体外基因扩增 ——PCR技术

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彬倪
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1 体外基因扩增 PCR 技术 Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology

2 PCR 技术简史 PCR 的原理 PCR 的反应体系和方法 PCR 的类型和应用

3 PCR 技术简史 DNA 的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 DNA 解旋解链合成引物 5 3 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3 5 解旋酶解链酶子链延长

4 PCR 技术简史 DNA 的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 DNA 解旋解链合成引物子链延长 5 3 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 5 引物引物酶引物引物酶 AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3 5 5

5 PCR 技术简史 DNA 的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 DNA 解旋解链合成引物子链延长 5 3 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCT DNA GGAUCG 3 5 DNA 聚合酶 AUCGCG ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 聚合酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

6 PCR 技术简史 DNA 的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971 年,Khorana 提出 : 经过 DNA 变性, 与合适引物杂交, 用 DNA 聚合酶延伸引物, 并不断重复该过程便可克隆 trna 基因但由于测序和引物合成的困难, 以及 70 年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能, 所以,Khorana 的设想被人们遗忘了

7 PCR 技术简史 DNA 的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1985 年, 美国 PE-Cetus 公司 (ABI 前身 ) 的 Mullis 等人发明了聚合酶链反应 (PCR) 基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA 复制最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR, 由于该酶不耐热, 使这一过程耗时, 费力, 且易出错耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行, 随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循环仪 1993 年,Mullis 等因此项技术获诺贝尔化学奖

8 Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989 年美国 Science 杂志列 PCR 为十余项重大科学发明之首, 比喻 1989 年为 PCR 爆炸年,Mullis 荣获 1993 年度诺贝尔化学奖

9 生物样品生物样品 DNA DNA 片段片段基因诊断基因诊断基因治疗基因治疗基因工程产品基因工程产品法医学检测法医学检测人类学研究人类学研究

10 基因组 DNA 扩增特定DNA 获取特定 DNA 片段扩片段 DNA 片段

11 DNA 聚合酶引物引物 Sanger 的测序技术引物 DNA 聚合酶 M13 噬菌体

12 Mullis 的构思引物 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶引物特定 DNA 片段

13 94 变性退火 XX 延伸

15 Taq DNA 聚合酶 (thermus( aquaticus) 活性性(%) (%) 酶活温度 ( )

16 PCR 循环

17 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点标准的 PCR 反应体系 4 种 dntp 混合物各 200umol/L 引物各 10~100pmol 模板 DNA 0.1~2ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg mmol/L

18 温PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点 94 度72 ( ) 55 1 高温变性形成2 条单链DNA 变性2 低温退火 DNA 单链与引物复性 3 适温延伸子链延伸 DNA 加倍重复 1~3 步 25~30 轮目的 DNA 片段扩增 100 万倍以上 22 DNA 双螺旋时间 (min)

19 温PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点度72 ( ) 高温变性形成2 条单链DNA DNA 双螺旋变性2 模板 DNA 3 低温退火 DNA 单链与引物复性适温延伸子链延伸 DNA 加倍重复 1~3 步 25~30 轮目的 DNA 片段扩增 100 万倍以上时间 (min)

20 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点引物 1 DNA 引物引物 2

21 PCR 的基本原理 Taq 酶 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点引物 DNA 引物引物 2 Taq 酶

22 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点第 1 轮结束第 2 轮开始

23 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 Taq PCR 过程 PCR 的特点 Taq Taq Taq

24 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点 72 第 2 轮结束

25 模板 DNA 第 1 轮扩增第 2 轮扩增 PCR 的基本原理 PCR 反应条件第 PCR 3 轮扩增过程 PCR 的特点第 4 轮扩增第 5 轮扩增第 6 轮扩增

26 PCR 的基本原理 PCR 反应条件 PCR 过程 PCR 的特点灵敏度高 1. 皮克 (pg=10-12 ) 量级扩增到微克 (ug=10-6 ) 水平 2. 能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 3. 病毒检测的灵敏度可达 3 个 RFU 4. 细菌检测的最小检出率为 3 个细菌简便快速 1. 一次性加好反应液,2~4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液体腔液洗嗽液毛发细胞活组织等组织的粗提 DNA

27 引物设计 : (1) 序列应位于高度保守区, 与非扩增区无同源序列 (2)) 引物长度以 bp 为宜 (3) 碱基尽可能随机分布,G+C 占 50-60% (4)) 引物内部避免形成二级结构 (5)) 两引物间避免有互补序列 (6)) 引物 3 端为关键碱基 ;5 ; 端无严格限制

28 限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记

29 PCR 反应条件 1)PCR 反应成分 (1)) 模板单双链 DNA 均可不能混有蛋白酶核酸酶 DNA 聚合酶抑制剂 DNA 结合蛋白类一般 100ng DNA 模板 /100μL 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加

30 (2)) 引物浓度 μmol/l 浓度过高易导致模板与引物错配, 反应特异性下降 (3)Taq DNA 聚合酶 (thermus( aquaticus) U/50 μl 酶量增加使反应特异性下降 ; 酶量过少影响反应产量

31 (4)dNTP dntp 浓度取决于扩增片段的长度四种 dntp 浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入, 浓度过低则降低反应产量 dntp 可与 Mg 2+ 结合, 使游离的 Mg 2+ 浓度下降, 影响 DNA 聚合酶的活性

32 (5) Mg 2+ Mg 2+ 是 DNA 聚合酶的激活剂 0.5mmol/L-2.5mmol/L 反应体系 Mg 2+ Mg 2+ 浓度过低会使 Taq 酶活性丧失 PCR 产量下降 ; Mg 2+ 过高影响反应特异性 Mg 2+ 可与负离子结合, 所以反应体系中 dntp EDTA 等的浓度影响反应中游离的 Mg 2+ 浓度

33 2) ) 循环参数 (1) 变性使双链 DNA 解链为单链 95 o C 秒 (2) 退火温度由引物长度和 GC 含量决定增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 ; 降低温度可增加反应的灵敏性

34 (3)) 延伸 o C, 延伸时间由扩增片段长度决定 (4)) 循环次数主要取决于模版 DNA 的浓度一般为次次数过多 : 扩增效率降低错误掺入率增加

35 PCR 的类型和应用研究基因克隆,DNA 测序, 分析突变诊断细菌病毒寄生虫检测, 诊断人类基因组工程遗传图谱的构建,DNA 测序, 表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他

36 1) ) 不对称 PCR 目的 : 扩增产生特异长度的单链 DNA 方法 : 采用两种不同浓度的引物分别称为限制性引物和非限制性引物, 其最佳比例一般是 μM, 关键是限制性引物的绝对量用途 : 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组 DNA 结构功能的研究

37 低浓度引物高浓度引物

38 2) 反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA 片段对某个已知 DNA 片段两侧的未知序列进行扩增可对未知序列扩增后进行分析, 如探索邻接已知 DNA 片段的序列 ; 用于仅知部分序列的全长 cdna 的克隆, 扩增基因文库的插入 DNA; 建立基因组步移文库未知序列已知序列未知序列

39 限制酶未知序列已知序列未知序列限制酶连接酶

40 3) ) 多重 PCR 用于检测特定基因序列的存在或缺失引物电泳

42 4)LP-PCR(Labelled primers) 利用同位素荧光素等对 PCR 引物进行标记, 用以直观地检测目的基因特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒 1 病毒 2 病毒 3 病毒 4

43 标记引物 PCR PCR 产物观察

44 5) ) 锚式 PCR 已知靶基因片段一侧的序列

45 VL VH CL CH1 CH1 CL VH VL CH2 CH2 CH3 CH3

46 cdna 末端核酸转移酶 3 GG GG 5 CC CC 锚定引物 3 GG GG 5 CC CC 3 GG GG CC CC

47 6)PCR 固相分析法模板探针亲和固相介质 PCR 扩增检测探针信号生物素化引物

48 7) ) 原位 PCR 原位聚合酶链式反应 (In( Still PCR,Is Is- PCR) 是由 Haase 等于 1990 年首创它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段, 在不破坏细胞的前提下, 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行 PCR 扩增可进行细胞内定位适用于检测病理切片中含量较少的靶序列

49 原位 PCR 的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 (ISH), 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于 10 的情况下, 该方法的敏感度就明显下降而标准的 PCR 则可扩增出细胞内单拷贝的序列, 敏感度很高, 但却未能与细胞形态学研究相结合 ISPCR 则可把这两者结合起来, 成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术利用该法可检测细胞内病毒感染细胞内基因重排以及分析细胞内 RNA 表达产物等方面发挥一定作用在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义

50 操作步骤细胞或组织的固定 PCR 扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物

51 人类染色体端粒 DNA 的荧光原位杂交照片

52 8)RT-PCR mrna 逆转录酶杂化双链 DNA 聚合酶 cdna PCR 扩增

53 基因 mrna 蛋白质多肽链

54 实时 PCR 技术原理

55 1) 基因克隆 PCR 技术的应用质粒 DNA 基因片段重组 DNA

56 Bam H I 5 5 Bam H I Bam H I Bam H I

57 质粒 DNA 目的基因限制性核酸内切酶 GGAC GTCC CAGG CCTG GTCC GGAC CAGG CCTG GTCC CAGG GGAC CCTG

58 2) 基因检测内源性病变基因 A A 正常人病人病原微生物基因正常人 (-) 病人 (+)

59 遗传病的诊断地中海贫血基因缺失插入或置换等珠蛋白链合成不平衡

60 正常人病人 A 正常病人

61 恶性肿瘤 ( 癌基因或抑癌基因 ) PCR-RFLP RFLP 法 : Ras 基因限制性内切酶

62 突变限制性内切酶

63 正常突变电泳

64 3) ) 基因鉴定女性男性 PCR Y 引物男性女性

65 谢谢! ABI Real-time PCR

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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