014 年第 9 期于盱等 : 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 85 一步研究其功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 方法植物材料所用材料为薄荷属植物薄荷品种 78, 种植于江苏省中科院植物研究所 1.1. 菌株与质粒大肠杆菌菌株 DH5α 和 pum-t 质粒均

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块信顾
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 014年第9期薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建于盱梁呈元刘艳李维林江苏省中国科学院植物研究所南京 14 摘要利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶 GPPS 基因特异引物扩增得到 GPPS 基因开放式阅读框 1 11 并将其插入到原核表达载体 pet-8a 中经酶切测序验证的重组质粒 pet-8a-gpps 转入 Rosetta DE 利用 IPTG 诱导表达融合蛋白结果显示终浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 进行诱导后 6 h SDS-PAGE 显示薄荷 GPPS 基因在 Rosetta DE 中获得高效表达目前利用 RNA 干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟以 GPPS 大亚基基因为靶目标成功构建了薄荷 GPPS 大亚基基因的 pbi11-rnai-gpps 干扰载体关键词薄荷 GPPS 原核表达 RNAi 载体构建 Prokaryotic Expreesion and RNA Interference Vector Construction for Geranyl Diphosphate Synthase of Mentha haplocalyx Briq. Yu Xu Liang Chengyuan Liu Yan Li Weilin Institute of Botany Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences Nanjing 14 Abstract: Geranyl diphosphate synthase GPPS gene total ORF 1 11 was amplified with specific primers and linked to expression vector pet-8a. Verified by double restriction enzyme digestion and sequencing, recombined vector pet-8a-gpps was transferred to Rosetta DE and the recombined protein was overexpressed after 6 h induced by 1 mmol/l IPTG. Using RNA interference method to research gene function is matured gradually. In our research, the expression vector pbi11-rnai-gpps targeting to GPPS gene was structured successfully. Key words: Mentha haplocalyx Briq. GPPS Prokaryotic expreesion 单萜类化合物是重要的植物天然化学成分其主要功能与植物授粉种子散播和生物防御过程有唇形科植物薄荷 Mentha haplocalyx Briq. 1 关是常用中药材其干燥地上部分入药性辛凉归肺肝经薄荷挥发油具有利胆镇痛抗炎 RNAi Vector construction 属植物椒样薄荷中克隆得到该蛋白的 cdna 序列 GPPS 蛋白是由大小两个亚基组成的异源二聚体其中大亚基与催化活性直接相关而小亚基功能尚不明确 10 RNA 干扰是小双链 RNA 通过降解 mrna 而抑透疹 4-7 等多种药理作用挥发油中的主要成分为制体内基因表达技术这一利用转录后的基因沉默单萜类其中薄荷醇含量一般占 75% 以上薄荷醇机制能够高效特异的用于鉴定基因功能 11 1 本研合成途径属质体发生的 -C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷究在克隆得到我国主流薄荷品种 78 GPPS 大亚 8 酸途径 MEP 牻牛儿基焦磷酸合酶 Geranyl 基基因的基础上构建 GPPS 基因大亚基的原核表达 diphosphate synthase GPPS 是催化单萜类成分 C10 载体并进行该亚基蛋白的高效表达另外本试验骨架形成的关键酶之一 Burke 等 9 首次从薄荷构建 GPPS 大亚基基因的 RNA 干扰载体以期为进收稿日期基金项目江苏省自然科学基金项目 BK 江苏省农业科技自主创新资金项目 CX 作者简介于盱女博士研究生研究方向药用植物资源和育种 yuxu84@16.com 通讯作者梁呈元副研究员研究方向药用植物资源和育种 liangcy618@aliyun.com 李维林研究员研究方向药用植物资源和天然产物化学 lwlcnbg@cnbg.net

2 014 年第 9 期于盱等 : 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 85 一步研究其功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 方法植物材料所用材料为薄荷属植物薄荷品种 78, 种植于江苏省中科院植物研究所 1.1. 菌株与质粒大肠杆菌菌株 DH5α 和 pum-t 质粒均购自北京百泰克生物技术公司, 原核表达载体 pet-8a, 大肠杆菌菌株 Rosetta(DE),pBI11 质粒由本实验室保存 1. 方法 1..1 GPPS 基因原核表达载体构建 GPPS 大亚基基因克隆及 pum-t-gpps 载体构建根据 GPPS 大亚基基因的 cdna 序列, 设计并合成下列引物 MhGPPS-F :5 '-ATGGCATATGAG- TGCTCTTGTTAATC-'( 下划线部分为 Nde I 酶切位点 );MhGPPS-R :5'-CGAAGGATCCCGATTGTCCCT ATAAGCA-'( 下划线为 BamH I 酶切位点 ) 将目的片段纯化后的 GPPS 大亚基基因全长产物与 pum-t 载体连接参照 pum-t 载体操作说明, 16 反应 0 min,4 反应 45 s, 转化 DH5α 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆, 双酶切进行鉴定 pet-8a-gpps 载体构建及鉴定抽提 pet- 8a 载体质粒和 pum-t-gpps 质粒, 分别进行 Nde I 和 BamH I 双酶切后回收目的片段,T4 DNA 连接酶 16 连接过夜, 转化 DH5α 感受态细胞, 氨苄抗性筛选阳性克隆抽提重组质粒 pet-8a-gpps,nde I 和 BamH I 双酶切鉴定, 并送测序 IPTG 诱导 GPPS 基因表达及 SDS-PAGE 检测重组蛋白分别将空 pet-8a 载体和重组质粒 pet- 8a-GPPS 转化至感受态表达宿主菌株 (Rosetta), 按 1% 接种新鲜菌液 pet-8a-gpps(rosetta) 到含有氨苄青霉素的 LB 培养基中, 并以 pet-8a(rosetta) 空载体为对照组当菌体生长至吸光值约为 0.6 时加入终浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 进行诱导表达, 继续培养 6 h 和 15 h 后, 分别取 1 ml 菌液,1 000 r/min 离心 5 min, 弃上清, 加上样缓冲液溶解菌体沉淀, 以 1% SDS-PAGE 电泳进行蛋白质分析, 观察目标蛋白的表达情况 1.. GPPS 基因 RNA 干扰载体构建目的基因的 PCR 扩增根据 GPPS 大亚基基因的 cdna 序列, 设计并合成下列引物下划线部分分别表示括号中相应的酶切位点 :GppsR1 :5'- ATAGAGCTCGTCGGCGGCGACGAGTC -'(Sac I ); GppsR :5'-CGGTACGTAATATCGTCCACCACCT GA-'(SnaB I);GppsR :5'-CGGTCTAGAATGCGG TACTCCCTTCTCG-'(Xba I);GppsR4 :5'-ATACCC GGGATATCGTCCACCACCTGA-'(Sma I) 分别利用上述对引物 (GppsR1 和 GppsR, GppsR 和 GppsR4), 采用 PCR 技术, 扩增 GPPS 基因编码区 515 和 575 的片段其中两端添加 Sac I 和 SnaB I 酶切位点的扩增产物为反向片段, 添加 Xba I 和 Sma I 酶切位点的扩增产物为正向片段 PCR 产物在经 TA 克隆并测序后, 经过酶切及连接, 先后亚克隆至 pbi11 载体的 GUS 基因片段两端, 并利用 GUS 基因部分片段作为 RNAi 表达载体的内含子 (Intron) 序列转化子经筛选酶切鉴定并测序后, 获得能在植物体内产生 GPPS 相应序列发夹结构 (hairpin RNA,hpRNA) 的植物 RNAi 表达载体 pbi11-rnai-gpps 1... 重组载体向农杆菌感受态细胞的转化 Ca- Cl 法制备农杆菌感受态 : 根癌农杆菌 LBA4404 接种于适量的 YEB( 含利福平 50 mg/l) 液体培养基中, 于 8 00 r/min 振荡培养至 OD 600 =0.5 左右, r/min 离心 5 min 收集菌体, 加入 0 mmol/l 的 CaCl 溶液悬浮细胞, 冰浴 0 min 4,5 000 r/min 离心 5 min 并收集菌体, 再次加入 0 mmol/l 的 CaCl 溶液悬浮细胞, 将细胞分装于 1.5 ml 的离心管中, 同时贮藏于 -70 冰箱备用质粒的农杆菌感受态细胞转化采用冻融法 : 加 5 ng DNA 于 50 μl 感受态细胞中, 冰浴 min, 液氮速冻 min, 液氮中取出细胞后, 直接放置于 7 水浴 5 min 加入 1 ml YEB 液体培养基, 于 8,00 r/min 培养 4 h 菌体 r/min 离心后弃去上清, 重新加入 μl YEB 液体培养基悬浮细胞, 涂布于含有相应抗生素的 YEB 固体培养基 ( 含 1.5% 琼脂 ) 上, 于 8 倒置培养 6-48 h, 至长出菌斑阳性转化子的筛选采用菌落 PCR 和提取质粒酶切鉴定的方法进行

3 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 86 Vec 结果.1 014年第9期 Time h 1 Rec 4 pum-t-gpps质粒载体构建 PCR 产物连接到 pum-t 上经 Nde I 和 BamH kd I 双酶切可得到 1 左右目的基因片段说明 45.0 pum-t-gpps 质粒载体构建成功图 1-A 图 1-B. M 5.00 pet-8a-gpps载体构建及鉴定 5.0 重组质粒 pum-t-gpps 和 pet-8a 分别经限制性内切酶 Nde I 和 BamH I 双酶切得到 GPPS 全长 1 1 mmol/l IPTG 分别经 6 h 15 h 诱导 pet-8a + 空载体菌 Vec 和酶切后的 pet-8a 用 T4 DNA 连接酶连接两个片表达结果 4 1 mmol/l IPTG 分别经 6 h 15 h 诱导 pet-8a-gpps 重组段得到重组质粒 pet-8a-gpps 将重组质粒转化至载体菌 Rec 表达结果 M 蛋白分子量标准图表达宿主菌 Rosetta DE 挑取阳性克隆提取质粒薄荷 GPPS 大亚基原核表达蛋白 SDS-PAGE 图进行双酶切得到全长 GPPS 基因图 1-C 表明的两条片段图 -A 和图 -B PCR 产物经 TA 目的片段已经连接到载体 pet-8a 上原核表达载克隆并双酶切图 -C 验证 PCR 扩增片段正确体构建成功分别纯化回收 Sac I/SnaB I 双酶切的 GPPS PCR 反 M1 M1 1 A M 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞挑取转化子将 PCR 验证的阳性克隆子进行 Sac I/SnaB I 双酶切及 BamH I/SnaB I 验证结果图 -D 图 -E 显示双酶切后分别得到 515 和 9 的产物片段表明 GPPS 反向片段连接成功随后将连接了 GPPS 反向片段的 pbi11 载体经 Xba I/Sma I 双 B C A GPPS 大亚基 PCR 产物 M1 DL DNA 分子量标准 1 PCR 扩增产物 B pum-t-gpps 载体双酶切验证 GPPS 大亚基原核表达 TA 阳性克隆子 Nde I/BamH I 双酶切产物 C pet-8a-gpps 载体双酶切验证 M λ-hind III DNA 分子量标准 GPPS 大亚基原核表达载体阳性克隆子 Nde I 单酶切产物 4 GPPS 大亚基原核表达载体阳性克隆子 Nde I/BamH I 双酶切产物图 1 薄荷 GPPS 大亚基原核表达载体构建及验证. 向片段及 pbi11 载体经 T4 连接酶重新连接后 GPPS基因的原核表达切后回收与经同样双酶切的 GPPS 正向片段进行连接转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞并挑取克隆子后将 PCR 验证的阳性克隆子进行 Sac I/Xba I 双酶切验证结果图 -F 表明酶切后得到大小为大小的产物片段最终成功构建了薄荷 GPPS 大亚基基因的 RNAi 干扰载体讨论近年来人们对萜类挥发油生物合成途径进行将含有重组质粒 pet-8a-gpps 的表达菌株了大量的研究对薄荷醇的生物合成途径也有了深 Rosstta DE 经 1 mmol/l IPTG 诱导表达 6 h 和入的了解 1 14 牻牛儿基焦磷酸合酶 GPPS 为 15 h 后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳 pet-8a 空载体短链异戊烯基合酶家族成员催化一分子的 IPP 与 Vec 为对照结果图显示在 IPTG 诱导表 DMAPP 形成 GPP 为单萜提供碳骨架 15 本研达 6 h 和 15 h 后样品在约 7 kd 附近出现新生的究以我国主流薄荷品种 78 叶片为材料提取蛋白条带与 GPPS 大亚基蛋白的分子量相符总 RNA 并以其反转录 cdna 为模板克隆得到编码.4 薄荷GPPS大亚基基因RNAi表达载体的构建 GPPS 大亚基蛋白的全长 cdna 将该序列首先插入设计分别加上 Sac I SnaB I 和 Xba I Sma I 酶克隆载体 pum-t 中提高了产物连接效率而且该切位点的引物 GppsR1 GppsR 及 GppsR GppsR4 质粒上的多克隆酶切位点方便以后将 GPPS 大亚以薄荷 cdna 为模板扩增出大小为 515 和 575 基基因克隆至表达载体中本研究采用的原核表达

4 014 年第 9 期于盱等 : 薄荷 GPPS 基因原核表达及 RNA 干扰载体构建 87 M 1 A M M 5 M 6 7 M 8 9 B D E F M :DL DNA 分子量标准 ;1 :GPPS 基因正向片段 PCR 扩增产物 ; : GPPS 基因反向片段 PCR 扩增产物 ;:pmd-19t-gpps-rnai 载体经 Xba I/Sma I 双酶切产物 ;4 :pmd-19t-gpps-rnai 载体经 SnaB I/Sac I 双酶切产物 ;5 : RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai-r 经 SnaB I/Sac I 双酶切产物 ;6 :RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai-r 经 BamH I 单酶切产物 ;7 :RNAi 载体 pbi11-gpps- RNAi-R 经 BamH I/Sac I 双酶切产物 ;8,9 :RNAi 载体 pbi11-gpps-rnai 经 Xba I/Sma I 双酶切产物图薄荷 GPPS 大亚基 RNAi 载体的构建及酶切验证载体 pet-8a 质粒, 该质粒使用 T7 启动子, 编码区 C 端添加了 His-Tag 序列, 使表达的目的蛋白带上 His-Tag 便于通过该 Ni + 亲和层析纯化目的蛋白目前基因研究重心已经从结构基因组研究转向功能基因组学研究因此人们迫切需要一种高效特异的判断基因功能的生物试验技术 RNAi 是指一些小的双链 RNA, 它可以通过降解 mrna 高效地使特定的基因沉默, 得到丧失功能的突变体, 该技术是现代分子生物学中研究基因功能的全新方法之一 [16], 在基因表达调控作物品种改良方面都有应用 [17] 因此,RNAi 载体构建成为在植物中运用 RNAi 技术必不可少的关键工具本试验在构建 GPPS 大亚基基因的 RNAi 载体时, 对 GPPS 基因大亚基保守区域进行分析, 通过 RNAi 设计软件预测相应的 RNAi 干扰位点, 从 TA 克隆载体上扩增 GPPS 基因编码区 515 和 575 的片段, 以正反方向连接到中间克隆载体, 其发夹臂长, 能 M 4 C 够保证形成完整的发夹结构 GPPS 基因的克隆, 原核表达研究以及 RNAi 载体构建, 一方面为进一步阐述 GPPS 基因在薄荷挥发油生物合成途径中的重要功能提供条件和依据, 另一方面也为利用分子育种手段提高薄荷中挥发油的含量奠定基础 4 结论本研究以香料作物薄荷为试验材料克隆获得其单萜合成途径中的关键酶 GPPS 基因序列, 成功构建 GPPS 大亚基基因原核表达载体, 经诱导后获得蛋白表达成功构建获得了 GPPS 大亚基基因 RNAi 干扰载体参考文献 [1]Dudareva N, Negre F, Nagegowda DA, Orlova I. Plant volatiles : recent advances and future perspectives[j]. Crit Rev Plant Sci, 006(5): []Serna L, Marin C. Trichomes :different regulatory networks lead to convergent structures[j]. Trends Plant Sci, 006, 11 : [] 中华人民共和国卫生部国家药典委员会. 中华人民共和国药典 :(010 年版一部 )[M]. 北京 : 化学工业出版社人民卫生出版社, 010. [4] 彭蕴茹, 钱士辉, 石磊, 等. 薄荷非挥发性提取部位的药理活性研究 [J]. 中药材, 008, 1(1): [5] 王晖, 许卫铭, 王宗锐. 薄荷醇对柴胡镇痛成分表观生物利用度的影响 [J]. 中成药, 1996, 18(6):4-6. [6]Lee MY, Lee JA, Seo CS, et al. Protective effect of Mentha haplocalyx ethanol extract(mh)in a mouse model of allergic asthma[j]. Phytotherapy Research, 011, 5 : [7]Chan BC, Hong KL, Leung PC, et al. Traditional Chinese medicine for a topic eczema :PentaHerbs formula suppresses inflammatory mediators release from mast cells[j]. Journal of Ethnopharmacology, 008, 10 : [8]Croteau R. Biosynthesis and catabolism of monoterpenoids[j]. Chem Rev, 1987, 87 : [9]Burke C, Wildung MR, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase : cloning expression and characterization of this prenyltransferase as a heterodimer[j].proc Natl Acad Sci USA, 1999(96):

5 88 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 014 年第 9 期 [10]Burke C, Klettke K, Croteau R. Heteromeric geranyl diphosphate synthase from mint :construction of a functional fusion protein and inhibition by bisphosphonate substrate analogs[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 004, 4 :5-60. [11]Gong D, Zhang C, Chen X, et al. Constitutive activation and transgenic evaluation of the function of an Arabidopsis PKS protein kinase[j]. J Biol Chem, 00, 77(44): [1]Xu M, Zhu L, Shou H, et al. A PIN1 family gene, OsPIN1, involved in auxin-dependent adventitious root emergence and tillering in rice[j]. Plant & Cell Physiology, 005, 4(610): [1]Mahmoud SS, Croteau RB. Menthofuran regulates essential oil biosynthesis in peppermint by controlling a downstream monoterpene reductase[j]. PNAS, 00, (4): [14]Rodney BC, Edward MD, Kerry L, et al. Menthol biosynthesis and molecular genetic[j]. Naturwissenschaften, 005, 9 : [15]Burke C, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase from Abies grandis :cdna isolation, functional expression, and characterization[j]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 00, 405 : [16]Bass BL. Double-stranded RNA as a template for gene silencing [J]. Cell,, 101 :5-8. [17] 王永佳, 陈永胜, 李国瑞. RNAi 在植物中的作用机理及其应用研究进展 [J]. 内蒙古民族大学学报 : 自然科学版, 010, 5(1): ( 责任编辑马鑫 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽