包裹提供实验基础 1 仪器与试剂 Agilent 1200 型高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 );Nano-ZS 型粒径分析仪 ( 英国 Malvern 公司 ); HT7700 透射电子显微镜 ( 日本 Hitachi 公司 ); TGL-16B 高速台式离心机 ( 上海安亭科学仪

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1 盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒的制备及大鼠体内药动学研究戴东波 1 徐金中 1 尤文挺 1 胡利明 1 陈才铭 1* 尚小广 2(1.温岭市第一人民医院药剂科浙江温岭杭州医学院药学系杭州 ) 摘要目的优化盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒(DOX-PLA-NPs)的制备工艺并对其理化性质体外释放及大鼠体内药动学进行研究方法采用改良的复乳-溶剂挥发法制备 DOX-PLA-NPs 正交设计优化其处方工艺对其纳米粒形态粒径 Zeta 电位包封率与载药量进行测定以 DOX 原药为对照组考察 DOX-PLA-NPs 的体外释药特性及大鼠尾静脉给药后的体内药动学参数结果 DOX-PLA-NPs 外观圆整平均粒径为(125.67±3.80)nm Zeta 电位为( 35.97±1.58)mV 包封率和载药量分别为(81.23±1.46)% (10.29±0.63)% 体外释放结果显示 DOX 经纳米粒包裹后具明显的缓释作用 DOX 原药和纳米粒的体内药动学过程均符合开放式二室模型 t1/2β 分别为 (1.15±0.175)h (6.43±2.12)h CL 分别为 (174.76±47.22) h L 1 (30.68±11.86)h L 1 AUC0 t 分别为(6.01±1.61)μg h L 1 (36.04±13.72)μg h L 1 结论制备的盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒粒径较小包封率较高具明显的缓释作用并能提高药物的生物利用度关键词盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒体外释放药动学中图分类号 R944 文献标志码 B 文章编号 (2017) DOI: /j.cnki.issn 引用本文戴东波, 徐金中, 尤文挺, 等. 盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒的制备及大鼠体内药动学研究[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(8): Preparation of Doxorubicin-loaded PLA Nanoparticles and Study Their Pharmacokinetics in Rats DAI Dongbo1, XU Jinzhong1, YOU Wenting1, HU Liming1, CHEN Caiming1*, SHANG Xiaoguang2 (1.Department of Pharmacy, The First People s Hospital of Wenling, Wenling , China; 2.Department of Pharmaceutical Science, Hangzhou Medical College, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To optimize the preparation of doxorubicin-loaded PLA nanoparticles (DOX-PLA-NPs), and evaluate their physicochemical properties, release behavior in vitro and study their pharmacokinetics in rats. METHODS The DOX-PLA-NPs were prepared by modified double emulsification(w/o/w) solvent evaporation method. Orthogonal test was used to optimize the preparation procedure. The morphology, size distribution, Zeta potential, encapsulation efficiency, and drug loading of DOX-PLA-NPs were characterized. The drug release behavior in vitro and pharmacokinetics behavior in vivo was investigated in comparison with DOX-sol. RESULTS The optimized nanoparticles were spherical in shape with the mean particle size of (125.67±3.80)nm and the Zeta potential of ( 35.97±1.58)mV. The encapsulation efficiency and drug loading were (81.23±1.46)%, (10.29±0.63)%, respectively. In vitro drug release results showed DOX-PLA-NPs had a sustained release character. In in vivo study, the pharmacokinetic behavior of DOX-sol and DOX-PLA-NPs were best fitted to two-compartment model and the parameters were as follows: t1/2β (1.15±0.175)h, (6.43±2.12)h, CL(174.76±47.22) h L 1, (30.68±11.86)h L 1, AUC0 t(6.01±1.61)μg h L 1, (36.04±13.72)μg h L 1. CONCLUSION The optimized DOX-PLA-NPs is practicable with small particle size, high encapsulation efficiency, a certain sustained release characteristic and can significantly improve the bioavailability after vein injection. KEY WORDS: doxorubicin; PLA nanoparticles; in vitro release; pharmacokinetics 盐酸阿霉素(doxorubicin DOX)是目前临床应系统以纳米粒为核外层自组装包裹脂质体用最为广泛和最有效的抗肿瘤药物之一但其稳稳定性高易靶向修饰可分别包裹抗肿瘤药物定性差血浆半衰期极短给药后伴有骨髓抑制与抗多药耐药药物以期发挥协同抗肿瘤作用[2-3] 心脏及消化系统毒性等严重不良反应而且反复本实验通过优化盐酸阿霉素聚乳酸纳米粒的制备给药后可引起肿瘤多药耐药这些都限制了 DOX 工艺对纳米粒的理化性质体外释放及大鼠体 [1] 在临床上的应用脂质囊纳米粒是一种新型递药内药动学进行系统研究为进一步实现脂质体的基金项目温岭市科技计划项目(2016C311090) 作者简介戴东波男硕士药师 Tel: (0576) (0576) @qq.com 中国现代应用药学 2017 年 8 月第 34 卷第 8 期 ddongbo001@163.com * 通信作者陈才铭男副主任药师 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 August, Vol.34 No.8 Tel 1127

2 包裹提供实验基础 1 仪器与试剂 Agilent 1200 型高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 );Nano-ZS 型粒径分析仪 ( 英国 Malvern 公司 ); HT7700 透射电子显微镜 ( 日本 Hitachi 公司 ); TGL-16B 高速台式离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ); OptimaMAX 超速离心机 ( 美国 Beckman 公司 ); Scientz-Ⅱ DN 型超声波细胞粉碎机 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 ); 透析袋 ( 美国 Viskase 公司, 截留相对分子量 Da);2XZ-2 型真空干燥箱 ( 临海市谭氏真空设备有限公司 ) DOX 原料药 ( 浙江海正制药有限公司, 批号 : , 纯度 >98%);DOX 对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 : , 供含量测定用 ); 柔红霉素 (DNR, 大连美仑生物技术有限公司, 批号 : , 纯度 >97%); 聚乳酸 (PLA, 山东岱罡生物科技有限公司, 批号 : ,Mw= ); 聚乙烯醇 (PVA, 美国 Sigma 公司, 批号 : 10918AE,Mw=13 000~ Da); 磷酸 ( 美国 TEDIA 公司, 色谱纯 ); 甲醇乙腈 ( 美国 Honeywell Burdick&Jackson 公司, 色谱纯 ); 其他试剂均为分析纯清洁级 SD 大鼠, 各半, 体质量为 (300±10)g, 购于浙江中医药大学实验动物中心, 合格证号 :SCXK 浙所有动物实验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行 2 方法与结果 2.1 纳米粒的制备精密称取一定量 DOX, 以超纯水溶解成 10 mg ml 1 的内水相储备液 ; 精密称取一定量的 PLA, 溶于 1 ml 有机溶剂 ( 二氯甲烷 / 乙酸乙酯 ) 中, 构成有机相 ; 将内水相加入到有机相中, 冰浴中一定功率超声乳化分散一定时间, 形成初乳 ; 另取一定量的 PVA 水溶液, 用磷酸缓冲盐调节 ph 至 8.5, 构成外水相 ; 将初乳与外水相混合, 冰浴中一定功率超声乳化分散一定时间, 形成复乳 ; 将所得复乳缓慢滴加至高速磁力搅拌下的连续相中, 滴毕, 继续搅拌 10 min,40 减压蒸去有机溶剂和部分水, 得到带桔红色乳光的纳米粒混悬液将其离心 15 min(4 000 r min 1, 常温 ), 除去沉淀物, 再超速离心 60 min( r min 1,4 ), 取沉淀物用蒸馏水洗涤 3 次, 得 DOX-PLA-NPs 2.2 体外 DOX 分析方法的建立 [4] 色谱条件色谱柱 :ZORBAX Eclipse XDB C 18 柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm); 流动相 : 乙腈 mol L 1 磷酸二氢钠 ( 磷酸调 ph 至 3.0)(30 70); 流速 :1.0 ml min 1 ; 柱温 :25 ; 检测波长 :233 nm; 进样量 :20 µl 溶液的制备分别精密称取 DOX 对照品 10.0 mg 置于 10 ml 棕色量瓶中, 甲醇溶解, 并稀释至刻度, 制成 1 mg ml 1 的 DOX 对照品贮备液精密量取制备的 DOX-PLA-NPs 混悬液 1 ml 于 10 ml 棕色量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 超声, 0.22 μm 微孔滤膜过滤, 续滤液即为供试品溶液线性关系及方法学考察分别精密量取 DOX 对照品贮备液适量, 加甲醇稀释成浓度分别为 50.0,20.0,10.0,5.0,2.0,1.0,0.5 μg ml 1 的系列对照品溶液, 按项下色谱条件进样测定, 以峰面积 (A) 对浓度 (C) 进行线性回归, 得 DOX 标准曲线方程 A=85.375C (n=7), r= 表明 DOX 在 0.5~50.0 μg ml 1 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系低中高浓度 (0.5,5.0,50.0 μg ml )DOX 对照品溶液日内日间精密度 RSD 均 <2%(n=5) 低中高浓度样品的平均回收率分别为 (96.7± 1.15)% (96.7±1.02)% (97.7±0.71)%(n=3) 取同一批次制备的 DOX-PLA-NPs 混悬液 6 份, 平行配制供试品溶液进行测定, 计算 DOX 浓度的 RSD 为 1.26%, 表明该方法重复性良好取同一批次制备的 DOX-PLA-NPs 供试品溶液于室温下放置 0, 2,4,8,12,24 h, 计算 DOX 浓度的 RSD 为 1.49%, 表明该供试品溶液在 24 h 内稳定性良好 2.3 包封率和载药量测定精密量取 DOX-PLA-NPs 混悬液置于具塞离心管中, 离心 15 min(4 000 r min 1, 常温 ), 取上清液 1 ml, 置 10 ml 棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 经 0.22 μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液按项下色谱条件测定, 计算 DOX 的含量, 记作 W 1 ; 另取适量上清液离心 60 min( r min 1,4 ), 取二次离心上清液 1 ml, 置 10 ml 棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 经 0.22 μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液按项下色谱条件测定, 计算 DOX 的含量, 记作 W 2 ; 取 2 次离心后沉淀物, 蒸馏水洗涤 3 次, 真空冷冻干燥后精密称定总重量, 记作 W t 另精密量取 DOX-PLA-NPs 混悬液 1 ml, 1128 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 August, Vol.34 No.8 中国现代应用药学 2017 年 8 月第 34 卷第 8 期

置 10 ml 棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 超声, 经 0.22 μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液按 2.2.1 项下色谱条件进样测定, 计算纳米粒混悬液中总的药物含量, 记作 W 0 按下式计算纳米粒的包封率 (encapsulation efficiency, EE) 和载药量 (drug loading,dl): EE%=(W 1 W 2 )/W 0 100%; DL%=(W 1 W 2 )/W t 100% 2.

3 置 10 ml 棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 超声, 经 0.22 μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液按项下色谱条件进样测定, 计算纳米粒混悬液中总的药物含量, 记作 W 0 按下式计算纳米粒的包封率 (encapsulation efficiency, EE) 和载药量 (drug loading,dl): EE%=(W 1 W 2 )/W 0 100%; DL%=(W 1 W 2 )/W t 100% 2.4 正交试验设计根据单因素试验结果, 选取制备过程中对粒径包封率与载药量 3 个评价指标影响较大的 4 个因素 :DOX 用量外水相 PVA 浓度有机相二氯甲烷与乙酸乙酯体积比 (DCM EA) 复乳超声时间 (T), 每个因素选择 3 个水平, 按照 L 9 (3 4 ) 正交表设计实验进行处方工艺的优化, 因素水平见表 1 为将所有指标综合为一个能反映总体效应结果的值, 实验中引入总评归一值 (overall desirability,od) 来考察指标的综合效果, 根据 Hassan 的方法对各个指标进行均一化处理其计算公式如下 : d i =(Y i Y min )/(Y max Y min ) 其中,Y i 为实测值,Y min 和 Y max 系指每一指标在不同次试验中测得的所有值中的最小和最大的值计算出各指标的 d i 值后, 由下式计算 OD 值 : OD=(d 1 d 2 d n )1/n 表 2 极差分析结果表明, 各因素对粒径包封率和载药量三者总评归一值的影响程度依次为 C>B>A>D; 由表 3 方差分析可知, 相对于 D 因素, 因素 A B C 即 DOX 用量外水相 PVA 浓度 DCM 与 EA 的体积比对纳米粒的粒径和包封率具有显著影响 (P<0.05) 综合极差分析和方差分析确定优化的处方为 A 2 B 2 C 2 D 3, 即 DOX 用量为 300 μl,pva 浓度为 2.5%,DCM 与 EA 的体积比为 1 1, 复乳超声时间为 80 s 2.5 验证试验按 2.4 项下纳米粒优化的处方工艺, 制备了 3 批 DOX-PLA-NPs 混悬液, 分别测定其粒径多分散指数 (polydispersity index,pdi) Zeta 电位包封率和载药量, 结果平均粒径 PDI Zeta 电位包封率和载药量分别为 (125.67±3.80)nm 0.09±0.020 ( 35.97±1.58)mV (81.23±1.46)% (10.29±0.63)% (n=3) 2.6 纳米粒的理化性质评价外观形态取适量纳米粒混悬液, 用 2.0% 磷钨酸溶液负染, 透射电子显微镜观察, 结果见图 1 纳米粒呈圆形或类圆形, 大小及分布较均匀表 1 正交设计因素水平表 Tab. 1 Factors and levels of the orthogonal test 因素水平 DOX/μL PVA/% DCM EA T/s 表 2 正交试验方案和结果 Tab. 2 Projects and result of orthogonal design No. A B C D 粒径 /nm EE/% DL/% OD K K K R 表 3 方差分析表 Tab. 3 Variance analysis of the orthogonal design 方差来源离均差平方和自由度 F 值 P A <0.05 B <0.05 C <0.05 D 注 :F 0.05 (2,2)=19.00 Note: F 0.05 (2,2)= 图 1 DOX-PLA-NPs 透射电镜照片 Fig. 1 TEM photograph of DOX-PLA-NPs 中国现代应用药学 2017 年 8 月第 34 卷第 8 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 August, Vol.34 No

4 2.6.2 粒径与 Zeta 电位取适量纳米粒混悬液全释放 DOX-PLA-NPs 前期有一定量的突释在稀释 Nano-ZS 型粒径分析仪测定平均粒径及 Zeta 2 h 内的累计释药量为 16.3% 12 h 后平稳释药电位见图 2~3 48 h 内释药量为 55.8% 呈现明显的缓释特性药动学研究给药方案与血样采集取健康 SD 大鼠 12 只禁食 12 h 自由饮水随机分为 2 组每组 6 只各半按 DOX 5 mg kg 1 单剂量尾静脉注射分别给予 DOX-sol(原料药采用生理盐水复溶) 和 DOX-PLA-NPs 给药后分别于 min 图 2 DOX-PLA-NPs 的粒径分布 Fig. 2 Particle size distribution of DOX-PLA-NPs 和 h 经股动脉取血 0.5 ml(每次取血后立即给予等量的生理盐水) 置肝素钠预处理的具塞离心管中 r min 1 离心 10 min 取上层血浆样品置 80 低温冰箱保存血浆样品的处理精密移取项下血浆样品 200 μl 置离心管中精密加入内标 DNR 甲醇溶液(3.12 μg ml 1)20 μl 再加入氯仿-甲醇 (4 1)萃取液 1 ml 涡旋混合 3 min r min 1 图 3 DOX-PLA-NPs 的 Zeta 电位分布 Fig. 3 Zeta potential distribution of DOX-PLA-NPs 离心 10 min 取下层有机层于另一离心管 25 真空干燥残渣加流动相 50 μl 溶解充分涡旋振体外释放试验荡于 r min 1 离心 10 min 取上清液用于取 DOX 原料药和 DOX-PLA-NPs 适量(含 HPLC 检测 2.7 DOX 1 mg) 分别分散于 2 ml 释放介质(pH 7.4 的 PBS 缓冲液)放入经预处理的透析袋中密封后置定色谱条件为色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB C18 于 200 ml 相同 ph 值的释放介质中于(37±0.5) 柱 (250 mm 4.6 mm 5 μm) 流动相为乙腈 1 血浆中 DOX 定量测定方法采用 HPLC 测恒温水浴振荡(75 r min ) 定时取样 1 ml 并补 mol L 1 磷酸二氢钠(磷酸调 ph 至 3.0)(30 充同温等量释放介质样品用 0.22 μm 微孔滤膜滤 70) 流速为 1.0 ml min 1 柱温为 25 检测波过取续滤液按项下色谱条件进样测定长为激发波长 468 nm 发射波长 589 nm 进样量计算累积释放率绘制释药曲线结果见图 4 为 20 µl 该色谱条件下 DOX 和 DNR(内标)的保留时间各为 min 空白血浆在相应保留时间处均无干扰以 DOX 峰面积与内标峰面积的比值为横坐标(X) 对应 DOX 在样品中的浓度为纵坐标 (Y) 进行线性回归得回归方程 Y= X (r= ) 表明 DOX 血浆浓度在 0.05~10 μg ml 1 内线性关系良好最低检测浓度为 20 ng ml 1(信噪比为 3 1) 取低中高浓度( μg ml 1)的血浆样品按项下方法处理测定日内日间精密度计算回收率结果低中高浓度样品的日内精密度 RSD 分别为 4.21% 3.55% 图4 DOX DOX-PLA-NPs 的体外释药曲线(n=3) Fig. 4 In vitro release curve of DOX DOX-PLA-NPs(n=3) 由图 4 体外释药曲线可见 DOX 原药释放迅速 2 h 内的释药量达到 23.8% 24 h 时已基本完 1130 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 August, Vol.34 No % 日间精密度 RSD 分别为 7.43% 5.69% 4.32%(n=5) 绝对回收率分别为(81.53±3.25)% (83.27±4.51)% (85.20±3.68)%(n=6) 表明该方法符合体内生物样品测定要求中国现代应用药学 2017 年 8 月第 34 卷第 8 期

5 2.8.4 血浆样品测定结果大鼠尾静脉注射 DOX-sol 和 DOX-PLA-NPs 后, 平均血药浓度 - 时间曲线见图 5 药动学数据经拟合后符合开放式二室模型, 所得主要药动学参数及统计学分析结果见表 4 由表 4 可知, 在相同给药剂量下, 与 DOX-sol 比较, DOX-PLA-NPs 的 AUC 显著增大,CL 显著减小, t 1/2β 显著延长, 差异有统计学意义 (P<0.01) 图 5 大鼠尾静脉给药 DOX-sol 和 DOX-PLA-NPs 后药时曲线 (n=6) Fig. 5 Mean concentration-time of DOX in plasma after vein injection of DOX-sol and DOX-PLA-NPs (n=6) 表 4 大鼠尾静脉给药后药动学参数 (n=6, x s ) Tab. 4 Main parameters of DOX-sol, DOX-PLA-NPs and DOX-SCLPNs after vein injection in rats(n=6, x s ) 参数 DOX-sol DOX-PLA-NPs t 1/2α /h 0.022± ±0.001 t 1/2β /h 1.15± ±2.12 1) CL/h L ± ± ) AUC 0 t /μg h L ± ± ) 注 : 与 DOX-sol 比较, 1) P<0.01 Note: Compared with DOX-sol, 1) P< 讨论脂质囊纳米粒多以 PLA PLGA 或二氧化硅等聚合物纳米粒为核, 外层自组装包裹经功能基团修饰的脂质体, 提供了多重载药多级靶向的可能性, 是一种应用前景广阔的新型递药系统 [2-3] 本研究制备了粒径较小包封率与载药量较高带负电的 DOX-PLA-NPs, 为下一步制备肿瘤靶向盐酸阿霉素脂质囊纳米粒提供了良好的实验基础复乳 - 溶剂挥发法常用于制备水溶性药物纳米粒但在制备过程中, 药物易向外水相泄漏, 造成载药量和包封率偏低 [5-6] 研究发现,DOX 随着 ph 升高, 疏水性增加, 约在 ph 8.5 时, 极性最小 [6-7] 但 DOX 在强碱条件下稳定性差, 经过前期实验摸索, 最后采用通过磷酸盐缓冲液调节外水相 ph 至 8.5, 可明显提高纳米粒的包封率, 且 DOX 未被破坏同时, 笔者发现由于调节了外水相 ph, 使游离 DOX 的极性发生了改变, 若未被 PLA 全部包裹, 部分 DOX 会以絮状析出, 故本研究采用低速 - 超速离心相结合的方法测定包封率 [8] 由正交试验结果可见,DOX 用量外水相 PVA 浓度 DCM 与 EA 的体积比对纳米粒的粒径和包封率具有显著影响 PVA 在纳米粒形成过程中兼具乳化和稳定双重作用, 可明显降低有机相与水相两界面的表面张力, 形成稳定的 W/O/W 复乳, 还可增加外水相的黏度, 包裹于已形成的复乳或纳米粒表面, 形成保护膜, 防止复乳或纳米粒的破裂聚结和沉降, 从而使粒径减小, 包封率提高 ; 但 PVA 黏度大, 浓度过大时, 易使纳米粒粘连形成聚集体, 且 PVA 难从纳米粒表面除尽, 故在满足粒径与包封率的前提下, 应尽量减小 PVA 的浓度 [9] DCM 与 EA 均为 PLA 的良溶剂, 但二者性质差异较大 DCM 在水中溶解度低, 虽沸点低, 易除去, 使聚合物快速沉降, 纳米粒成形好, 但单用时, 制备的纳米粒粒径较大 [10-11] ; 而 EA 可与水部分互溶, 随着在有机相中所占比例增大, 粒径呈减小趋势, 但纳米粒 PDI 亦增大实验结果表明, 当 DCM 与 EA 以 1 1 混合时, 能得到较优的粒径与粒径分布通过体外释放与体内药动学研究可见,DOX 制成 PLA-NPs 后, 具有明显的缓释特征据文献报道 [12-14],DOX 在酸性条件下溶解度较好, 故随着 ph 降低, 释药越快这与本实验结果一致, 在 ph 7.4 的释放介质中,DOX 原药与纳米粒释药均较慢药动学结果表明纳米粒在大鼠体内的清除率显著降低, 仅为 DOX 原药清除率的 1/6 左右, AUC 增大了近 6 倍提示 DOX 体内消除显著减缓, 体内循环时间显著延长 REFERENCES [1] TACAR O, SRIAMORNSAK P, DASS C R. Doxorubicin: an update on anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems [J]. J Pharm Pharmacol, 2013, 65(2): [2] DONG X, MUMPER R J. Nanomedicinal strategies to treat multidrug-resistant tumors: current progress [J]. Nanomedicine, 2016, 5(4): [3] ZHANG J, HU J, CHAN H F, et al. irgd decorated lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted co-delivery of 中国现代应用药学 2017 年 8 月第 34 卷第 8 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 August, Vol.34 No

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.