诱导产物中的部分光点轮廓模糊, 甚至出现了较大的斑块 证明 VIT-2 在诱导产物处理下的线虫卵中出现了积累, 并可能伴有蛋白质聚集 以上实验证明诱导产物损伤溶酶体功能 74

85 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.6 诱导产物导致溶酶体功能受损 (A) 检测 10 µg/ml 诱导产物或未诱导产物处理后 8 小时后的线虫卵中溶酶体的 ph 值, 通过使用 LysoSensor Green DND-189 线虫卵进行染色 LysoSensor Green DND-189 为溶酶体特异性染色剂并对溶酶体中的 ph 值具有敏感性 在 ph 值低时显示为黄绿强荧光伴随 ph 值增高荧光强度降低, 颜色由黄绿色 75

86 云南大学博士学位论文 转变为绿色 (B) 通过使用软件 ImageJ 测量处于 500 细胞 +,comma, 二折叠时期以及三折叠 + 时期胚胎的荧光强度, 统计各胚胎发育阶段的荧光强度, 并使用柱状图表示于图片的右侧, 各胚胎发育阶段所统计的胚胎数目为 30,***p<0.001 (C) 使用 Lysosensor Green 染色后对胚胎不同发育阶段中溶酶体增大的程度和数量进行统计, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 +,comma, 二折叠以及三折叠 + 时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示, 颜色代表不同的直径范围,n=45 (D)10 µg/ml 诱导产物或未诱导产物处理后 8 小时后的线虫卵中组织蛋白酶 B 活性, 通过使用组织蛋白酶 B 活性检测试剂盒进行检测,***p<0.001 ( E)10 µg/ml 诱导产物或未诱导产物处理后 8 小时后 100 细胞 +,comma, 二折叠时期以及三折叠 + 时期胚胎中 VIT::GFP 的表达情况 伴随溶酶体功能下降 VIT-2::GFP 在诱导处理后的胚胎形态形成期出现明显累积 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺为 10 µm Figure 3.6 Induced product causes lysosome dysfunction (A) ph of lysosomes in C. elegans embryos after treating with 10 µg/ml induced product or 10 µg/ml non-induced product for 8 hours, which was measured through staining with LysoSensor Green DND-189 which specifically dyes lysosomes and sensitive to ph, bright yellowish green fluorescent at low ph. The brightness decreased and fluorescent faded as ph rise. (B) The fluorescent intensity was measured by using software ImageJ, 30 embryos were measured at each embryonic stage, ***p< (C) Statistical analysis of lysosome size after staining by Lysosensor Green in 500 cell+ stage, comma stage, two fold and three fold+ stages. The size of lysosomes were categorized into three classes, with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5 µm. The proportions of each class were indicated using different color in histogram, n=45. (D) Cathepsin B activity of C. elegans embryos treated with either 10 µg/ml induced product or 10 µg/ml non-induced product, ***p< (E) The expression states of VIT-2::GFP in 100 cells+, comma, two fold and three fold stage of embryos after treating with 10 µg/ml induced product or 10 µg/ml non-induced product for 8 hours, The embryo treated with induced product caused VIT-2::GFP accumulation in later morphogenesis stage following lysosome dysfunction. Yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel, scale bar 10 µm. 3.5 线粒体功能受损导致溶酶体功能异常 诱导产物不仅导致线粒体功能受损, 同时也使溶酶体的功能异常, 那么两 者之间是相互独立的还是相互关联的? 为了验证这一疑问, 通过 RNA 干扰技 76

87 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 术, 分别沉默编码线粒体呼吸链复合体 I 的基因 nuo-1 和复合体 II 基因 mev-1 线虫当中的 nuo-1 与编码人体中线粒体呼吸链复合体 I 亚基的 NDUFV1 是同源基因, 之前的研究报告证实 nuo-1 基因的缺失会导致线粒体的功能受损 (Grad &Lemire,2004) mev-1 基因编码琥珀酸辅酶 Q 氧化还原酶, 而 mev-1 缺失同样会导致线粒体的功能受损 (Senoo-Matsuda et al., 2003) 首先, 在正常条件下, 用 RNAi 沉默 nuo-1 或 mev-1 线虫后产生卵的 ATP 水平与使用空载体干扰的线虫卵相比, 出现了不同程度的下降 ( 图 3.7A) 沉默 nuo-1 或 mev-1 后, 用 H2DCF-DA 检测 ROS, 发现线虫卵中的 ROS 水平有所升高 ( 图 3.7B) 为了进一步确定 ROS 的水平, 使用 DHE 和 CellROX Deep Red 对 ROS 水平进行测定, 发现结果与使用 H2DCF-DA 的检测结果相符 ( 图 3.7C) nuo-1 或 mev-1 RNAi 导致的 ATP 水平下降以及 ROS 水平的升高, 与之前研究报道证实的线粒体功能受损特征相符 (Raimundo., 2014) 我们前面在对诱导产物进行研究时发现,gst-4 的表达受到了抑制 那么 gst-4 在线粒体功能受损与 ROS 水平之间是否存在关联? 我们在沉默 nuo-1 或 mev-1 的基础上同时沉默 gst-4, 结果发现, 沉默 gst-4 后 ROS 水平急剧升高, 升高程度远大于单独沉默 nuo-1 或 mev-1 的线虫卵 ( 图 3.7B,C) 图 3.7 线粒体功能受损导致 ROS 水平升高 A)RNAi nuo-1 或 mev-1 降低线虫卵中 ATP 水平,**p<0.05 ( B) 沉默 nuo-1 或 mev-1 促使线虫卵中 ROS 水平升高 沉默 nuo-1 或 mev-1 的基础上沉默 gst-4 促使 ROS 水平急剧升高,***p<0.001 ( C) DHE,CellRox Deep Red 对线虫胚胎进行染色后确认沉默 nuo-1 或 mev-1 升高线虫卵中 ROS 水平升高, 沉默 nuo-1 或 mev-1 的基础上沉默 gst-4 促使 ROS 水平急剧升高, 标尺为 50 µm 77

88 云南大学博士学位论文 Figure 3.7 Mitochondria dysfunction leads to an increase in ROS level (A) The ATP levels of C. elegans embryos were reduced differently after nuo-1 or mev-1 RNAi compared to empty vector RNAi. **p<0.05. (B) The ROS levels of RNAi nuo-1 or mev-1 embryos were increased, and silencing of gst-4 further enhanced increasing which were measured by using H2DCF-DA. ***p<0.001, (C) DHE and CellRox Deep Red staining confirmed the ROS levels in nuo-1 or mev-1 RNAi embryos were increased, and silencing of gst-4 enhanced further increasing, scale bar 50 µm. 那么线粒体受损是否跟溶酶体的扩大和损伤有所关联呢? 使用 LysoSenor Green 对 nuo-1 或 mev-1 RNAi 后的线虫卵进行染色后发现, 溶酶体酸性程度轻微下降 ( 图 3.8A,B) 然而在沉默 gst-4 后, 溶酶体的酸化程度急剧下降 ( 图 3.8A,B) 相对应的, 溶酶体体积在沉默 gst-4 后出现了明显扩大 ( 图 3.8C) 检测组织蛋白酶 B 活性后发现, 沉默 nuo-1 或 mev-1 后线虫卵中组织蛋白酶 B 活性分别下降了 22% 和 25%( 图 3.8D), 而在沉默 nuo-1 或 mev-1 后再沉默 gst- 4, 组织蛋白酶 B 活性仅为对照组的 30% 左右 ( 图 3.8D) nuo-1 或 mev-1 RNAi 后线虫卵的孵化率与空载体 RNAi 相比为 60% 左右, 而在沉默 gst-4 后降至 30% 左右 ( 图 3.8E) 通过以上实验, 证明缺失编码线粒体内蛋白的基因不仅会导致线粒体产生 ATP 的水平降低, 而且也会增加 ROS 的水平, 伴随线粒体功能受损出现的是溶酶体功能的下降 解毒基因 gst-4 的沉默使 ROS 显著增加, 加剧了溶酶体功能的受损程度 说明溶酶体功能受 ROS 水平的调控, 而溶酶体功能受损程度又直接与卵的孵化率成反比 之前的研究报道证实溶酶体受损后会导致线虫卵无法孵化 (Schaheen et la., 2006), 说明溶酶体功能受损可能是导致线虫卵无法孵化的关键因素 78

89 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.8 线粒体功能受损导致溶酶体功能异常 (A) 沉默 nuo-1 或 mev-1 后溶酶体酸化程度下降 沉默 nuo-1 或 mev-1 的基础上沉默 gst-4 使溶酶体酸化程度进一步下降, 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺为 20 µm (B) 溶酶体 ph 测量使用 LysoSensor Green DND-189 对线虫胚胎染色,500+ 细胞期和 1.5 叠期作为胚胎发育中细胞增殖期以及形态形成期的代表作为测量对象, 柱状图为两个发育阶段的总体荧光强度统计,n=30,**p<0.05 (C) 使用 Lysosensor Green 染色后对胚胎发育阶段中溶酶体增大的程度和数量进行统计, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 + 和 1.5 折叠时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示, 颜色代表不同的直径范围,n=45 (D) 沉默 nuo-1 或 mev-1 以及 nuo-1; gst-4 或 mev-1; gst-4 双干扰后降低线虫卵中组织蛋白酶 B 活性,**p<0.05 (E) 沉默 79

90 云南大学博士学位论文 nuo-1 或 mev-1 导致线虫卵孵化率下降, 沉默 nuo-1 或 mev-1 的基础上沉默 gst-4 使线虫孵化率进一步降低,**p<0.05 Figure 3.8 Mitochondria injury results in lysosome dysfunction (A) Lysosomes ph of 500 cell+ and 1.5 fold stage embryo was decreased after nuo-1 or mev-1 RNAi and silencing of gst-4 enhanced ph further decreasing, yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel, scale bar 20 µm. (B) lysosomes ph was measured by using LysoSensor Green DND-189 staining, n=30,**p<0.05. (C) Statistical analysis of lysosome size after staining by Lysosensor Green in 500 cell+ and 1.5 fold stages. The size of lysosomes were categorized into three classes, with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5 µm. The proportions of each class were indicated using different color in histogram, n=45. (D) Cathepsin B activity in C. elegans embryos of nuo-1 or mev-1 and gst-4 RNAi after that. **p< (E) Mitochondria dysfunction after nuo-1 or mev-1 RNAi which encode mitochondrial protein caused C. elegans embryos hatch rate reduced, and embryos hatch rate was further decreased after gst-4 RNAi. **p< 诱导产物通过抑制 UPR mt 下游伴侣分子导致线粒体功能受损以 及溶酶体功能受损 线粒体中未折叠蛋白反应 (UPR mt ) 是一条维系着线粒体中蛋白折叠稳态的重要机制 在线虫中, 当线粒体功能受损或是受到毒素和病原微生物攻击时 (Durieux et al., 2011; Liu et al., 2014; Pellegrino et al., 2014), 线粒体当中的错误折叠蛋白增加激活 UPR mt 途径上调分子伴侣 hsp-6 和 hsp-60 的表达 (Haynes et al., 2007) 使用表达 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的转基因线虫对线虫卵表型进行分析后显示, 未诱导产物处理 8 小时的线虫卵中,500+ 细胞阶段和 comma 阶段期间 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量非常低 二折叠期中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量开始升高, 三折叠期出现 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量剧增 在刚孵化出的幼虫中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量依然很高且为全身表达 继续培养 10 小时后,Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量回落到基础表达水平, 主要表达在线虫的尾部 ( 图 3.9A-C) 相对于未诱导产物处理下线虫卵中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达模式, 诱导产物处理后的线虫卵并未在二折叠期出现 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量升高, 三折叠期与 80

91 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 刚孵化出幼虫中其表达量也并未出现剧增的现象, 且依然维持在 500+ 细胞阶段和 comma 阶段期间水平 继续培养 10 小时后,Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量低于基础表达水平, 幼虫尾部未观察到 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达 ( 图 3.9A-C) 使用 RT-PCR 检测后发现, 诱导产物处理 8 小时后的线虫卵中 hsp-6 和 hsp-60 mrna 水平低于未诱导产物, 其中 hsp-6 最为显著 ( 图 3.9D) 18 小时后 hsp-6 和 hsp-60 mrna 水平都出现了明显降低 ( 图 3.9E) 这些结果表明, 诱导产物抑制 UPR mt 下游分子伴侣 hsp-6 和 hsp-60 的表达量 81

92 云南大学博士学位论文 图 3.9 诱导产物抑制 UPR mt 下游伴侣分子 hsp-6 和 hsp-60 的表达 (A) 10 µg/ml 诱导产物抑制线粒体未折叠蛋白途径中的分子伴侣 hsp-6 和 hsp-60 表达量 诱导产物或未诱导产物处理 8 小时和 18 小时后使用荧光显微镜观察 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 在不同胚胎阶段表达模式 诱导产物使 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 在胚胎二折叠期低水平表达, 同时抑制三折叠期以及刚孵化幼虫中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量剧增 继续处理 10 小时后, 幼虫中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 的表达量仍然低于未诱导产物中幼虫的基础表达水平, 标尺为 20 µm (B-C) 使用 imagej 对 500 细胞 +, comma, 二折叠, 三折叠以及幼虫中 Phsp-6::gfp 和 Phsp-60::gfp 荧光强度进行测定, 各胚胎阶段用于测定荧光强度的胚胎数为 30, 并用柱状图表示统计结果,***p<0.05 (D) 诱导产物或未诱导产物处理 8 小时后胚胎中 hsp-6 和 hsp-60 的 mrna 水平同样使用柱状图表示,**p<0.05 (E) 诱导产物或未诱导产物处理 18 小时后线虫中 hsp-6 和 hsp-60 的 mrna 水平同样使用柱状图表示,**p<0.05 Figure 3.9 Induced product inhibites expression of UPR mt chaperones hsp-6 and hsp-60 (A)10 µg/ml induced product inhibited expression of chaperones proteins HSP-6, HSP-60 in mitochondrial UPR. Phsp-6::gfp and Phsp-60::gfp expression pattern in different embryonic stages under either non-induced or induced product treatment for 8 hours and 18 hours which were observed using fluorescence microscope. Induced product kept Phsp-6::gfp and Phsp-60::gfp expressing at minimum level in two fold stage and failed to robust expression in three fold stage and new born larva, continued treatment for other 10 hours, Phsp-6::gfp and Phsp- 82

93 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 60::gfp expression level still maintained at low level, scale bar 20 µm.(b-c)the fluorescent intensities of 500 cell+, comma, two fold, three fold and larva were measured by using imagej. The statistical analysis of fluorescent intensity in each embryonic stage was present in column chart. n=30.**p<0.05.(d)the mrna levels of hsp-6 and hsp-60 in total embryo after 8 hours treatment present in histogram.**p<0.05.(e)the mrna levels of hsp-6 and hsp-60 in total embryo after 18 hours treatment present in histogram. **p<0.05. 那么 hsp-6 和 hsp-60 基因表达下降是否会造成线粒体功能受损? 为了验证这一疑问, 我们利用 RNAi 对线虫中 hsp-6 进行基因沉默后 在正常条件下, 沉默 hsp-6 后不仅降低 hsp-60 的表达量 ( 图 3.10A), 还会导致线虫胚胎中的线粒体网络出现断裂 ( 图 3.10B), 同时也会降低胚胎中的 ATP 水平 ( 图 3.10C) 引起与线粒体受损相同的线粒体机能下降和之前研究的报道相符 (Kimura et al., 2007) 同样的, 在沉默 hsp-6 的基础上沉默 gst-4 后, 用 H2DCF-DA 检测 ROS, 发现 ROS 水平急剧升高 ( 图 3.10D) 使用 DHE 和 CellROX Deep Red 进行验证也获得了相似的结果 ( 图 3.10E) 以上实验证明, 抑制 hsp-6 和 hsp-60 的表达水平, 造成线粒体的功能受损以及 ROS 水平升高 图 3.10 下调 hsp-6 和 hsp-60 的表达导致线粒体功能受损 83

94 云南大学博士学位论文 (A) 沉默 hsp-6 导致线虫胚胎中 hsp-60 mrna 水平降低,***p<0.001 ( B) 沉默 hsp-6 导致线虫胚胎中的线粒体网络出现断裂, 使用多细胞阶段和三折叠 + 时期作为胚胎细胞扩增期以及形态形成期的代表, 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺 :10 µm (C)hsp-6 RNAi 降低线虫卵中 ATP 水平,**p<0.05 ( D)hsp-6 RNAi 或双干扰 hsp-6; gst-4 升高线虫卵中 ROS 水平升高,***p<0.001 (E) DHE 和 CellRox Deep Red 对线虫胚胎进行染色后确认 ROS 水平, 在 RNAi hsp-6 或双干扰 hsp-6; gst-4 后升高, 标尺为 50 µm Figure 3.10 Down-regulation of hsp-6 and hsp-60 causes mitochondria dysfunction (A) The hsp-60 mrna level was reduced after hsp-6 RNAi. **p<0.05. (B) The morphology of mitochondria in 500cell+ and three fold stages of C. elegans embryos after wroms were subjected to hsp-6 RNAi, yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel. Scale bar 10 µm. (C) hsp-6 RNAi reduced the ATP levels in C. elegans embryos. **p<0.05. (D) The ROS levels of hsp-6 RNAi alone or hsp-6; gst- 4 RNAi embryos were increased which were measured by H2DCF-DA. ***p< (E) DHE and CellRox Deep Red staining confirmed the ROS levels rising after hsp-6 RNAi alone or hsp-6; gst-4 RNAi. Scale bar 50 µm. 既然沉默 hsp-6 和 gst-4 会导致 ROS 水平急剧升高, 那么是不是也会导致溶酶体功能受损呢? 为了验证这一猜测, 我们对 hsp-6 和 gst-4 进行共同沉默的线虫卵进行了 LysoSenor Green 和组织蛋白酶 B 活性的分析 结果发现沉默 hsp-6 和 gst-4 也可以导致线虫卵溶酶体中 ph 值的升高 ( 图 3.11A,B) 和溶酶体直径扩大, 其扩大程度与诱导产物导致的溶酶体扩大程度相当 ( 图 3.11C) 沉默 hsp-6 和 gst-4 同时降低组织蛋白酶 B 的活性 ( 图 3.11D) 证实溶酶体功能同样受到损伤, 而与溶酶体功能受损对应的是线虫卵孵化率的降低 ( 图 3.11E) 以上实验说明, 诱导产物通过抑制线粒体当中未折叠蛋白途径下游的分子伴侣 hsp-6 和 hsp-60 的表达导致线粒体功能受损, 而对 gst-4 的表达抑制促使 ROS 水平急剧升高进而损伤溶酶体的功能 84

95 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.11 下调 hsp-6 和 gst-4 基因表达导致溶酶体扩大和功能受损 (A) 使用 LysoSensor Green DND-189 对 RNAi hsp-6 和 gst-4 后线虫胚胎染色, 以 500+ 细胞期和 1.5 叠期为研究对象, 图中黄色箭头标记区域放大后置于图片的左上方, 标尺为 20 µm ( B) 柱状图为两个发育阶段的总体荧光强度统计用以分析溶酶体 ph 值,n=30, ***p<0.001 (C) 使用 Lysosensor Green 染色后对胚胎发育阶段中溶酶体增大的程度和数量进行统计, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm, 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 + 和 1.5 折叠时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示, 颜色代表不同的直径范围,n=30 (D)hsp-6 和 gst-4 RNAi 降低线虫卵中组织蛋白酶 B 活性,***p<0.001 ( E)hsp-60 和 gst-4 RNAi 后线虫胚胎孵化率降低,**p<0.05 Figure 3.11 Gene silencing of hsp-6 and gst-4 leads to lysosome expansion and dysfunction (A) The fluorescent picture of hsp-6 and gst-4 RNAi embryos which were staning by Lysosensor Green, yellow arrowhead indicated enlarged area of picture which placed on upper left panel. Scale bar 20 µm. (B) Lysosomes ph of hsp-6 and gst-4 RNAi in 500 cell+ and 1.5 fold stage embryos were increased, which was measured by using LysoSensor Green DND-189 staining. n=30. ***p< (C) Statistical analysis of lysosome size after staining by Lysosensor Green in 500 cell+ and 1.5 fold stages. The size of lysosomes were categorized into three classes, with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5 µm. The proportions of each class were indicated 85

96 云南大学博士学位论文 using different color in histogram, n=30. (D) Cathepsin B activity of C. elegans embryos after hsp-6 and gst-4 RNAi. ***p< (E) C. elegans embryos hatch rates reduced after hsp-6 and gst-4 RNAi compared to empty vector RNAi. **p< 诱导产物抑制线虫卵中的自噬流 自噬是一条高保守的降解途径, 可以选择性地去除损坏的细胞器或蛋白聚集体或入侵致病菌, 是机体中重要的质量监控系统 (Levine et al., 2008) 前面我们已经证明, 诱导产物可导致线粒体的功能受损, 而受损的线粒体一般会经由自噬途径进行降解, 故而被称为线粒体自噬 (Youle et al., 2011) Atg8/LC3 作为标记物被广泛地用于监测自噬活动 (Mizushima et al., 2010) 线虫中含有两个 Atg8 的同源基因 lgg-1 和 lgg-2, 其中 lgg-1 为最广泛地被用于研究线虫自噬活动的标记物 (Zhang et al., 2015) 我们用诱导产物处理表达 GFP::LGG-1 的转基因线虫卵 8 小时后, 对线虫卵的自噬进行了统计 结果发现, 诱导产物处理后的线虫卵中 GFP::LGG-1 光斑 (puncta) 数量较非诱导产物处理显著减少 ( 图 3.12A,B) 为了进一步检测线虫卵中的自噬情况, 我们使用表达 SQST- 1::GFP 的线虫卵对诱导产物的作用进行了检测 SQST-1 为自噬的底物, 通常情况下, 在整个胚胎发育过程中以弥散状态分布于细胞质中 (Tian et al., 2010) 当自噬受抑制时,SQST-1 水平增高并形成大量的 SQST-1 聚集物, 以光块的形式存在与胚胎当中 (Zhang et al., 2015) 诱导产物处理 8 小时后, 我们发现 SQST-1::GFP 的线虫卵出现大量的斑块 ( 图 3.12C) Western blot 进一步证明, SQST-1 在诱导产物处理后出现累积 ( 图 3.12D,E), 从而证明, 诱导产物抑制了线虫卵中的自噬流 (Autophagic flux) 这些结果表明, 诱导产物导致自噬流受阻, 可能使得受损的线粒体得不到清理 86

97 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.12 诱导产物抑制自噬流诱导产物处理 8 小时后线虫卵中的自噬活动 (A) GFP::LGG-1 线虫 comma 和二折叠的卵中形成点状结构, 标尺 :10 µm 统计 comma 和二折叠的卵中点状结构的数量并用柱形图表示于图右方, 所统计卵的数量列于柱形图上方,***p<0.01,Non-induced: 未诱导产物,Induced: 诱导产物 (B)SQST-1::GFP 在诱导处理后线虫 500 细胞 + 和三折叠卵中形成光块, 标尺 :10 µm(c) 含有 SQST-1::GFP 的各时期线虫卵的总蛋白的 Western blot, 使用 anti-gfp 抗体进行标记,Western blot 的结果统计列于图的右方,***p<0.01 Figure 3.12 Induced product inhibits autophagic flux Autophagy activity in embryos after exposuring to induced metabolites for 8 hours. (A) GFP::LGG-1 puncta in comma and two fold embryos stage. scale bar:10 µm, statistical analysis of punctate number in comma and two fold embryos stage were listed at right panel as histogram.***p<0.01, Non-induced: Non-induced product, Induced: induced product. (B) SQST-1::GFP was aggregated in 500 cell+ and three fold embryos, scale bar: 10 µm. (C) Western blotting of SQST-1::GFP in embryos. Statistical analysis of western blotting placed at right panel. ***p< 诱导产物增加 ROS 水平导致溶酶体功能受损使线虫卵不孵化 87

98 云南大学博士学位论文 通过之前的实验结果, 我们发现线虫卵在诱导产物的影响下 ROS 水平升高, 那么阻止 ROS 的升高是否能恢复卵的孵化率呢? 为了验证这一假设, 我们在诱导产物对线虫卵进行处理时分别添加四种抗氧化剂 :N- 乙酰 -L- 半胱氨酸 (NAC), 谷胱甘肽乙酯 (GSH-MEE), 维生素 D3(VD3) 以及 α- 生育酚 (αtocopherol) 我们发现, 添加 0.5 mm 维生素 D3 或 0.5 mm α 生育酚能够显著降低诱导产物处理 8 小时后线虫胚胎中的 ROS 升高 ( 图 3.13A) 使用 DHE 和 CellRox Deep Red 染色后证明, 维生素 D3 和 α 生育酚降低由诱导产物引起的 ROS 水平增高 ( 图 3.13B) 1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 不能阻止 ROS 的水平升高 ( 图 3.13C) DHE 和 CellROX Deep Red 的染色结果也证实 1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 不能降低由诱导产物引起的 ROS 水平升高 ( 图 3.13D) 图 3.13 抗氧化剂阻止由诱导产物引起的 ROS 水平升高 (A)0.5 mm 维生素 D3 或 0.5 mm α- 生育酚 (α-toc) 明显降低由诱导产物引起的 ROS 升高,***p< ( B) 使用 DHE 和 CellRox Deep Red 对线虫胚胎进行染色后确认维生素 D3 和 α- 生育酚能阻止由诱导产物引起的 ROS 水平, 标尺为 50 µm ( C)1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 不能降低又诱导产物引起的 ROS 升高 (D)DHE 和 CellROX Deep Red 染色确认 1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 不能降低由诱导产 88

99 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 物引起的 ROS 升高, 因 (D) 图与 (B) 图使用相同的放大倍数, 故而不再标注标尺 Figure 3.13 Antioxidants inhibit an increase in ROS level by induced product (A) 0.5 mm vitamin D3 and 0.5 mm α-tocopherol moderated a decrease in ROS level in embryos after 10 µg/ml induced product treatment. ***p< (B) DHE and CellRox Deep Red staining have further confirmed the 0.5 mm vitamin D3 and 0.5 mm α-tocopherol (α-toc) reduced ROS increased by induced product. Scale bar 50 µm. (C) 1 mm NAC and 1 mm GSH-MEE failed to prevent ROS promoted by induced product. (D) DHE and CellRox Deep Red staining further confirmed that 1 mm NAC and 1 mm GSH-MEE failed to impede ROS promoted by induced product. The pictures were taken under same resolution as pictures (B), therefore using scale bar in (B). 维生素 D3 据研究报道证实具有广泛的解毒功能, 能够经由 SKN-1 激活其下游靶基因 gst-4(mark, et al., 2016) 通过实验, 我们发现维生素 VD3 上调了在 500 细胞 +,comma 以及三折叠期胚胎中 Pgst-4::gfp 的表达 ( 图 3.14A,B) 而 α 生育酚没有上调 gst-4 沉默 gst-4 后,VD3 不能阻止 ROS 的水平升高 ( 图 3.14C) 证明维生素 D3 通过上调 gst-4 的表达降低 ROS 水平, 而 α 生育酚则可能利用其它机制阻止 ROS 的升高 图 3.14 维生素 D3 上调诱导产物处理的线虫卵中 gst-4 表达水平 (A) 荧光照片与 DIC 照片嵌合显示线虫卵在诱导产物处理时分别加入无水乙醇 ( 溶剂 ),0.5 mm 维生素 89

100 云南大学博士学位论文 D3 和 0.5 mm α- 生育酚 (α-toc) 作用 8 小时后的 Pgst::gfp 在胚胎多细胞阶段,comma 阶段以及三折叠 + 中的表达情况, 标尺 :20 µm (B) 使用 IamgeJ 对 Pgst-4::gfp 荧光强度进行测量统计,Pgst-4::gfp 在加入 0.5 mm 维生素 D3 后在胚胎多细胞阶段,comma 阶段以及三折叠 + 时期中表达显著上调,n=30,*p<0.05 (C)DHE 和 CellRox Deep Red 对沉默 gst-4 的线虫卵用诱导产物处理后的染色, 空载体 (EV) 作为基因沉默的阴性对照, 标尺 :50 µm Figure 3.14 Vitamin D3 up-regulates gst-4 expression in induced product treated embryos (A) The pictures were created using DIC merged with fluorescent image, showing Pgst-4::gfp expression in induced product treated embryos while adding ethanol (solvent), 0.5 mm vitamin D3 and 0.5 mm α-tocopherol (α- TOC) for 8 hours. Scale bar 20µm. (B) The fluorescent intensity of Pgst-4::gfp was increased in 500 cell+, comma and three fold+ stages after adding 0.5 mm vitamin D3. n=30. *p<0.05. (C) The embryo from C.elegans which was subjected to gst-4 or empty vector (EV) RNAi, treated with induced product following DHE and CellRox Deep Red staining. Scale bar 50 µm. 维生素 D3 和 α- 生育酚在降低 ROS 水平的同时显著恢复诱导产物作用下, 18 个小时后的线虫胚胎的孵化率以及孵化后幼虫的存活率 ( 图 3.15 A,B) 相反的, 加入 NAC 和 GSH-MEE 并没有恢复线虫卵的孵化率, 但是, 使在诱导产物处理后孵化出的幼虫存活率提升至了 20% 左右 ( 图 3.15 C,D) 图 3.15 抗氧化剂恢复诱导产物处理下的线虫卵孵化率和孵化后的幼虫存活率 (A)0.5 mm 维生素 D3 和 0.5 mm α- 生育酚 (α-toc) 能够显著恢复诱导产物处理下线虫卵的孵化率, ***p<0.01 ( B)0.5 mm 维生素 D3 和 0.5 mm α- 生育酚 (α-toc) 能够显著提高诱导产物处理下孵化出的 90

101 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 幼虫存活率,***p<0.01 ( C)1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 不能恢复诱导产物处理下线虫卵的孵化率 (D)1 mm NAC 和 1 mm GSH-MEE 轻微提高诱导产物处理下孵化出的幼虫存活率,***p<0.01 Figure 3.15 Antioxidants restores the egg hatch rates and larva survival after treatment of induced prouct (A) The hatch rates of embryos after 10 µg/ml induced product treatment were significantly increased after adding of either 0.5 mm vitamin D3 or 0.5 mm α-tocopherol (α-toc). ***p< (B) 0.5 mm vitamin D3 or 0.5 mm α-tocopherol greatly improved the survive rate of hatched embryo after 10 µg/ml induced products treatment. ***p < (C) The hatching rates of embryos after 10 µg/ml induced products treatment were not restored after adding either 1 mm NAC or 1 mm GSH-MEE. (D) The hatched embryo after 10 µg/ml induced product treatment survived slightly better after addedtion of either 1 mm NAC or 1 mm GSH-MEE compared to adding ddh 2 O. ***p< 在使用 LysoSenor Green 染色和组织蛋白酶 B 活性的分析后发现, 维生素 D3 和 ɑ- 生育酚处理使溶酶体的酸化程度得到了明显恢复 ( 图 3.16 A,B), 而 NAC 和 GSH-MEE 处理后则没有恢复溶酶体的酸化程度 ( 图 3.16 C,D) 91

102 云南大学博士学位论文 图 3.16 抗氧化剂恢复诱导产物处理下线虫卵中的溶酶体酸化程度 (A-B)LysoSensor Green DND-189 染色显示 0.5 mm 维生素 D3 或 0.5 mm α- 生育酚 (α-toc) 显著恢复由 10 µg/ml 诱导产物导致的溶酶体酸化程度降低, 标尺为 50 µm,***p<0.001 (C-D)LysoSensor Green DND-189 染色显示 1 mm NAC 或 1 mm GSH-MEE 处理后,10 µg/ml 诱导产物中的溶酶体酸化程度没有变化, 标尺使用 (A) 图标尺 Figure 3.16 Antioxidants restores the ph in lysosomes after treatment of induced product (A-B) LysoSensor Green DND-189 staining indicated that 0.5 mm vitamin D3 or 0.5 mm α-tocopherol partially restored ph in lysosomes of 10 µg/ml induced product treated embryos. Scale bar 50 µm. ***p< (C-D) LysoSensor Green DND-189 staining indicates that 1 mm NAC or 1 mm GSH-MEE failed to change the ph in lysosome of 10 µg/ml induced product treated embryos. Scale bar use the same scale bar in picture (A). 维生素 D3 和 α- 生育酚在恢复溶酶体酸化程度的同时显著减轻了, 在诱导产物作用下溶酶体出现的体积扩大 ( 图 3.17 A) 随着溶酶体酸化程度和形态的恢复, 溶酶体的功能也得到了回升 ( 图 3.17 B) 相反,NAC 和 GSH-MEE 不仅不能恢复溶酶体的形态 ( 图 3.17 C), 而且组织蛋白酶 B 的活性也未得到回升 ( 图 3.17 D) 维生素 D3 和 α- 生育酚在降低 ROS 水平的同时也使溶酶体的功能得到回升 说明由线粒体功能受损介导的溶酶体功能降低以及溶酶体增大是由过量 ROS 介导的 92

103 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.17 抗氧化剂恢复溶酶体的形态和功能 (A) 使用 Lysosensor Green 染色后对 10 µg/ml 诱导产物处理中添加 0.5 mm 维生素 D3 或 0.5 mm α- 生育酚 8 小时后的溶酶体直径进行统计, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm, 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 + 时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示 颜色代表不同的直径范围,n=30 ( B)0.5 mm 维生素 D3 或 0.5 mm α- 生育酚恢复由 10 µg/ml 诱导产物引起的线虫卵中组织蛋白酶 B 活性的降低,***p<0.001 ( C) 使用 Lysosensor Green 染色后对 10 µg/ml 诱导产物处理中添加 1 mm NAC 或 1 mm GSH-MEE 8 小时后的溶酶体直径进行统计, 将溶酶体大小划分三种, 分别为直径范围 µm, 1.5 µm -3.5 µm 以及 3.5 µm 统计 500 细胞 + 时期胚胎中处于不同直径范围内的溶酶体数量, 用柱状图表示 颜色代表不同的直径范围,n=30 ( D) 添加 1 mm NAC 或 1 mm GSH- MEE 不能回升由 10 µg/ml 诱导产物引起的线虫卵中组织蛋白酶 B 活性的降低 Figure 3.17 Antioxidants restores lysosomes morphology and function (A) Statistical analysis of lysosome size after staining by Lysosensor Green in 500 cell+ stages in embryos treated with 10 µg/ml induced product while adding 0.5 mm vitamin D3 or 0.5 mm α-tocopherol. The size of lysosomes were categorized into three classes with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5 µm. The proportions of each class were indicated using different color in histogram, n=30. (B) 0.5 mm vitamin D3 or 0.5 mm α- tocopherol improved cathepsin B activity in C. elegans embryos after 10 µg/ml induced product treatment. ***p< 93

104 云南大学博士学位论文 (C) Statistical analysis of lysosome size stained by Lysosensor Green in 500 cell+ stages in embryos treated with 10 µg/ml induced product after adding of 1 mm NAC or 1 mm GSH-MEE. The size of lysosomes were categorizes into three classes with range from 0.5 to 1.5 µm, 1.5 to 3.5 µm and 3.5µm. The proportions of each class were indicated using different color in histogram, n=30. (D) 1 mm NAC or 1 mm GSH-MEE failed to restore the cathepsin B activity in C. elegans embryos after 10 µg/ml induced product treatment. 4. 讨论 在自然界中, 许多微生物可以产生不同的毒素和分泌物 (Cires et al., 2017), 其中一些拥有杀虫活性 例如 : 荧光假单胞菌分泌物中的氰化氢以及环脂肽能够有效杀死昆虫幼虫, 减低植物病害 (Flury et al., 2017) 嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophila) 所产生的分泌物被证实能够杀死埃及伊蚊的幼虫 (Luiz Rosa da Silva et al., 2017) 而有一些则是具有致病性的毒素, 例如 : 金黄色酿脓葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的内毒素 B(Hurst et al., 1972) 镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素 (Zhang et al., 2017) 丝状真菌的毒枝菌素 (Hojnik et al., 2017) 以及铜绿假单胞菌分泌的毒素 2- 庚基 -4- 羟基喹啉 -N- 氧化物 (Thierbach et al., 2017) 等都能对人体健康造成威胁 鼻疽诺卡氏菌同样产生含有多种生物活性的分泌物, 其中一些是新发现的次级代谢 这些分泌物的生物活性涵盖抗真菌 抗肿瘤以及抑制免疫的作用 (Mikami et al., 2010) 其中, 吩嗪衍生物是一种由诺卡菌属 链霉菌属以及假单胞菌属产生的次代产物, 在造成 ROS 升高的同时导致线虫体内蛋白聚集, 尤其是在多巴胺神经元内 (Ray et al., 2015) 本研究在对鼻疽诺卡氏菌分泌物进行研究后中发现, 线虫诱导下鼻疽诺卡氏菌产生的分泌物能够以依赖剂量的方式, 有效地抑制线虫卵的孵化 相反的, 鼻疽诺卡氏菌在不接触线虫的情况下所产生的分泌物不能抑制线虫卵的孵化 说明鼻疽诺卡氏菌分泌物中, 抑制线虫卵孵化的组份是鼻疽诺卡氏菌应答捕食压力机制下的产物 我们在对诱导产物下未孵化线虫卵进行分析后发现, 诱导产物导致线粒体网络形态改变, 在促进 ROS 升高的同时抑制解毒基因 gst-4 的表达 降低线粒体机能的同时, 溶酶体功能在诱导产物的影响下出现受损 沉 94

105 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 默 nuo-1 或 mev-1 在影响线粒体复合体 I 或 II 功能的原理下致使线粒体受损 (Grad &Lemire, 2004; Senoo-Matsuda et al., 2003), 表现为线粒体机能下降以及 ROS 的升高 我们发现在沉默 gst-4 后, 促使由沉默 nuo-1 或 mev-1 诱导的 ROS 进一步升高, 相对应的是溶酶体受损程度的加剧 揭示由线粒体受损产生的 ROS 可能是破坏溶酶体功能的关键要素 的确, 在对神经退行性疾病的研究中证实线粒体功能受损后产生的 ROS 是破坏溶酶体功能的根本因素 (Demers- Lamarche et al., 2016) 我们的研究发现, 诱导产物以抑制线粒体未折叠反应中分子伴侣 hsp-6, hsp-60 和解毒基因 gst-4 的表达为前提, 导致线虫卵中 ROS 水平急剧升高最终导致溶酶体功能受损从而致使线虫卵不能孵化 ( 图 3.9) 同时, 我们发现当线粒体受损后线虫胚胎在诱导产物的作用下自噬流不仅没有增加, 反而出现了下降, 并导致自噬底物出现明显累积 自噬作为机体中重要的清除途径, 承担着清除机体中受损细胞器和蛋白聚集体的作用 (Zhang et al., 2011) 清除途径的受阻往往伴随着溶酶体功能的受损而产生 (Dehay et al., 2010) 当清除途径受阻后, 受损的细胞器和蛋白质大量累积在机体中, 对机体造成进一步的氧化损伤 (Norris et al., 2005) 这意味着拥有修复自身损伤的分子和机制是机体面对衰老和疾病时得以存活的根本 的确, 线虫中 hsp-6 和哺乳动物热激蛋白 mthsp70 同源 mthsp70 被证实作为线粒体蛋白的进口马达蛋白参与线粒体的合成 (Voos et al., 2002), 同时也参与 ROS 的产生 (Liu et al., 2005) 细胞增殖 (Wadhwa et al., 2004) 以及调控寿命 (Kaul et al., 2003) 在线虫中过表达 hsp- 6 被证实能够延长线虫的寿命 (Yokoyama et al., 2002), 相反沉默 hsp-6 则会在线虫中造成类似早衰的表型 (Kimura et al., 2007) 据报道, 在帕金森综合症的患者中 mthsp70 的表达量减少 (Jin et al., 2006) 而由错误蛋白累积导致的蛋白聚集是帕金森综合症这一类神经退行性疾病中最常见的病理特征 (Saur et al., 2006) 线虫受到铜绿假单胞菌 PA14 侵染时通过胞外调节激酶 (ERK) 信号途径上调自噬 虽然研究表明, 自噬不能降低线虫肠道内的细菌载量, 但能有限抑制线虫肠道细胞的坏死从而增加线虫在 PA14 上的存活时间 (Zou et al., 2014) 相应的, 这些分子和机制也极易成为细菌致病因子的攻击靶点, 嗜肺性军团病杆菌 (legionella pneumophila) 蛋白和伤寒沙门氏菌就被证实能够抑制宿主的自 95

106 云南大学博士学位论文 噬机制 (Choy et al., 2012; Lv et al., 2012) 诺卡氏菌被证实能够造成小鼠出现类似帕金森的症状 (Beaman et al., 1994), 而帕金森综合症与 mthsp 70 的关系使我们可以认为诺卡氏菌家族带有下调 mthsp70 的致病因子 本研究证实线虫诱导产生的诱导产物通过作用于线粒体未折叠下游伴侣分子导致线粒体断裂 ATP 水平降低以及 ROS 水平的升高, 这些特征往往是线粒体功能的受损的表现 (Raimundo., 2014) 而线粒体受损又是神经退行性疾病的主要特征, 例如阿兹海默综合症, 帕金森综合症以及亨廷顿舞蹈症 (Nunnari& Suomalainen., 2014) 活性氧 (ROS) 经常伴随着线粒体功能的损伤和错误折叠蛋白的累积而升高 (Keeney et al., 2006; Esteves et al., 2009; Karuppagounder et al., 2009; Batelli et al., 2008) 对神经退行性疾病的研究中发现 ROS 介导的损伤不仅表现在神经上 (Patten et al., 2010), 同时也表现在改变溶酶体功能上 (Dodson et al., 2013) 的确,ROS 的急剧升高能造成小鼠细胞中溶酶体功能受损以及溶酶体的扩大 (Demers-Lamarche et al., 2016) 溶酶体功能受损被证实引起清理途径功能受阻致使聚集蛋白以及底物累积最终导致细胞受损死亡 (Cox et al., 2012) 抗氧化剂维生素 D3 通过上调 gst-4 的表达消除由线粒体受损产生的 ROS, 从而保护溶酶体功能使线虫卵以及孵化出的幼虫增加对诱导产物的耐受能力 值得一提的是,α 生育酚通过清除 ROS 同样使溶酶体的功能得到恢复 说明 ROS 在伴随线粒体损伤出现的溶酶体表型中扮演着至关重要的角色 然而, 目前 ROS 损伤溶酶体的机制仍然不太清楚 虽然不能排除存在 ROS 直接损伤溶酶体功能的机制, 但是, 由一个细胞器损伤影响另一个细胞器功能的交叉调控中,ROS 也有可能是作为信号分子存在的 从细菌到哺乳动物, ROS 被证实以信号分子的角色参与细胞中复杂的信号网络, 调控着机体的新陈代谢 免疫和应激机制等 (Mittler et al., 2011) 故而在线粒体损伤后有可能是通过 ROS 改变细胞的代谢水平和基因表达, 最终影响溶酶体功能 本研究以鼻疽诺卡氏菌分泌物为研究对象, 揭示由线粒体损伤升高 ROS 介导溶酶体功能受阻的机制不仅存在于哺乳动物中, 也存在于无脊椎动物中, 说明这种机制可能是进化保守的 鼻疽诺卡氏菌以这种机制抑制线虫卵孵化为应答食菌线虫捕食压力的手段, 有效减少线虫种群数量达到自我防御的目的 96

107 第三章鼻疽诺卡氏菌分泌物抑制线虫卵不孵化的机制 图 3.18 诱导后鼻疽诺卡氏菌的分泌物抑制线虫卵孵化的机制模型 Figure 3.18 The mode of action used in N. farcinica induced product to inhibited C. elegans embryos from hatch 97