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翁政霍
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1 使用 Poroshell 1 EC-C18 色谱柱快速分析头孢吡肟及其相关杂质应用报告医药作者 William J. Long Agilent Technologies, Inc. 8 Centerville Road Wilgton, DE 1988 USA 前言头孢菌素是一类最常见的处方类抗生素其结构和药理活性与青霉素相似与青霉素一样, 头孢菌素也具有 β- 内酰胺环状结构, 通过干扰细菌细胞壁的合成杀死细菌 1948 年, 意大利科学家 Giuseppe Brotzu 首次从顶头孢霉菌的培养物中分离出头孢菌素化合物 1964 年, 礼来公司首次推出了头孢噻吩商品头孢菌素类杀菌剂与其它 β- 内酰胺类抗生素 ( 如青霉素 ) 具有相同的抗菌方式所有细菌都有细胞壁保护头孢菌素破坏细菌细胞壁肽聚糖层的合成, 从而导致细胞壁分解, 最终使细菌死亡头孢菌素类抗生素属于 β- 内酰胺类化合物, 其 β- 内酰胺环由一个六元双氢噻嗪环组成, 形成头孢烯母核结构通过对其环状结构的侧链进行修饰, 可以改善其抗菌活性和药代动力学行为根据抗菌谱, 头孢菌素类药物可大致分为四代第一代头孢菌素主要对革兰氏阳性菌有效, 后续几代增加了对革兰氏阴性菌的抗菌作用 ( 常常伴随抗革兰氏阳性菌作用减弱 ) 革兰氏阴性菌有一个独特的外膜, 能够阻止许多药物进入因此, 与革兰氏阳性菌相比, 革兰氏阴性菌有更强的抗药性 [1]

2 O OH 本实验选用两种安捷伦色谱柱 : H S O OCH 3 O H H S H 3 C + Cl - HCl H O Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,4.6 mm, µm, 部件号 Agilent Poroshell 1 EC-C18,4.6 7 mm,.7 µm, 部件号图 1. 头孢吡肟的结构头孢吡肟属第四代头孢菌素, 是一种广谱抗菌药, 比其它市售头孢类药物具有更强的抗革兰氏阴性菌作用结构如图 1 所示尽管对此类药物已有广泛研究, 但其定量分析及纯度检测仍存在问题 [] 欧洲药典和美国药典已公布了头孢吡肟及相关物质的测定方法 [3,4] 这些方法使用磷酸 / 乙腈作为流动相在流速 1. ml/ 的条件下, 使用 4.6 mm, µm 色谱柱本实验使用 Agilent Poroshell 1 EC-C18,4.6 7 mm, µm 色谱柱, 快速分析头孢吡肟相关物质, 同时满足欧洲药典和美国药典方法的要求由于色谱柱更短, 从而减少了流动相的频繁配制, 因此与原欧洲药典和美国药典方法相比节省了试剂并减少了废液的产生此外, 更短的色谱柱能够更快地评估方法调整的效果, 从而在较短的时间内获得更佳的分析性能实验部分安捷伦 1 系列快速分离高分辩液相色谱系统, 配备如下安捷伦组件 : G131B SL 型二元泵, 梯度程序设置取决于色谱柱规格和流速, 见表 1 G1367C SL 型自动液体进样器 (ALS), 进样量取决于具体的方法参数, 见表 1 G1316B SL 型柱温箱 (TCC), 温度设置为 C G1367C 二极管阵列检测器, 检测波长设置为 4 nm 此外, 对两根来自竞争对手的 4.6 mm, µm C18 色谱柱的使用也进行了测试, 命名为 C1 和 C 乙腈具有 Burdick and Jackson ACS/HPLC 认证, 购自 Honeywell 公司 ACS/USP 级磷酸二氢钾购自 VWR 公司所用水用 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备,18 MΩ,. µm 滤膜过滤.4 µm 可再生纤维素膜 ( 安捷伦科技 ) 过滤缓冲液盐酸头孢吡肟和盐酸头孢吡肟系统适用性试验对照品均购自美国药典样品及流动相依据美国药典和欧洲药典说明配制流动相的配制本方法的梯度洗脱液采用一定比例的磷酸二氢钾缓冲液与乙腈将.68 g 磷酸二氢钾溶于 ml 水中配成缓冲液用 KOH 或磷酸调缓冲液 ph 值为., 过.4 µm 滤膜 ( 再生纤维素膜 ), 超声脱气按原美国药典方法, 流动相 A 的缓冲溶液与乙腈比例为 9:1 所有样品均用此流动相配制方法调整过程中, 配制不同比例的流动相 A 流动相 B 由磷酸二氢钾缓冲液和乙腈配制成 1:1 的溶液欧洲药典 (EP) 方法与上述方法类似, 但它规定了调缓冲液 ph 值的 KOH 和磷酸溶液的浓度 (. M), 并专门规定了在加入乙腈之前调 ph 值待测样品的制备精密称取盐酸头孢吡肟约 7 mg, 转移至 ml 容量瓶中, 用流动相 A 溶解并稀释至刻度超声约 3 使溶解用流动相 A 溶解样品, 浓度为 7 mg/ ml 由于杂质 B 难溶, 因此必须使用超声溶解注 : 这些配好的溶液应立刻使用, 或存放至冰箱中并在 1 小时内使用

3 结果与讨论美国药典和欧洲药典使用的色谱条件如下两种药典都规定使用 L1(C18 色谱柱 ) 4.6 mm, µm 色谱柱表为梯度洗脱程序液相色谱先等度运行 % A, 随后在内 A 逐渐变化至 %, 保持这一浓度运行, 然后重新平衡至初始的 % A 总运行时间 36 原美国药典和欧洲药典方法规定使用 4.6 mm, µm L1 色谱柱图中列出了 3 种不同的色谱柱该方法运行样品梯度及系统再平衡的总时间约为 4 我们通过调整, 改进了方法, 提高了分析速度美国药典方法中列出的色谱分析方法及性能参数要求如下 : L1 色谱柱 (C18),4.6 mm mm 分析物的理论塔板数不小于 4 头孢吡肟和头孢吡肟相关物质 A 的分离度 R 不小于头孢吡肟和头孢吡肟有关物质 B 的分离度 R 不小于头孢吡肟的容量因子 k' 大于.6 柱效不小于 4 理论塔板数拖尾因子不大于 1. 为便于鉴别, 头孢吡肟的相对保留时间为 1., 头孢吡肟相关物质 A 的相对保留时间为.7, 头孢吡肟相关物质 B 的相对保留时间约为 4.3 最新的美国药典第 61 章, 对于方法的哪些方面可以更改以进行方法调整提出了建议 [] 表 1 总结了这些调整先前工作已证明调整色谱柱填料粒径大小和柱规格是可行的 [6,7] 此外, 这些药典方法的新变化表明, 允许线速度保持恒定而减小填料粒径, 从而流速的增加超出了当前流速 ± % 的调整范围要求 [8] 在这种情况下, 我们也会看到在更小规格的色谱柱上改变流动相组成的优势表 1. 美国药典第 61 章允许的方法调整柱长 ± 7% 柱内径 ± % 柱填料粒径最多可减小 %, 无增加流速 ± % 进样量满足系统适应性试验 (SST) 条件下的变化柱温 ± % 流动相 ph ±. UV 波长严格按照厂商性能指标, 不允许更改缓冲液中的盐浓度 ± % 流动相组成 ( 低比例组分允许调整 ± 3%, 或任何低比例组分允许调整 ± % 绝对量, 详见美国药典 ) USP/EP C1 Eclipse Plus C18 C 4 1. E. 3. F 4. A. B ml/ µl % B 图. 原方法在三种不同色谱柱上运行, 每次分析约需 4 3

4 按照下列公式按比例调整梯度洗脱程序保持常量 k* 不变时, 上述公式可简化为下列公式, 计算新的梯度程序时间 : t g = (t g1 d L F 1 )/(d 1 L 1 F ) t g1 和 t g : 原梯度和新梯度时间 d 1 和 d : 原柱内径和新柱内径 L 1 和 L : 原柱长和新柱长 F 1 和 F : 原流速和新流速本文中, 实验条件可在允许范围内进行若干变动首先填料粒径从 µm 变为.7 µm 此变化提高了柱效, 同时也增加了柱压但由于色谱柱缩短了 7%, 柱压的增加可以忽略 Agilent Poroshell 1 色谱柱的优点之一是粒径分布窄, 因此可使用与 µm 和 3. µm 色谱柱上相同的 µm 筛板这意味着与原方法相比, 样品的制备无须额外步骤粒径为 3,. 及小于 µm 的常规色谱柱须使用更小孔径的筛板以保护柱填料, 但这容易引起堵塞 [9] 第二个变动是柱长由 mm 减至 7 mm 若柱效不变, 柱长可以减少 7%, 并且可轻易实现更高通量的样品分析表梯度脱洗程序表 4.6 mm mm mm mm µm,.7 µm,.7 µm,.7 µm, 进样体积 1 ml/, 1 ml/, 1. ml/, ml/, % 溶剂 B µl 6 µl 6 µl 6 µl 流动相中的低比例组分是乙腈, 占 % 根据美国药典调整规则对于小比例组成的溶剂, 可允许调整 ± 3% 或 ± % 绝对量的调整, 即乙腈可降至 7% 或升至 13% 欧洲药典调整规则与此相同, 也为 7%-13% 使用这种短的多的色谱柱, 可快速计算出本实验中乙腈在流动相中的几种不同浓度但请注意, 本方法中虽然色谱溶剂是不同的, 但是样品制备过程无变化还需注意本实验中杂质 B 比其它组分难溶, 若没有按此方法规定充分超声溶解, 此化合物是不溶的 1 图全多孔 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱和 Agilent Poroshell 1 EC-C18 色谱柱 ml/ mm Agilent Poroshell 1 EC-C18 1. ml/ 1. ml/ 1. ml/ mm Agilent Poroshell 1 EC-C mm Agilent Poroshell 1 EC-C mm Agilent Eclipse Plus C18 µm 4

5 如图 4 所示, 流速增至 ml/, 可实现更快速的方法评估如图所示, 调整乙腈起始浓度由 11% 到 8% 不等, 符合药典规定调整范围乙腈浓度为 % 时, 头孢吡肟与杂质 B 的分离度为而当乙腈起始浓度降到 8% 时, 二者的分离度增至 4.9 可以推测, 如果乙腈起始浓度降至 7% 以下时, 分离度还会进一步增加但若起始浓度的调整超过了规定范围, 则需要重新进行方法验证 =11% Rs= =11% Rs=4.7 =11% =11% 图 4. 调整有机相浓度以提高分离度使用 Agilent Poroshell 1 EC-C18 色谱柱进行快速分析方法开发 1. E. 3. F 1 4. A 1 ml/ 1 3. B 4 1 Bar ml/ 1 Bar ml/ 3 Bar 图. 美国药典头孢吡肟杂质分析的最终优化方法, 使用安捷伦 Poroshell 1 EC-C18,4.6 7 mm 色谱柱, 起始乙腈浓度为 8%, 不同流速下进行分析

6 表 3 要求 :Agilent Poroshell 1 EC-C mm,.7 µm 1 ml/ 1. ml/ ml/ 16 bar 1 bar 3 bar Tf< > k > Rs C/a Rs C/b 超过这个范围的调整被认为是方法改变, 需重新进行分析方法验证若分析人员使用更短的色谱柱, 如 4.6 mm mm, 相同的分析可在原方法 % 的时间内完成, 并只消耗 % 的溶剂当然, 此方法需重新进行完整的方法学验证有些分析方法可容易判断是否需要重新验证方法的可行性, 但是杂质分析方法则不经常验证表和表 3 数据表明, 无须新设备, 分析时间可轻易地从 36 减至 7., 即分析时间减少了 8% 这可以使实验室在收到原料的 h 内完成分析, 而不是原来的 4 h 结论在不改变现有仪器的情况下, 使用表面多孔 Poroshell 1 色谱柱, 能够提高分析速度分离度和灵敏度, 使用 mm 全多孔液相色谱柱进行药典分析的实验室将从中获益美国药典和欧洲药典的指导原则允许使用 7 mm 色谱柱使用 Poroshell 1 色谱柱可获得更快的分析速度, 从而实现高通量和更高的分析效率使用较短的粒径较小的.7 µm 色谱柱, 方法调整后可改进实验结果. USP Method Validation Guidance. "United States Pharmacopeia 3 Supplement : System Suitability Testing, Rockville, MD. 7, Chapter <61>. 6. William Long, Anne Mack and Yun Zou, 使用安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C18 µm 3. µm 和 1.8 µm 色谱柱改进辛伐他汀的分析, chcn. 7. William J. Long, Faster analysis of aproxen Tablets, Improvements on the USP Method, Agilent Technologies, LC GC Magazine, June. 8. Uwe D. eue, Doug McCabe, Vijaya Ramesh, Horacio Pappa, Jim DeMuthc, Transfer of HPLC Procedures to Suitable Columns of Reduced Dimensions and Particle Sizes, Pharmacopeial Forum, Vol. 3(6) [ov. Dec. 9]. 9. Dorothy J. Phillips, Mark Capparella, Uwe D. eue, Zoubair El Fallah, A new small particle packing for faster analysis with high resolution, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 1 (1997) 更多信息如需了解更多有关我们产品和服务的信息, 请访问我们的网站参考文献 1. D. Yahav, M. Paul, A. Fraser,. Sarid, L. Leibovici, Efficacy and Safety of Cefepime: A Systematic Review and Meta-Analysis. Lancet Infect Dis. 7, 7, S. R. El-Shaboury, G. A. Saleh, F. A Mohamed, A. H. Rageh, Analysis of Cephalosporin Antibiotics. J. Pharm. Biomed. Anal. 7, 4, USP Cefepime Impurity Method, "Unitesd States Pharmacopeia 31 F 6" Rockville, MD Cefepime Impurity Method The European Pharmacopeia, seventh ed., Council of Europe, 安捷伦公司对本材料所包含的错误, 或由于提供展示或使用本材料所造成的直接或间接损失概不负责本出版物所含信息说明和性能指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,11 11 年 3 月 18 日中国印刷 CHC

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5990-7492CHTW_5989_5672.qxd 使用 Poroshell 1 EC-C18 管柱快速分析 Cefepime 及相關雜質應用備註製藥作者 William J. Long Agilent Technologies, Inc. 8 Centerville Road Wilmington, DE 1988 USA 緒論頭孢菌素 (Cephalosporin) 為最常使用的抗生素