htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(14) 1259 (3strains),typeC(4strains),typeD(3strains),typeE(7strains),andtypeF(1strain).ThetypeC andtypeestrain

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崇融刁
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1 1258 DOI: /j 多重耐药铜绿假单胞菌的两种同源性分析方法的比较李进 1, 胡韦维 2, 张峰领 1, 黎敏 1, 陈鸣 1, 邓少丽 1 1 1, 鲁卫平重庆 , 陆军军医大学 ( 第三军医大学 ) 第三附属医院 ( 野战外科研究所 ) 检验科 ; 2 重庆 , 重庆医科大学附属儿童医院检验科 [ 摘要 ] 目的以脉冲场凝胶电泳 (pulsedfieldgelelectrophoresis,pfge) 为金标准, 评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (matrix asistedlaserdesorption/ionizationtime of flightmasspectrometry, MALDI TOFMS) 在多重耐药铜绿假单胞菌 (multi drugresistantpseudomonasaeruginosa,mdr PA) 同源性分析中应用的可行性方法收集陆军军医大学第三附属医院 2017 年 1-12 月重症监护病房住院患者分离的 20 株 MDR PA 非重复菌株, 利用 VITEKMSSARAMIS 软件对 MDR PA 蛋白图谱进行聚类分析, 同时对其进行 PFGE 同源性分析, 并将两种方法所得的分型结果进行对比分析结果 MALDI TOFMS 同源性分析结果与 PFGE 同源性分析结果比较显示,20 株 MDR PA 通过 MALDI TOFMS 聚类分析将其分为三大簇 (Ⅰ 型 13 株,Ⅱ 型 6 株,Ⅲ 型 1 株 ), 而依据 PFGE 分型结果则将其分为 6 种亚型 (A 型 2 株,B 型 3 株,C 型 4 株,D 型 3 株,E 型 7 株,F 型 1 株 ), 其中有 C 型和 E 型中具有相同基因型菌株间, 其 MALDI TOFMS 亲缘性关系也较近, 而其余 4 种亚型菌株间亲缘性比较, 发现 PFGE 分型结果与 MALDI TOFMS 聚类分析结果不完全相符结论与 PFGE 同源性分析相比,MALDI TOFMS 同源性分析结果一致性不稳定, 具有一定局限性, 尚不能取代 PFGE 同源性分析 [ 关键词 ] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ; 脉冲场凝胶电泳 ; 多重耐药铜绿假单胞菌 ; 同源性分析 [ 中图法分类号 ] R372;R [ 文献标志码 ] A ComparisonofMALDI TOF MS and PFGE forhomology analysisofclinical isolatesofmulti drugresistantpseudomonasaeruginosa LIJin 1,HUWeiwei 2,ZHANGFengling 1,LIMin 1,CHENMing 1,DENGShaoli 1,LUWeiping 1 1 Departmentof ClinicalLaboratory,InstituteofSurgeryResearch,ThirdAfiliatedHospital,ArmyMedicalUniversity(ThirdMilitary MedicalUniversity),Chongqing,400042; 2 DepartmentofClinicalLaboratory,Children shospitalofchongqing MedicalUniversity,Chongqing,400014,China [Abstract] Objective Toasesthefeasibilityofusingmatrix asistedlaserdesorption/ionization time of flightmasspectrometry(maldi TOFMS)forhomologyanalysisofmulti drugresistantpseudomonas aeruginosa(mdr PA)withpulsed fieldgelelectrophoresis(pfge)asthegoldstandard.methods Twenty clinicalisolatesofmdr PAwerecolectedfromtheintensivecareunit(ICU)ofourThirdAfiliatedHospital intheyear2017.saramissoftwarewasusedforclusteranalysisoftheisolates,andtheirhomologywas analyzedusingpfgeandmaldi TOFMS.Results HomologyanalysisbyMALDI TOFMSgroupedthe20 MDR PAstrainsinto3clusters(13typeⅠ strains,6typeⅡ strains,and1typeⅢ strain).accordingto PFGEclasificationresults,thesestrainsweredividedinto6subtypes,namelytypeA(2strains),typeB [ 基金项目 ] 国家自然科学基金重点项目 ( ); 全军后勤计划重大专项课题子课题 (AWS14C003 2) [ 通信作者 ] 鲁卫平,E mail:ronnylu@126.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(14) 1259 (3strains),typeC(4strains),typeD(3strains),typeE(7strains),andtypeF(1strain).ThetypeC andtypeestrainsclasifiedbypfgewereconsistentwiththeresultsofclusteranalysisbymaldi TOFMS, buttheresultsofpfgeclasificationandmaldi TOFMSclusteranalysisshoweddiscrepanciesinhomology analysisofthestrainsoftheother4subtypes.conclusion ComparedwithPEGE,MALDI TOFMShas certainunstabilityandlimitationsinhomologyanalysisofclinicalisolatesofmdr PA,andstilcan treplace theother. [Keywords] matrix asistedlaserdesorption/ionizationtime of flightmasspectrometry;pulsed field gelelectrophoresis;multi drugresistantpseudomonasaeruginosa;homologyanalysis SupportedbythekeyProgram ofnationalnaturalsciencefoundationofchina( ) andthemajorspecialprojectofmilitarylogisticplan (AWS14C003 2).Corespondingauthor:LUWeiping,E 铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa,PA) 是医院感染的常见条件致病菌之一, 随着抗菌药物的广泛使用, 铜绿假单胞菌出现多重耐药的现象日趋严重, 甚至出现多重耐药铜绿假单胞菌 (multi drugresistant Pseudomonasaeruginosa,MDR PA) 在医院 ICU 病房爆发流行的情况, 给临床抗感染治疗带来极大的困难 MDR PA 具有传播途径广致病性强等特点,MDR PA 的克隆性流行一直是医院感染控制工作的监测重点, 通常使用分子生物学分型方法对分离菌株进行监测 [1-2] 常用方法有多位点序列分析(MLST) 脉冲场凝胶电泳分析 (PFGE) 等等 [3-4], 这些方法主要是根据细菌的染色体大小差异进行分型及同源性分析, 稳定性和准确性均较好, 但同时存在耗时较长, 操作复杂等缺点, 不适用于临床快速检测, 且不是实验室具备的常规仪器设备和技术, 难以在临床实验室进行推广运用, 不宜作为常规监测手段基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (matrix asisted laserdesorption/ionization time of flightmasspectrometry,maldi TOFMS) 作为目前临床微生物实验室中的一项新技术, 除鉴定细菌外, 还可以利用 ClinProTools SARAMIS 等分析软件对细菌蛋白图谱进行聚类分析, 及时为医院感染控制和流行病学调查研究提供实验室证据 MALDI TOFMS 同源性分析具有快速价格低廉准确等优点, 且目前国内外均有研究报道将 MALDI TOFMS 技术应用于病原菌同源性分析 [5-8], 因此 MALDI TOFMS 在该领域的研究也逐渐成为大家关注的热点本研究旨在明确 ICU 病房是否存在 MDR PA 克隆传播, 评价 MALDI TOF MS 技术用于 MDR PA 同源性分析的可行性 1 材料与方法 1.1 菌株来源收集 2017 年 1-12 月陆军军医大学第三附属医院临床分离 ICU 非重复 MDR PA 菌株 20 株大肠埃希菌 ATCC8739 为质谱鉴定试验质控菌株, 为本实验室保存 1.2 仪器与试剂 GNP29270 型恒温培养箱 ( 上海精宏实验室设备有限公司 ),VITEK MS 质谱仪 ( 法国生物梅里埃公司 ), 恒温摇床 ( 上海世平实验设备有限公司 ), 电泳胶制作模具 ( 美国 BIO RAD 公司 ), 脉冲场凝胶电泳仪 ( 美国 BIO RAD 公司 ), 凝胶成像仪 ( 美国 BIO RAD 公司 ), 菌栅胶制作模具 ( 美国 BIO RAD 公司 ) 试剂 : VITEKMSCHCA 基质液 ( 法国生物梅里埃公司 ), 血琼脂平皿 (OXOID 公司 ), 甲酸乙腈无水乙醇 ( 重庆川东化工有限公司 ) 溶菌酶 (Biosharp 公司 ), 蛋白酶 K(Sigma 公司 ), 限制性内切酶 XbaⅠ( 大连宝生生物有限公司 ), 低熔点胶粉 AgaroseB AgaroseⅢ 和十二烷基肌氨酸钠 ( 上海生工生物有限公司 ) 1.3 耐药表型分析方法根据 VITEK 2Compact 高级专家系统提供的数据进行分析判断, 将 20 株 MDR PA 分为 4 种耐药表型模式 : 结合抗生素敏感性结果划分为不同的耐药模式, 用小写的英文字母 a,b,c,d 表示, 其中 a 型为泛耐药 ( 对所有抗生素全耐药 );b 型为仅对喹诺酮类抗生素敏感, 其余抗生素耐药 ;c 型为仅对三代头孢类抗生素敏感, 其余抗生素耐药 ;d 型为对喹诺酮类和三代头孢类抗生素敏感, 其余抗生素耐药 1.4 PFGE 分析将 MDR PA 菌株分别接种于血平板,37 培养 18~24h 挑取新鲜菌落溶于细胞悬浮缓冲液中, 悬浮菌体, 制成 4 个麦氏浊度的菌悬液, 制备菌栅胶, 再通过裂解洗胶块酶切制作电泳胶上样电泳获取图像应用 BioNumerics 软件对图像进行分析 [9], 选择 UPGMA(un weightedpairgroupmethodusingarithmetic averages) 方法, 条带位置差异容许度为 2%, 优化值

3 %, 电泳条带完全一致判断为同一基因型株菌 ; 相似度 >80% 为同一亚型, 代表同一克隆株 ;<80% 者为不同的亚型, 代表不同的克隆株, 用大写的英文字母 A~F 表示不同的基因型 1.5 MALDI TOFMS 分析将 MDR PA 菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板, 放置于 35 5% CO 2 培养箱中培养 24h 用灭菌的取菌环挑取适量细菌放入 1.5mLEP 管, 加入 300μL 纯水混匀, 再加入 900μL 无水乙醇震荡混匀, 静置 15min 后离心 (13000r/min,2min), 弃上清后重复离心, 以彻底弃去上清再向 EP 管内加入 50μL70% 浓度的甲酸, 震荡混匀后再加入 50μL 乙腈, 再震荡混匀, 静置 1min 后高速离心 (13000r/min)2min, 吸出上清蛋白提取液备用, 做好标记及编号取 1μL 处理好的上清液点加在 MALDI TOFMS 的样品靶上, 在室温条件下自然晾干 (5~10min), 其上滴加 1μLCHCA 基质溶液均匀覆盖其表面, 待自然晾干后上机检测每一个样品的蛋白质谱峰通过不同位置 100 次的激光点击而获得, 仪器可检测的蛋白质质量范围为 2000~ 20000Da, 得到的蛋白质谱峰信息经软件校正, 然后与仪器内的微生物数据库图谱进行比对, 从而得到鉴定结果通过 VITEKMSSARAMIS 软件查看分析鉴定结果, 并导入图谱数据库进行聚类分析, 相似度 <70% 者为不同的质谱型别 [10], 用 Ⅰ ~Ⅲ 表示不同的型别 2 结果 2.1 耐药表型分析 20 株 MDR PA 中对所有抗菌药物全耐药为 a 型, 有 7 株 ; 对所有抗菌药物仅喹诺酮类抗生素敏感的为 b 型, 有 8 株 ; 对所有抗菌药物仅对三代头孢类抗生素敏感的为 c 型, 有 2 株 ; 对所有抗菌药物仅对喹诺酮类和三代头孢类抗生素敏感的为 d 型, 有 2 株分离的克隆株最早是 2017 年 1 月 7 日分离出的 901 号, 最晚是 2017 年 11 月 5 日分离出的 919 号, 其耐药模式不全相同见表 PFGE 同源性分析结果由图 1 可见, 菌株具有相同的 PFGE 带型为同一基因型菌株, 菌株具有相同的 PFGE 带型为同一基因型株菌 ; 菌株相似度 83.7%, 为同一亚型, 代表同一克隆株, 描述为 A 型 ; 菌株相似度 84.1%, 描述为 B 型 ; 菌株相似度 89.5%, 描述为 C 型 ; 菌株相似度 80.9%, 描述为 D 型 ; 菌株相似度 85.2%, 描述为 E 型 ; 菌株 902 与其他亚型相似度 <80% 为不同的亚型, 代表不同的克隆株, 描述为 F 型见表 MALDI TOFMS 同源性分析结果通过 VITEK MSSARAMIS 分析软件对 20 株 MDR PA 的蛋白指纹图谱进行聚类分析, 并构建发育树从聚类分析图 ( 图 2) 可发现 : 通过不同菌株质谱间相似度 >70% 为同一质谱型别进行划分,20 株 MDR PA 大致分为三大簇 (Ⅰ 型 13 株,Ⅱ 型 6 株,Ⅲ 型 1 株 ), 其中菌株为 Ⅰ 型, 菌株为 Ⅱ 型, 菌株 911 为 Ⅲ 型 2.4 PFGE 和 MALDI TOFMS 结果一致性比较 MALDI TOFMS 同源性分析结果与 PFGE 同源性分析结果比较显示,20 株 MDR PA 通过 MALDI TOF MS 聚类分析将其分为三大簇 (Ⅰ 型 13 株,Ⅱ 型 6 株, Ⅲ 型 1 株 ), 而依据 PFGE 分型结果则将其分为 6 种亚型 (A 型 2 株,B 型 3 株,C 型 4 株,D 型 3 株,E 型 7 株, F 型 1 株 ), 其中有 C 型和 E 型中具有相同基因型菌株间, 其 MALDI TOFMS 亲缘性关系也较近, 而其余 4 种亚型菌株间亲缘性比较, 发现 PFGE 分型结果与 MALDI TOFMS 聚类分析结果不完全相符, 见表 1 表 1 20 株 MDR PA 菌株分型基本信息结果汇总菌株编号分离日期抗性表现型 PFGE 型 MALDI 型 b A Ⅲ b A Ⅰ b B Ⅰ d B Ⅰ b B Ⅰ b C Ⅰ b C Ⅰ b C Ⅰ a C Ⅰ c D Ⅰ c D Ⅰ a D Ⅰ d F Ⅰ a E Ⅰ b E Ⅱ a E Ⅱ a E Ⅱ a E Ⅱ a E Ⅱ b E Ⅱ

现比较公认的同源性分析方法为 PFGE 同源性分析该方法准确性和可靠性被广泛认同, 但是由于其对临床工作的指导意义受限, 不是实验室所具备的常规设备和技术且存在操作繁琐, 耗时较长等不足, 难以在临床实验室推广运用 [11] MALDI TOFMS 作为目前临床微生物实验室中的一项新技术, 除鉴定细菌外, 还可以利用 SARAMIS 等分析软件对细菌蛋白指纹图谱进行聚类分析,

4 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(14) 1261 图 1 MDR PA 同源性聚类图 (PFGE) 图 2 MDR PA 同源性聚类图 (MALDI TOFMS) 3 讨论 PA 是临床上最常见的条件致病菌之一, 以呼吸系统感染为主, 已成为医院感染的主要病原菌之一, 而我院 ICU 病房出现 MDR PA 医院感染流行趋势为确定病原菌与疾病的发生, 传播和流行之间的关系, 现比较公认的同源性分析方法为 PFGE 同源性分析该方法准确性和可靠性被广泛认同, 但是由于其对临床工作的指导意义受限, 不是实验室所具备的常规设备和技术且存在操作繁琐, 耗时较长等不足, 难以在临床实验室推广运用 [11] MALDI TOFMS 作为目前临床微生物实验室中的一项新技术, 除鉴定细菌外, 还可以利用 SARAMIS 等分析软件对细菌蛋白指纹图谱进行聚类分析, 及时为医院感染控制和流行病学调查研究提供实验室证据本研究以 PFGE 作为细菌同源性分析的金标准, 通过 PFGE 分型得出为同一株菌, 耐药表型一致, 为同一菌株, 耐药表型一致, 提示这两株菌出现 ICU 病房克隆传播 ; 按照亚型相似度 <80% 进行区分 [9],PFGE 将 20 株 MDR PA 分为 A F 6 个亚型按照亚型相似度 <70% 进行区分 [10],MALDI TOFMS 将 20 株 MDR PA 分为 Ⅰ~Ⅲ 3 个亚型 MALDI TOFMS 同源性分析结果显示, 相似度较高, 菌株相似度较高, 与 PFGE 同源性分析结果完全一致, 而其余 4 种亚型菌株间亲缘性比较, 发现 PFGE 分型结果与 MALDI TOFMS 聚类分析结果不完全相符分析其主要原因可能为 PFGE 是根据细菌的染色体进行分型, 稳定性和准确性较好 [12] ; 而 MALDI TOFMS 主要通过细菌蛋白指纹图谱相似性进行聚类分析, 细菌蛋白表达过程中其丰度会受到培养时间培养基等多因素的影响, 从而使得 MALDI TOFMS 同源性分析结果具有不稳定性, 因此 MALDI TOFMS 同源性分析具有一定局限性, 质谱特征峰采集受人机料法环等多因素影响, 需要严格掌握实验条件, 在标准条件下完成实验, 且多次综合分析有助于结果的可靠性和准确性此外, 目前没有制定统一的质谱标准化操作流程, 实验结果的重复性和可靠性还未得到多中心不同实验室的验证, 尚难以准确定论 MALDI TOF MS 同源性分析能力基于临床发生暴发性聚集性感染的后果严重, 迅速诊断病原菌判明病原菌的亲缘关系对于明确感染暴发流行的本质和制定合理的感染控制措施至关重要因此, 我们需要建立一种新的快速病原菌同源性分析的新方法, 而 VITEKMS 能利用 SARAMIS 软件对细菌蛋白图谱进行鉴定和聚类分析, 可在几分钟内完成对可疑细菌的鉴定及同源性分析该技术在溯源分析方面具有快速通量高方便节约成本和时间等优点, 在临床实验室中比其他分子生物学方法更实用, 能够及时明确引发院内感染病原菌的性质, 为医院感染控制研究提供一个更加快捷简便的方法

5 1262 参考文献 : [1] 袁莉莉, 丁百兴, 沈震, 等. 耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性及分子流行病学研究 [J]. 中国感染与化疗杂志,2017,17(3): YUANLL,DINGBX,SHENZ,etal.Antibioticresistance andmolecularepidemiologyofcarbapenem resistantpseudo monasaeruginosa[j].chinjinfecchemoth,2017,17(3): [2] 黄小荣, 梁天文, 刘配辰, 等. 多重耐药铜绿假单胞菌同源性分析及 Ⅰ 型整合子研究 [J]. 中国抗生素杂志, 2014,39(10): HUANGXR,LIANGTW,LIUPC,etal.Homologicala nalysisofmulti drugresistantpseudomonasaeruginosaand detectionofclasⅠ integrons[j].chinjantibio,2014,39 (10): [3] WATERSV,ZLOSNIKJE,YAUYC,etal.Comparisonof threetypingmethodsforpseudomonasaeruginosaisolatesfrom patientswithcysticfibrosis[j].eurjclinmicrobiolinfect Dis,2012,31(12): DOI: /s z. [4]SUZUKIM,YAMADAK,AOKIM,etal.ApplyingaPCR basedopen readingframetypingmethodforeasygenotyping andmolecularepidemiologicalanalysisofpseudomonasaerug inosa[j].japplmicrobiol,2016,120(2): DOI: /jam [5]BADERO.MALDI TOF MS basedspeciesidentificationand typingapproachesin medicalmycology[j]. Proteomics, 2013,13(5): DOI: /pmic [6]MENCACCIA,MONARIC,LELIC,etal.Typingofnoso comialoutbreaksofacinetobacterbaumannibyuseofmatrix asistedlaserdesorptionionization timeofflightmasspec trometry[j].jclinmicrobiol,2013,51(2): DOI: /JCM [7] 李东菊, 朱元祺, 梁冰.MALDI TOFMS 用于肺炎克雷伯菌同源性分析的初步研究 [J]. 中国微生态学杂志, 2016,28(5): LIDJ,ZHUYQ,LIANGB.MALDI TOFhomologyanaly sisofklebsielapneumoniaebymaldi TOFMS[J].ChinJ Microecol,2016,28(5): [8] 王亚南, 高晶晶, 钟桥, 等.MALDI TOFMS 技术在鲍曼不动杆菌鉴定及同源性分析中的应用 [J]. 临床检验杂志,2015,33(6): WANGYN,GAOJJ,ZHONGQ,etal.MALDI TOFiden tificationandhomologyanalysisofacinetobacterbaumanniby useofmatrix asistedlaserdesorption/ionizationtime of flight masspectrometry[j].chinjclinlabsci,2015,33(6): [9]THONGKL,LAIKS,GANESWRIER,etal.Pulsed field gelelectrophoresisofmultidrug resistantand sensitivestrains ofpseudomonasaeruginosafromamalaysianhospital[j].jpn JInfectDis,2004,57(5): [10]VERROKENA,BAURAINGC,DEPLANOA,etal.Epi demiologicalinvestigationofanosocomialoutbreakofmulti drug resistantcorynebacterium striatum atonebelgianuni versityhospital[j].clinmicrobiolinfect,2014,20(1): DOI: / [11] 闻海丰, 冯忠军, 秦瑾, 等. 采用 ERIC PCR 与 PFGE 分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异 [J]. 分子诊断与治疗杂志,2016,8(1): WENH F,FENGZJ,QINJ,etal.Comparisonbetween PFGEandERIC PCRforgenotypingandhomologousanaly sisofacinetobacterbaumanni[j].jmoldiagnther, 2016,8(1): [12] 杨富国, 闫志勇, 毕春霞. 青岛地区医院内感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型研究 [J]. 中华流行病学杂志,2008,29(12): YANGFG,YANZY,BICX.Moleculartypingofmethie ilin resistantstaphylococcusaureusisolatedfrom hospital izedpatientsinqingdao[j].chinjepidemiol,2008,29 (12): ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑邓强庭 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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