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武名从
6 years ago
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1 驾驭反转录从实验的成败到前沿技术北京全式金生物技术有限公司 :

2 反转录酶概述 RNA 模板制备与反转录反转录实验策略反转录的应用

3 反转录酶概述反转录酶发现历史反转录酶简介

4 1975 年诺贝尔生理和医学奖 David Bahirsore Howard Martin Tersin Renato Dulbecco

5 1975 年诺贝尔生理和医学奖 Baltimore, D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226, Temin, H. M., and Mizutani, S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226, 发现了逆转录酶, 证明遗传信息不仅由 DNA 到 RNA, 也可由 RNA 到 DNA

6 反转录酶的酶学特性具有依赖于 DNA 或 RNA 模板的 DNA 聚合酶活性相对于 DNA 模板, 以 RNA 为模板时具有更高的比活性没有 3 和 5 外切核酸酶的活性, 因此没有校正功能具有降解 DNA:RNA 杂合双链中 RNA 的 RNase H 活性

7 反转录酶的酶学特性两种活性均为病毒复制循环所必需 Coffin, J. M., Hughes, S. H., and Varmus, H. E. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press 两个活性中心在结构上是相互独立单独折叠的两个结构域, 在 RT 上的相对位置固定 DNA 聚合酶结构域位于 N 端,RNase H 结构域位于 C 端

8 反转录酶的结构研究 Kohlstaedt L A,Wang J,Friedman F M,Rice P A and Steitz T A,1992.Cristal structure at 3.5 angstrom resolution of HIV-1 reverse transcriptase complex with an inhibitor.science,256:1783~1790 提出了 HIV-1 RTase 的右手结构模型手指 : 与合成中引入的脱氧核苷酸相互作用手掌 : 催化磷酸转移拇指 : 与模板相互作用

9 反转录酶的结构研究 DNA 聚合酶活性中心手指 : 红色手掌 : 蓝色拇指 : 绿色 RNase H: 紫色 RNase H 活性中心 The structure of MMLV RTase( 2004 )

10 DNA 聚合酶活性持续合成能力指酶与引物 / 模板结合, 延伸, 解离这样一个循环所能掺入的核苷酸的平均数目 RTase 的持续合成能力比较低, 通常条件下小于 1 kb 要继续链的延伸, 必需有 RTase 分子重新结合到引物 / 模板复合物上

11 DNA 聚合酶活性保真性反转录酶错配率 :10-6 ~10-4 宿主 DNA 聚合酶 :10-11 ~10-7 原因 : 缺乏 5-3 和 3-5 外切酶活性

12 RNase H 活性为病毒生命周期中复制循环所必需降解 DNA:RNA 杂交链上的 RNA 反转录 : 以 RNA 为模板, 合成 cdna, 产物为 DNA/RNA 杂交链 RNase H 活性限制了反转录酶的合成长度

13 RNase H Minus 有助于提升 cdna 合成长度 RNase H RNase H Minus

14 几种代表性反转录酶 HIV1 RTase: 研究最早最透彻的反转录酶 AMV RTase: 源自禽成髓细胞瘤病毒 ( 禽源 ) MMLV RTase: 源自莫洛尼鼠白血病病毒 ( 鼠源 )

15 AMV RTase & MMLV RTase AMV RTase MMLV RTase RNase H 活性强, 合成长度短弱, 合成长度长合成量低高热稳定性反应温度好 42~55 差 37~42

16 反转录相关实验完整流程材料 ( 培养细胞组织等 ) RNA cdna 模板制备 (RNA 提取 ) 反转录 (cdna 模板制备 ) PCR qpcr microrna 检测

17 RNA 模板的制备与反转录高品质的 RNA 模板是反转录成功的前提材料保存 RNA 提取与检验基因组 DNA 残留

18 材料保存有条件的情况下应立刻提取或液氮速冻原因 : 内源 RNase 污染 RNase 来自溶酶体细胞死亡, 溶酶体破裂释放, 导致 RNA 降解尽快处理材料, 液氮保护不方便使用液氮的情况下 : 专门的材料保存试剂 e.g. RNAhold (TransGen)

19 RNAhold 原理 : 主要成分为非特异性蛋白变性剂可快速渗透组织, 变性抑制 RNase, 保护 RNA 尤为适合没有低温实验条件的情况下, 如野外采样

RNAhold 作用效果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1: 新鲜材料 2:

RNAhold -,4 weeks 8: -20, RNAhold +,4 weeks

20 RNAhold 作用效果 : 新鲜材料 2: 37,RNAhold+,1 day 3: 37, RNAhold -,1 day 4: 4, RNAhold -,2 weeks 5: RT, RNAhold +,2 weeks 6: 4, RNAhold +,2 weeks 7: -80, RNAhold -,4 weeks 8: -20, RNAhold +,4 weeks 9: -80, RNAhold +,4 weeks 以上所有数据均为 Human Total RNA(HeLa cell)

21 RNA 提取常用方法比较胍盐法胍盐有效裂解细胞胍盐抑制 RNase, 保持 RNA 完整氯仿分相或结合硅胶膜去除蛋白 DNA 提取量大 EasyPure RNA Kit Viral DNA/RNA Kit Plant RNA Kit Blood RNA Kit TransZol TransZol Up CTAB 法 CTAB 原理裂解释放 RNA 避免多糖多酚结合 RNA 适合多种植物材料 TransZol Plant

22 RNA 提取注意事项根本原则 : 防止 RNA 降解, 确保 RNase free! 避免外源 RNase: 操作细节避免内源 RNase: 材料处理与保存

23 RNA 提取操作细节避免外源 RNase 污染仪器 :RNase free 耗材高温或 DEPC 处理器皿试剂 :RNA 实验专用 DEPC 处理人员 : 戴口罩手套环境 :RNase free 工作区避免内源 RNase 污染操作快速! 液氮研磨 / 液氮速冻 RNA 保存试剂

24 RNA 品质检验凝胶电泳检验紫外分光光度计检验 Agilent s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer ( 以下简称 ARLC&2100B)

25 M 1 2 凝胶电泳检验 Genomic DNA 28s RNA 18s RNA 5.8s RNA Lane M:Trans8K DNA Marker Lane 1 2:Human Total RNA 新缓冲液高电压 / 短时间 add RNase Inhibitor

26 A260/280 紫外分光光度计检验 Pure RNA:~2.0 ( Pure DNA:~1.8) 蛋白质残留会显著降低该比值 A260/230 通常大于 A260/280:2.0~2.2 A230 处有吸光的物质残留会显著降低该比值, 如 : 糖类 EDTA 酚胍盐无法检验 RNA 是否降解

27 ARLC&2100B 检验 5.8 S 18 S 28 S 完整 RNA 降解 RNA

28 几种检验方法比较判断 RNA 是否完整凝胶电泳法紫外分光光度计 ARLC&2100B 可以不可以可以准确定量不可以可以可以检验基因组 DNA 可以不可以可以检验蛋白, 盐类, 酚等杂质不可以可以受溶剂影响不敏感敏感敏感

29 基因组 DNA 残留 RNA 提取时, 最值得注意的污染物对 PCR qpcr 等后续实验可能有影响, 尤其影响 qpcr 定量结果提取 RNA 时, 应尽量去除后续实验时, 应设对照检验, 或设计实验去除其影响选择使用适当的试剂, 反转录过程中去除基因组 DNA 残留

30 去除基因组 DNA 残留选择适当的提取方法, 选择高品质提取试剂 DNase I (RNase free!) 处理选择基因组 DNA 去除和反转录同时进行的试剂

31 DNase I 反应条件工作环境 : 活性依赖 Ca 2+ Mg 2+ : 随机切割双链 DNA 的任意位点 Mn 2+ : 在同一位点切割 DNA 双链, 形成平末端, 或 1-2 个核苷酸突出的粘末端抑制 :EDTA SDS DTT/β-ME 高盐 (>100 mm)

32 DNase I 失活 65 加热 10 分钟 (with 2.5 mm EDTA!) 酚 - 氯仿抽提

33 反转录实验策略常规反转录方法与优化的反转录方法反转录效率的影响因素 C to C (Cell to cdna) 去除 DNA 同时反转录

34 常规反转录体系模板引物 dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) RI 酶

35 优化的反转录体系 SuperMix 模板引物 Rxn Mix All-in-One dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) Enzyme Mix RI 酶

36 First -Strand Synthesis SuperMix Other First -Strand Synthesis Kit Trans First -Strand Synthesis SuperMix TransScript All-in-One First- Strand cdna Synthesis SuperMix RNA RNA RNA + + Primer Primer + Buffer + dntps = + 2 RT Reaction Mix = + All-in-One + RT Enzyme + = + RT/RI Enzyme Mix RNase Inhibitor

37 All-in-One 除 RNA 模板外, 所有组分预混完毕, 最大程度简化操作优化的引物 Mix:Oligo dt/random Primer, 高效反转录各类模板

38 TransScript All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for PCR(AT321) TransScript II All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for PCR (AH321) 操作简单反应快速高兼容性长链合成效率高

39 TransScript All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AT341) TransScript II All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AH341) 操作简单反应快速高兼容性短链合成效率高 RT 同步去除 gdna

40 变性 65~70 5 min 常规反转录条件失活 min Add RNA Primer 退火 min 随机引物延伸 37~42 50 min 1.5 h 冰浴 2 min Add dntps Buffer RI RTas e 结束

41 Trans 优化的反转录条件失活 85 5 min 退火 min 随机引物延伸 42~55 10~30 min 35 min Add all components 结束

42 All-in-One for qpcr 失活 85 5 sec 延伸 42~55 15 min 15 min Add All-in-one RNA (gdna Remover) H 2 O only! 结束

43 反转录效率影响因素 RNA 引物酶

44 几种反转录引物

45 Oligo(dT)/Random Primer Oligo(dT) Oligo(dT)/ Random Primer

46 反转录效率影响因素反转录酶 RNase H 活性聚合酶活性合成能力聚合酶活性保真性热稳定性

47 RNase H 活性 RNase H Minus 有助于提升 cdna 合成长度

48 RNA 模板浓度对反转录效率的影响对于不同浓度的 RNA 模板, 反转录效率是否一致? 35 Ct 蓝色直线 : 理论关联性橙色曲线 : 实际关联性 Human RNA,GAPDH;RTase 200 units 2 20 模板量 /ng

49 反转录酶量对反转录效率的影响对于一定量的 RNA 模板, 反转录酶量是否影响反应效率? Ct 蓝色直线 : 理论关联性橙色曲线 : 实际关联性 Human RNA 100 ng,gapdh 反转录酶量 units

50 根据反转录效率选择反转录酶反转录酶的动力学范围 : 对不同浓度 RNA 模板的反转录效率一致时,RNA 模板的浓度范围选择高品质反转录酶, 动力学范围宽广对低浓度 RNA 可以有效反转录对高浓度 RNA 没有抑制

51 反转录酶的保真性反转录酶保真性低原因 : 缺乏 3-5 外切酶活性在反转录酶中加入具有 3-5 外切酶活性的蛋白, 赋予其校正功能实现高保真 RT-PCR

52 热稳定性对反转录效率影响复杂模板中二级结构阻碍合成常规温度反转录高温打开二级结构, 合成继续要求反转录酶热稳定性高高温反转录

53 Trans RT 酶系列产品改造原理 DNA 聚合酶活性域 RNaseH 活性域

54 Trans RT 系列产品性能比较 EasyScript TransScript TransScript II 合成长度增加灵敏度增强 8 kb 12 kb 15 kb 保真度增强反应温度 ~55 (50) 适合高 GC 复杂模板

55 C to C (cell to cdna) 材料 ( 培养动物细胞 ) 模板制备 (RNA 提取 ) C to C RNA cdna 反转录 (cdna 模板制备 ) 裂解细胞, 释放 RNA (DNase I 处理 ) 裂解液作为 RNA 模板直接反转录

56 DNA 去除与 RT 同时进行材料 ( 培养细胞组织等 ) 模板制备 (RNA 提取 ) DNA 去除 /RT RNA cdna DNase I 处理 RNA (genomic DNAMinus) 反转录 cdna 合成步骤 /DNA 去除步骤同时进行 RTas e 失活 / DNase I 失活同时进行

57 TransScript TM One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix(AT311) TransScript TM II One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix(AH311)

58 TransScript All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AT341) TransScript II All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AH341) 操作简单反应快速高兼容性短链合成效率高 RT 同步去除 gdna

M CYC1007 ACTR BACHI BACHI GNE cr cv cn M

cdna 扩增片段第三道为对照 RTase(T 公司 ) 反转 cdna 扩增片段

59 M CYC1007 ACTR BACHI BACHI GNE cr cv cn M A3 H CYC M: Trans2k Plus II 第一道为对照未加入 gdna Remover 反转 cdna 扩增片段第二道为加入 gdna Remover 反转 cdna 扩增片段第三道为对照 RTase(T 公司 ) 反转 cdna 扩增片段结果分析 : 1. 从 GNE 至 6.1(1.5Kb~6.1Kb), 对照 T 公司试剂均显示出弱扩增现象 ; 2. A3 H 3.6 等基因可直观观察到 gdna Remover 对能否准确定量的影响 ; 3. 备注 : 图中 gdna Remover 加或不加扩增产量相同的基因 : 引物本身跨内含子

60 No gdna Remover gdna Remover 值Ct D-1ul D-2ul D-4ul D-8ul R-1ul R-2ul R-4ul R-8ul DR-1ul DR-2ul DR-4ul DR-8ul 20 ng/μl gdna 100 ng/μl RNA 20 ng/μl gdna+100 ng/μl RNA TransScript TM One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix 通过 qpcr 观察作用效果

61 反转录的应用 PCR qpcr microrna

62 PCR cdna 模板用量特殊要求的 PCR 两步法与一步法 RT-PCR

63 cdna 模板用量通常推荐 PCR 体系的 1/20~1/10 e.g. 50 μl 体系, 一般加 2.5~5 μl cdna 用量过多, 会抑制 PCR cdna 中, 如目的基因丰度很高, 可减少用量或稀释

64 远离 3 端片段扩增特殊要求的 PCR 选择 RNase H - 的反转录酶选择合适的反转录引物 ( 如 Oligo-dT/Random Primer Mix) 高保真扩增选择具有校正功能的反转录酶与 PCR 酶

65 一步法 RT-PCR 与两步法的比较 RNA 反转录 (cdna 模板制备 ) cdna 一步法 PCR 同一反应管中, 完成反转录与 PCR 简单, 快捷, 适合高通量检测无法获得 cdna

66 qpcr 高品质 RNA 模板确保数据准确基因组残留问题解决方案微量材料的有效 qpcr

67 高品质 cdna 模板确保数据准确制备高品质 RNA 模板选择合适的反转录引物选择动力学范围广的反转录酶

68 RNA 模板完整对 qpcr 的影响

69 RNA 模板完整对 qpcr 的影响

70 随机引物反转录引物对 qpcr 的影响能以 rrna 为模板合成 cdna, 具有拷贝数被高估的风险 oligo(dt) 引物特异性优于随机引物, 需要 Poly-A, 受复杂结构影响较大 oligo(dt) 引物和随机引物的混合物受复杂结构影响较小, 弥补了由于酶的合成长度限制, 导致某些距 Poly-A 较远的基因用 oligo(dt) 合成效率低的情况基因特异引物 cdna 合成的特异性最好,qPCR 的首选

71 20 cycles TransScript II 反转录酶动力学范围对 qpcr 的影响 17 cycles A 公司 RTas e

72 基因组残留问题解决方案 qpcr 引物设计 NRC 对照采用 TransScript TM / TransScript II TM One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix

73 qpcr 引物设计 -1 Extron-1 Intron Extron-2 Genomic DNA Primer F Primer R Extron-1 Primer F Extron-2 Primer R cdna 扩增片段长度不同

74 qpcr 引物设计 -2 Extron-1 Intron Extron-2 Genomic DNA Primer 无法退火,PCR 失败 Extron-1 Primer Extron-2 cdna 成功退火,PCR 成功

75 NRC 对照 Sample NRC NRC 理想情况 :Ct NRC =0 数据准确 :Ct NRC -Ct Sample >5 (>10)

76 微量材料的有效 qpcr C to C 方法制备 cdna 模板一步法 qrt-pcr 定量 cdna

77 microrna microrna: 高度保守, 长度 18~25 nt 在动植物体内广泛存在, 可以抑制特定基因表达, 在表达调控中有重要作用研究基因功能的重要手段

78 microrna 检测方法 Northern Blot Micro array Real-time RT-PCR(qRT-PCR) 可高通量检测, 也可检测微量 mirna 可区分前体 mirna 与成熟 mirna 可区分单碱基差异易于操作

79 mirna 特异引物茎 - 环结构引物线状引物 qrt-pcr 检测 microrna cdna 合成 mirna 加尾 Poly-A (E.coli Poly-A Polymerase) adaptor (T4 RNA Ligase)

80 microrna 的 cdna 合成方法一 Caifu Chen*, Dana A. Ridzon, Adam J. Broomer, (2005) Real-time quantification of micrornas by stem loop RT PCR, NAR, VOL.33 NO.20: e179

81 microrna 的 cdna 合成方法二

82 microrna 的 cdna 合成方法三 A A A A A A

83 microrna 的 cdna 合成方法四

84 谢谢!

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