魅力 PCR 酶与缓冲液的珠联璧合 北京全式金生物技术有限公司
上篇 下篇 PCR 历史与原理 反应体系与条件的优化 PCR 酶分类 特殊要求的 PCR PCR 酶性能 常见问题与对策
PCR 历史与原理
PCR 与 Mullis 1972 年 U.C. Berkeley 博士学位 1979 年 进入 Cetus 公司 1983 年 顿悟 PCR 原理 1986 年 6 月 首次将 Taq 酶应用于 PCR 1986 年 9 月 离开 Cetus 公司 1993 年 诺贝尔化学奖
PCR 原理 PCR:Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应核心 : 耐热 DNA 聚合酶
PCR 酶分类
A 型 B 型 DNA 聚合酶三维结构
Kohlstaedt L A,Wang J,Friedman F M,Rice P A and Steitz T A,1992. Cristal structure at 3.5 angstrom resolution of HIV-1 reverse transcriptase complex with an inhibitor. Science, 256:1783~1790 提出了 HIV-1 RT 酶的右手结构模型手掌 : 催化磷酸转移手指 : 与合成中引入的核苷酸相互作用拇指 : 与模板相互作用 Thomas A. Steitz, 1999. DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms, JBC 将该模型推广到所有 DNA 聚合酶
A 型 B 型 DNA 聚合酶三维结构 3 -exo 的位置不同
A 型聚合酶 (Taq 酶系列 ) 高扩增产量 ( 5 kb) 较低的保真性 3 -A 具有 5-3 外切酶活性, 用于探针法的荧光定量 宽泛的反应条件 对抑制物 ( 盐 血 酚等 ) 敏感 难以扩增复杂模板 ( 高 GC 二级结构等)
B 型聚合酶 (Pfu 酶系列 ) 高热稳定性 高保真性 ( 3 5 外切酶活性 ) 低扩增产量 反应条件较苛刻
一定比例 A 型聚合酶与 B 型聚合酶的混合物 ( 或用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代 B 型聚合酶 ) 高扩增产量 高合成长度 复合酶 Barnes, W. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from l bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2216 2220 保真性介于二者之间 ( 3 5 外切酶活性 )
A 型 B 型及复合酶比较 A 型酶 B 型酶 复合酶 扩增效率 高 低 高 合成长度 较短 (<5kb) 长 长 保真性 差 好 介于 A B 之间 5 3 外切酶活性 有 无 有 3 5 外切酶活性 无 有 有 产物 3 末端 3 -A 平末端 3 -A 反应条件 宽泛 苛刻 宽泛
PCR 酶性能
扩增效率 PCR 酶性能 保真性 特异性
扩增效率 为什么世界上有如此多的 PCR 酶? 实验表明, PCR 酶对于反应具有偏好性 仅以两种酶为例说明 ALL 10% 10% 60% A A&B B 20%
保真性 检验标准 : 突变率 突变率与所选的基因 PCR 条件有密切关系 蓝白斑显色法检验 LacZα 基因突变率 Stanislaw K. Jozwiakowski and Bernard A. Connolly*. (2009) Plasmid-based lacza assay for DNA polymerase fidelity: application to archaeal family-b DNA polymerase. Nucleic Acids Research. Janice Cline, Jeffery C. Braman and Holly H. Hogrefe*. (1996) PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Research. 24, 3546 3551
保真性 不同聚合酶保真性比较 DNA Polymerase 错配率 (bp/cycle) 30 cycles (error/bp) 30 cycles (error/4 kb) 克隆数 ( 无错配 ) Taq 8x10-6 2.4x10-4 0.96 4 out of 100 Pfu 1.3x10-6 3.9x10-5 0.16 84 out of 100 EasyPfu 4.5x10-7 1.4x10-6 0.05 95 out of 100 TransFast Pfu 1.5x10-7 4.5x10-7 0.015 98 out of 100 Platinum Taq HF 4x10-6 1.2x10-4 0.48 52 out of 100 * PCR 条件对错配率有明显的影响 ( 酶 dntp 以及镁离子浓度, 等等 )
保真性 B 型聚合酶与复合酶 优点 缺点 B 型聚合酶 (Pfu 酶 ) 高保真性产物为平末端 聚合速度慢产量较低 复合酶 高扩增效率与合成长度产物带 3 -A 保真性相对较低
对 Pfu 酶扩增效率的改进 扩增效率低的主要原因 :dttp dutp 与 Taq 酶相比,Pfu 酶对 dutp 更敏感, 无法利用 dutp 合成 Stratagene 公司对该酶加以改进 另有公司利用 DNA 结合蛋白, 提高灵敏度
对 Pfu 酶速度的改进 快速高保真酶 速度 保真性 提升速度 = 牺牲保真性?
TransStart FastPfu &TransStart FastPfu Fly 对 EasyPfu 酶进行基因改造, 对酶的不同催化活性域进行突变, 并加以筛选
快速与高保真 扩增速度 保真性 EasyTaq 1 kb/min 1 EasyPfu 0.5 kb/min 18 TransStart FastPfu 2~4 kb/min 54 扩增速度 :15~30 sec/kb 与模板和片段长度有关 15 sec/kb 可满足大多数反应, 对某些反应, 为得到较高扩增量与特异性, 可延至 30 sec/kb(enough!) 最快可达到传统 Pfu 酶的 8 倍
FastPfu FastPfu Fly,EasyPfu 扩增速度比较
同类产品 Finnzymes:Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB:Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Bio-Rad:iProof High-Fidelity DNA Polymerase Stratagene:PfuUltraII Fusion HS DNA Polymerase (Toyobo:KOD Plus,1kb/min)
对复合酶的改进 保真性的提升 复合酶高保真性的来源 : 少量 Pfu 酶的核酸外切酶活性 改造思路 : 利用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代 Pfu 酶与聚合能力低 对 dutp 敏感的 Pfu 酶相比, 此类复合酶由 Taq 酶完成全部聚合, 合成效率更高 TransTaq-T TransTaq-HiFi TransStart Taq 普通 Taq 酶保真性的 18 倍与 EasyPfu 相当
特异性 热启动酶 热启动酶 : 常温下酶活受限, 需加热步骤才能释放酶活 酶活 72 温度
不同热启动方法比较 化学修饰法 需要预加热 (10 min) 步骤, 损伤 DNA 样品 酶活 抗体封闭法 利用 Taq 抗体 ( 来源于哺乳动物 ), 有残留 DNA 污染的潜在风险 基因改造 (TransTaq 系列 ) 不使用抗体, 无需预加热 温度
TransStart 双封闭法原理
反应体系与条件的优化
PCR 体系 模板, 引物 dntps SuperMix 酶 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ )
PCR 体系中各组分相互作用 Mg 2+ PCR 酶 合成链 模板链 PPi dntps
模板 : 品质高 模板核酸的纯度, 也是 PCR 成败的关键环节之一 这些杂质经常存在于传统方法制备获得的模板中 详情见下表 杂质 SDS 酚乙醇氯化钠 EDTA RT 反应混合物 抑制 PCR 反应的杂质浓度 >0.005%(w/v) >0.2%(v/v) >1%(v/v) 5 mm 0.5 mm 15%(v/v)
模板 : 浓度适当 高保真要求 : 降低循环数, 增加模板量 定点突变 : 减少模板量, 提高突变率 模板量加入过多, 也会产生弥散的产物或者非特异性的扩增产物 模板中抑制物或杂质较多 : 降低模板用量或稀释模板 ( 植物基因组 土壤提取物 粪便提取物 血样等 )
dntps: 浓度与纯度 作为原料, 对反应有至关重要的影响 影响产量 影响特异性 影响保真性 选择可靠的 dntps: 浓度准确, 高纯度
不同公司 dntps 的比较 图 A 图 B 图 C 2~5 泳道为不同公司 dntps 扩增效果比较 上下两图为两个公司 dntps 扩增效果的比较
反应缓冲液 ph 值提供酶的最佳工作环境 ph 升高, 扩增量提升, 但突变率也会有所上升 ph 降低, 扩增量下降, 保真性提升 离子强度 (KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 等 ) 中和 DNA 所带电荷
NH4+ 和 K+ 阳离子存在于 PCR 缓冲液中, 加强了引物的特异性退火
关键组分 :Mg 2+ Mg 2+ 酶工作所必需的离子与 dntps 和模板螯合在一起, 成为 DNA 聚合酶识别的底物 Mg 2+ 升高 : 提升扩增量, 产生非特异性扩增, 突变几率增加 Mg 2+ 降低 : 降低扩增量, 特异性增强, 突变少 可以根据实验要求对镁离子进行调整 对于 Pfu 系列酶, 有时需要适当调整 ( 如 cdna 模板, 长片段 )
M 1 2 3 4 人基因组 DNA 模板, Rhod 1.2 kb EasyTaq 扩增 Lane M:Trans 8K DNA Marker Lane 1:Mg 2+ 1.0 mm Lane 2:Mg 2+ 1.5 mm Lane 3:Mg 2+ 2.0 mm Lane 4:Mg 2+ 2.5 mm 随着 Mg 2+ 浓度的提高, 扩增产量随之提升
M 1 2 3 4 5 人 cdna 模板, GAPDH 0.5 kb EasyTaq 扩增 Lane M:Trans 2K DNA Marker Lane 1:Mg 2+ 0 mm Lane 2:Mg 2+ 1.0mM Lane 3:Mg 2+ 2.0 mm Lane 4:Mg 2+ 3.0 mm Lane 5:Mg 2+ 4.0 mm 随着 Mg 2+ 浓度的提高, 产物特异性逐渐降低
即使是同一种酶, 对于不同的反应, 需要的最佳工作环境也有所不同 缓冲液的偏好性 TransTaq HiFi: 配有两种缓冲液, 针对不同类型模板 Buffer I: 基因组模板 缓冲液的偏好性 Buffer II:cDNA 模板 质粒模板
某些公司的酶配套有 GC Buffer, 针对高 GC 含量或复杂模板 DMSO 甜菜碱 海藻糖 等增强剂 辅助解链, 稳定单链结构, 促进合成 复合增强剂 : 几种增强剂按特定比例的混合物, 与单一增强剂相比, 有更强的促进能力 更广泛的适用性 GC Enhancer, PCR Stimulant(Transgen)
模板 GC 含量 80% 增强剂与 Mg 2+ 对 PCR 的影响 1:Mg 2+ 2mM,1 GC Enhancer 2:Mg 2+ 3mM,1 GC Enhancer 3:Mg 2+ 3mM,2 GC Enhancer 目的条带 1 2 3 1 2 3 TransTaq HiFi TransStart Taq
PCR 条件 ( 三步法 ) 预变性 变性 预变性 94 5-10 min 延伸 后延伸 变性 94 30 s 退火 30 s 退火 延伸 72 s 后延伸 72 10-20 min 循环数
预变性 变性 PCR 条件 ( 两步法 ) 退火延伸 后延伸 预变性变性退火延伸 94 94 68 5-10 min 30 s s 循环数 后延伸 68 10-20 min
两步法的适用范围 对于短片段的扩增, 减少变温步骤可节省反应时间 对于长片段的扩增, 减少变温步骤可减缓长时间反应中酶活的衰减 并不适合所有的反应 关键在于退火与延伸温度能否合一? 取决于酶的活性特点 引物的退火温度等 均可以用三步法替代
关键 : 退火温度过高 : 退火失败, 扩增量低或无扩增过低 : 非特异性退火较多, 有背景或杂带经验 :Tm-5 or 55 循环数 : 扩增效率 反应条件的优化 特异性 保真性 预变性充分预变性 (10 min): 菌液 PCR UDG qpcr Mix 某些热启动酶 后延伸充分后延伸 (20 min): 充分加 A, 确保片段合成完整
特殊要求的 PCR
无需提取 gdna 的 PCR 有效裂解组织 抗抑制能力强 扩增能力强的聚合酶 适合于不同材料
TransDirect Animal Tissue PCR Kit TransDirect Plant Tissue PCR Kit TransDirect Blood PCR Kit 针对不同组织类型的裂解液系统 2 TransDirect PCR SuperMix 核心 TransBD Taq DNA 聚合酶通过 Gene Shuffling 技术获得的第二代 Taq DNA 聚合酶具有极强的抗抑制能力 使用方便裂解液 / 血液直接作为模板, 只加入引物和水, 使 SuperMix 溶液的浓度为 1 即可进行反应
TransDirect Plant Tissue PCR Kit
TransDirect Animal Tissue PCR Kit
TransDirect Blood PCR Kit M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M M 人血 / 肝素抗凝, 直接扩增 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 人血 /EDTA 抗凝, 直接扩增 人血 / 新鲜, 直接扩增
M 1 2 3 4 M M 1 2 M M 1 2 3 4 M M 1 M 禽血柠檬酸钠抗凝 鼠血肝素抗凝 人培养细胞 人口腔上皮细胞
巢式 PCR ----------------------- ----------------------- 嵌套式引物扩增第一步产物作为第二步模板
多重 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Exon 7 and 8 Exon 9 Exon 3 Exon 5 Exon 1 Exon 2 Exon 6 Exon 4 要求 : 高扩增效率, 高特异性 TransStart Taq 可以调整不同引物间的比例
常见问题与对策
根据实验要求, 选择 尝试合适的酶 失败的扩增, 往往是酶的选择不合适 确保模板 引物的品质
从性能到问题 扩增效率 特异性 保真性 扩增弱 / 无扩增 背景与杂带 突变
问题与对策 问题扩增效率低特异性差保真性差 对策 选择高扩增效率的酶优化体系与条件 选择热启动酶特殊 PCR( 巢式 Touch Down ) * 重新设计引物 * * 凝胶回收目的条带 RT-PCR: 反转录酶的保真性选择高保真酶 PCR 体系与条件的控制具体问题具体分析,PCR? 测序? 其它原因 ( 胶回收 菌体内同源重组 )?
根据实验需求选择 PCR 酶 ( 以 TransGen 产品为例 ) 普通 PCR EasyTaq TransFast Taq 高保真 PCR TransTaq 系列, TransStart Taq, Trans Pfu 系列 特殊要求的 PCR 高特异性 PCR TransStart 系列 高 GC 含量 复杂模板 长片段 PCR Direct-PCR TransTaq HiFi, TransStart 系列, GC Enhancer PCR Stimulant TransTaq HiFi, TransStart 系列 FastPfu 系列 TransDirect PCR Kit
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