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1 有机化学 DOI: /cjoc Chinese Journal of Organic Chemistry 基于酶触发的点击化学反应测定 β- 葡萄糖苷酶活性王龙文马济美 * 程鑫李子龙孙林皓曾贞江洪 * ( 华中农业大学理学院武汉 ) 摘要建立了一种新的 β- 葡萄糖苷酶活性定量检测的方法, 其原理是通过 β- 葡萄糖苷酶对 2-O-β-D- 葡萄糖基 -L- 抗坏血酸的特异性水解, 释放出抗坏血酸来还原 Cu(II), 原位生成的 Cu(I) 催化荧光较弱的香豆素和苄基叠氮进行环加成点击反应, 产生高荧光强度的三氮唑, 从而利用荧光光谱检测体系荧光强度的变化, 反映出 β- 葡萄糖苷酶的活性. 实验结果显示, 在 1~40 U/L 范围内, 荧光强度增强程度与 β- 葡萄糖苷酶活性呈线性关系, 可实现定量检测, 其最低检测限为 U/L. 关键词 β- 葡萄糖苷酶活性 ; 测定 ; 2-O-β-D- 葡萄糖基 -L- 抗坏血酸 ; 点击化学 Determination of β-glucosidase Activity Based on Enzyme-Triggered Click Chemistry Wang, Longwen Ma, Jimei* Cheng, Xin Li, Zilong Sun, Linhao Zeng, Zhen Jiang, Hong* ( Department of Chemistry, College of Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan ) Abstract A novel method to quantify β-glucosidase activity was developed by coupling the cleavage of 2-O-(β-glucopyranosyl)ascorbic acid with the reduction of Cu (II). The in situ generated Cu(I) catalyzed the cycloaddition between weakly fluorescent coumarin and benzyl azide to yield a highly fluorescent triazole product. The fluorescence intensity was dependently enhanced on the increase of the activity of β-glucosidase and a linear relationship was found between 1~40 U/L. This cascade allows detection of β-glucosidase with a limit of detection of U/L. Keywords β-glucosidase activity; determination; 2-O-(β-glucopyranosyl)ascorbic acid; click chemistry β- 葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的 β-d- 葡萄糖苷键, 它可以将糖类及葡萄糖衍生物水解得到 β-d- 葡萄糖和相应的配基 [1,2]. β- 葡萄糖苷酶在生命体系中普遍存在, 在维持生物体正常的生理功能方面起着重要的作用, 比如养分吸收生物降解植物和微生物的相互作用等 [3]. 因此, β- 葡萄糖苷酶的研究已经渗透到各个领域, 在医学食品科学土壤学以及化学工程等领域展示了广泛的应用前景. 例如, β- 葡萄糖苷酶活性指标就是人类遗传学疾病戈谢病诊断的重要依据 [4]. β- 葡萄糖苷酶在许多食物中是一种重要的风味酶, 如水果蔬菜及饮料等 [5,6]. 此外, β- 葡萄糖苷酶也被作为土壤质量的检测指标之一 [7,8], 同时在农业废弃物降解过程中起着至关重要的作用 [9]. 目前, β- 葡萄糖苷酶的测定方法主要有分光光度比色法和荧光光谱法. 例如, 以对硝基苯 -β-d- 葡萄糖苷 (pnpg) [10 ~ 12] 或者 4- 甲基伞型酮 -β-d- 葡萄糖苷 (4-MUG) [13~15] 为底物进行酶解测定. 这两种方法操作相对简便, pnpg 比色法具有灵敏性高重现性好的特点, 然而, 一些物质与水解产物对硝基苯酚具有相同吸收波长, 容易产生干扰. 同样, 4-MUG 荧光法水解产物的蓝色荧光容易与生物样品的背景重叠, 而且 ph 值对其荧光强度影响较大, 这就导致了 4-MUG 荧光法在生理 ph 值条件下使用率较低 [16]. 因此, 研究者们不断致力于开发更通用和有效的检测 β- 葡萄糖苷酶活性的方 * Corresponding author. majimei@mail.hzau.edu.cn; jianghong0066@126.com Received March 9, 2018; revised April 21, 2018; published online June 1, Project supported by the National Natural Science Foundation of China (No ). 国家自然科学基金 (No ) 资助项目. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 2775~ Chinese Chemical Society & SIOC, CAS

2 有机化学法 [1,7,16,17]. Cu(I) 催化炔基和叠氮的环加成反应是一类典型的点击化学反应 (Eq. 1), 常用于有机合成和生物研究中 [18~21]. 炔和叠氮发生环加成反应非常缓慢, 但有微量亚铜离子存在时, 可加速反应迅速产生具有共轭结构的 1,2,3- 三氮唑官能团, 此类反应不仅条件温和, 普适性广, 高效可靠, 其三唑类产物更具有多重特殊性质, 使其在各个学科中得到广泛应用 [18], 特别是 1,2,3- 三氮唑类产物的比色特性为很多体系提供了更便利的检测方法. [21] 最近 Xianyu 等报道的有关碱性磷酸酶活性的检测方法, 就是利用炔和叠氮功能化的纳米金颗粒之间的点击化学反应来实现的. 受其启发, 我们设计了一种通过酶触发点击化学反应来检测 β- 葡萄糖苷酶的方法, 其反应机制如图 1 所示. 2-O-β-D- 葡萄糖基 -L- 抗坏血酸 (AA-2βG) 作为酶的反应底物, 首先 AA-2βG 被 β- 葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖和游离态的抗坏血酸, 抗坏血酸将催化量硫酸铜还原成为一价的亚铜离子, 随后亚铜离子催化 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素和苄基叠氮进行环加成点击化学反应, 生成高荧光强度 1,2,3- 三唑化合物 b. 虽然香豆素本身具有荧光, 但是相比于吸电子效应的乙炔基, 给电子效应的三唑环使得化合物 b 比 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素具有更高的荧光强度 [22~25]. 而且, 催化反应本身也放大了信号, 因此, 体系荧光强度的增强, 直接反映了 β- 葡萄糖苷酶的活性. 1 结果与讨论底物 2-O-β-D- 葡萄糖基 -L- 抗坏血酸 (AA-2βG) 是从枸杞中分离得到的一种天然产物, 可通过本课题组已报道的方法, 利用 5,6- 异丙叉基抗坏血酸和 1- 溴 -2,3,4,6- 四乙酰基葡萄糖合成得到 [26]. 在进行酶活性的定量检测之前, 我们对 β- 葡萄糖苷酶水解动力学进行了初步研究. 通过 HPLC 检测抗坏血酸量对酶催化水解 AA-2βG 的最佳条件进行探索, 如缓冲液 ph 值反应温度底物浓度溶剂反应时间等. 配置不同 ph 值 (3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0) 的柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液, 将 500 U/L 的 β- 葡萄糖苷酶和 300 mmol L -1 的 AA-2βG 在 37 下进行水解 1 h. 结果表明, ph=5.0 时 β- 葡萄糖苷酶的酶活性最高. 随后, 在缓冲液 ph=5.0 的条件下, 对酶解温度 (20, 30, 40, 45, 50, 55, 60 ) 进行筛选, 发现 AA-2βG 在 45 下水解产率较高, 较高或者较低的温度都会降低酶的活性. 如在 ph=5.0, 500 U/L 的 β- 葡萄糖苷酶和 300 mmol L -1 的 AA-2βG 的反应体系中, 加入 20 μl 有机溶剂 ( 如甲醇叔丁醇 THF DMSO 等 ) 会降低酶活性. 当 AA-2βG 浓度在 300 mmol L -1 以下, 随着底物浓度的增加, 酶的水解效率在不断提高, 继续提高 AA-2βG 的浓度, 水解程度增加缓慢. 30 min 以内, AA-2βG 水解速度较快, 之后增幅较小. 因此, 我们建立了 β- 葡萄糖苷酶水解 AA-2βG 的最佳条件为缓冲液 ph=5.0, 反应温度 45, 底物浓度 300 mmol L -1, 反应时间 30 min. 同时我们也探索了不同的金属盐对 β- 葡萄糖苷酶活性的影响, 发现 MgSO 4 对酶活性略有促进作用, MnSO 4 CaCl 2 KCl 和 ZnCl 2 对酶活性具有轻微的抑制图 1 Cu(I) 催化点击化学反应检测 β- 葡萄糖苷酶原理 Figure 1 Mechanism for the detection of β-glucosidase involved copper-catalyzed click reaction Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 2775~2779

3 Chinese Journal of Organic Chemistry 作用, CuSO 4 表现出显著的抑制作用 [27]. 而 CuSO 4 也是后续活性检测中点击反应的催化剂前体, 不仅起催化前体作用, 同时也能起到终止酶水解的作用. 随后, 我们对利用点击化学反应原理检测 β- 葡萄糖苷酶活性的方案进行了探索. 向不同活性的 β- 葡萄糖苷酶 ( U/L) 加入底物 AA-2βG, 水解后取出一定体积, 加入到 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素苄基叠氮配体 L 和五水硫酸铜混合液中, 2 h 后于发射波长 329 nm 发射波长 384 nm 下检测体系的荧光强度, 结果如图 2 所示. 此检测波长比常规的 pnpg 和 4-MUG 法短, 可避免部分体系在 400 nm 以上范围内受干扰问题. 其中空白组是不加 β- 葡萄糖苷酶体系的荧光强度, 由于体系中含有 4- 甲基 -7- 羟基香豆素, 本身具有荧光属性, 因此空白组在 384 nm 下具有一定的荧光强度. 正如设计所想, 随着 β- 葡萄糖苷酶活性从 1 U/L 增加到 40 U/L, 体系荧光强度逐渐增强, 且增强幅度明显, 表明这种荧光增强趋势确实跟酶活性强度有关. 根据实验结果和 IUPAC 定义, 计算得出该方法的最低检测限为 U/L. Fluorescence intensity/a.u Wavelength/nm 40 U/L 30 U/L 25 U/L 10 U/L 5 U/L 1 U/L 0 U/L 图 2 不同酶活性条件下的荧光信号强度 ( 激发波长 329 nm, 发射波长 384 nm) Figure 2 Fluorescence emission spectra in presence of different concentrations of β-glucosidase in citric acid-dibasic sodium phosphate buffer solution (excitation and emission wavelengths are 329 and 384 nm, respectively) 同时, 我们以 β- 葡萄糖苷酶的浓度 (U/L) 为横坐标, 反应后溶液的相对荧光强度 F-F 0 为纵坐标进行线性回归模拟 ( 图 3), 其中 F 表示酶水解 AA-2βG 催化点击化学反应后溶液的荧光强度, F 0 表示不加酶条件下反应后溶液的荧光强度, 计算得出回归方程为 Y=2.9421X , 相对系数 R 2 =0.9958, 说明 β- 葡萄糖苷酶活性在 1~40 U/L 范围内, 体系的相对荧光强度与酶活性呈线性关系. F-F 0 /a.u Y = X R 2 = D-Glucosidase activity/(u L -1 ) 图 3 不同酶活性与相对荧光强度的线性关系 Figure 3 Relative fluorescence intensity difference F-F 0 with different β-glucosidase activity (U/L). 2 结论基于点击化学反应原理, 建立了一种 β- 葡萄糖苷酶活性检测的新方法, 利用酶水解 AA-2βG, 将 Cu(II) 还原成 Cu(I), 原位催化 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素和苄基叠氮进行环加成点击化学反应, 产生 1,2,3- 三氮唑化合物, 大大增强了体系的荧光强度, 通过测定相对荧光强度定量反映酶的活性, 提高了检测灵敏度, 同时此方法结合酶的专一性, 有助于提高选择性. 在此基础上, 可根据实际检测体系, 变换炔基和叠氮化合物结构, 改变检测波长, 从而避免可能存在的生色团干扰, 这对于复杂体系 β- 葡萄糖苷酶活性的检测提供了新思路. 3 实验部分 3.1 仪器与试剂带有氙灯的 Shimadzu RF-5301PC 荧光分光光度计 ; Agilent 1100 高效液相色谱 ; 600 MHz Brucker 核磁共振仪. 超纯水是通过 Millipore Milli-Q Academic 仪器纯化得到. 所有试剂均为分析级, 直接使用, 溶剂在使用前都经过标准方法的干燥和纯化. β- 葡萄糖苷酶 (10 U) 购买自上海宝曼生物公司 ( 中国 ), 缓冲溶液 (ph=5.0) 是用柠檬酸和磷酸氢二钠配置的, 2-O-β-D- 葡萄糖基 -L- 抗坏血酸 (AA-2βG) 由本课题组合成得到. 3.2 化合物 a 的合成甲基 -7 羟基香豆素的合成将 40 ml 浓硫酸加入到 150 ml 烧瓶中, 冰水浴中冷却, 缓慢滴加 1.3 ml (10.3 mmol) 乙酰乙酸乙酯和 1.1 g (10 mmol) 间苯二酚, 2 h 内滴加完毕, 将反应移至室温下搅拌 12 h, 反应进程薄层色谱 (TLC) 检测跟踪. 反应. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 2775~ Chinese Chemical Society & SIOC, CAS

4 有机化学停止, 将反应液倒入 500 ml 冰水混合物中, 析出沉淀, 抽滤. 收集滤饼溶入 50 ml 5% 的 NaOH 溶液, 抽滤, 再向滤液中加入 10% 的 H 2 SO 4 溶液, 调节 ph 至 3, 析出沉淀. 抽滤收集滤饼, 用乙醇重结晶得到 4- 甲基 -7 羟基香豆素 (1.05 g, 60%). 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (s, 1H), 7.60 (d, J=8.5 Hz, 1H), 6.91~6.76 (m, 1H), 6.71 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 2.37 (s, 3H). 氢谱数据与文献报道基本一致 [28] 甲基 -7- 三氟甲磺酰基香豆素的合成将 200 mg (0.56 mmol) N- 苯基双 ( 三氟甲烷磺酰亚胺 ) 91 mg (0.52 mmol) 4- 甲基 -7- 羟基香豆素和 0.12 ml (0.69 mmol) 二异丙基乙胺加入到 4 ml 的乙腈中, 于室温下反应 2 h. 反应结束后, 加入乙酸乙酯稀释, 用饱和食盐水溶液洗涤数次, 有机相用无水硫酸镁干燥, 旋干, 柱层析 [V( 乙酸乙酯 ) V( 石油醚 )=1 6] 分离得到白色固体 4- 甲基 -7- 三氟甲磺酰基香豆素 (125 mg, 80%). 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.70 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.25 (dd, J=8.7, 2.5 Hz, 1H), 6.36 (d, J=1.2 Hz, 1H), 2.47 (d, J=1.2 Hz, 3H). 氢谱数据与文献报道基本一致 [29] 甲基 -7- 三甲基硅基乙炔基香豆素将 4- 甲基 -7- 三氟甲磺酰基香豆素 (0.24 g, 0.77 mmol) 溶于 10 ml 乙腈中, 随之加入四 ( 三苯基膦 ) 钯 (0.09 g, mmol), CuI (0.03 g, 0.16 mmol), 三甲基硅基乙炔 (0.54 ml, 3.82 mmol), 二异丙基乙胺 (0.5 ml, 2.87 mmol), 氩气保护, 于室温下搅拌反应 36 h. 停止反应, 加入乙酸乙酯稀释, 用氯化铵溶液洗涤数次, 有机相用无水硫酸镁干燥, 旋干, 柱层析 [V( 乙酸乙酯 ) V( 石油醚 )=1 6] 分离得到淡黄色固体 4- 甲基 -7- 三甲基硅基乙炔基香豆素 (0.15 g, 76%). 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.52 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.36 (dd, J=8.2, 1.5 Hz, 1H), 6.29 (d, J=1.2 Hz, 1H), 2.43 (d, J=1.2 Hz, 3H), 0.29~0.26 (m, 9H). 氢谱数据与文献报道基本一致 [29] 甲基 -7- 乙炔基香豆素的合成将 165 mg (0.65 mmol) 4- 甲基 -7- 三甲基硅基乙炔基香豆素溶于 25 ml 甲醇中, 加入四正丁基氟化铵 (2 ml, 1.0 mol L -1 THF, 2.0 mmol), 于 60 下反应 15 min. 停止反应, 加入冰水, 滤集沉淀, 柱层析 [V( 乙酸乙酯 ) V( 石油醚 )=1 6] 分离得到白色固体 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素 (83 mg, 70%). 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.55 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.43 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.39 (dd, J=8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.31 (d, J=1.0 Hz, 1H), 3.26 (s, 1H), 2.44 (d, J=1.1 Hz, 3H). 氢谱数据与文献报道基本一致 [29] 配体 L-2,2',2''-(4,4',4''-N- 三甲基 ) 三 (1H-1,2,3- 三氮唑 -4,1- 基 ) 三乙酸乙酯的合成将 100 mg (0.76 mmol) 三炔丙基胺 294 mg (2.28 mmol) 叠氮乙酸乙酯 10 mg (0.027 mmol) 四三乙氰六氟磷酸亚铜 0.4 ml (2.29 mmol) 二异丙基乙胺加入到 3 ml 的乙腈中, 室温反应 2 d. 结束反应, 旋蒸除去溶剂, 加入二氯甲烷, 用饱和食盐水洗涤数次, 有机相用无水硫酸镁干燥, 旋干, 柱层析分离得到淡黄色固体 380 mg; 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 7.93 (s, 3H), 5.17 (s, 6H), 4.26 (q, J=7.1 Hz, 6H), 3.83 (d, J=30.6 Hz, 6H), 1.30 (t, J=7.1 Hz, 9H). 氢谱数据与文献报道基本一致 [25]. 3.3 酶活性测定用 ph=5.0 的柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲溶液 (10 mmol/l) 配制不同活性的 β- 葡萄糖苷酶 ( U/L). 在 160 μl 不同浓度的 β- 葡萄糖苷酶溶液中加入 40 μl 300 mmol/l 的 AA-2βG, 于 45 下振荡反应, 30 min 后取 160 μl 反应液加入到 40 μl 20 mmol/l 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素 40 μl 125 mmol/l 苄基叠氮 40 μl 5 mmol/l 配体 L 和 40 μl 10 mmol/l 五水硫酸铜混合液中, 于室温下反应, 2 h 后结束反应, 于激发波长 329 nm 发射波长 384 nm 下检测荧光强度. 其中五水硫酸铜用 ph=5 10 mmol/l 的柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液配置, 而 4- 甲基 -7- 乙炔基香豆素苄基叠氮配体 L 用 DMSO 溶解, 提高缓冲液中有机化合物的溶解度, 从而更好的促进点击化学反应的进行. 辅助材料 (Supporting Information) 炔基化合物 a 及其中间体的核磁共振氢谱谱图, 酶水解动力学实验条件探索. 这些材料可以免费从本刊网站 ( cn/) 下载. References [1] Zhang, L.; Fu, Q.; Li, W.; Wang, B.; Yin, X.; Liu, S.; Xu, Z.; Niu, Q. Sci. Rep. 2017, 7, [2] Periyannan, G. R.; Lawrence, B. A.; Egan, A. E. J. Chem. Educ. 2015, 92, [3] Hsu, C.-C.; Wu, T.-M.; Hsu, Y.-T.; Wu, C.-W.; Hong, C.-Y.; Su, N.-W. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 921. [4] Zhang, W.; Oehrle, M.; Prada, C. E.; Schwartz, I. V. D.; Chutipongtanate, S.; Wattanasirichaigoon, D.; Inskeep, V.; Dai, M.; Pan, D.; Sun, Y.; Setchell, K. D. R. Analyst 2017, 142, [5] Lee, K. H.; Kim, S. H.; Woo, K. S.; Kim, H. J.; Choi, H. S.; Kim, Y. H.; Song, J. Food Sci. Biotech. 2016, 25, [6] Hati, S.; Vij, S.; Singh, B. P.; Mandal, S. J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 216. [7] Stege, P. W.; Messina, G. A.; Bianchi, G.; Olsina, R. A. J. Fluoresc. 2010, 20, 517. [8] Stege, P. W.; Messina, G. A.; Bianchi, G.; Olsina, R. A.; Raba, J. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, [9] de Almeida, J. M.; de Lima, V. A.; de Lima, P. C. G.; Knob, A. Bio Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 2775~2779

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