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甯严
7 years ago
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1 重温经典引领创新金品服务科研北京全式金生物技术有限公司

2 Easy 克隆技术快速高效 1+1 TransStart 最好的热启动技术 TransStart FastPfu 快速高保真酶 TransDirect PCR 无需纯化 gdna 的 PCR All-in-One 简单到极致的反转录 EasySee Western Blot 可视化 TransLipid 新型转染试剂 Double Luciferace 报告基因检测的生力军

3 研发指导理念原理创新, 使用便捷 Fast Easy

4 TransStart 热启动技术

5 开发思路 PCR 酶性能扩增能力 ; 特异性 ; 保真性扩增能力, 特异性方面, 热启动酶的效果最好

6 开发思路热启动方法化学封闭抗体封闭基因改造共同特点 : 封闭 DNA 聚合酶的活性中心, 常温下酶活受限, 加热后释放酶活 DNA 聚合酶活性中心不只一个, 所以无法完全封闭酶活

7 不同热启动方法比较化学封闭法 (HotStar Qiagen) 需要预加热 (10 min) 步骤, 损伤 DNA 样品, 降低酶活抗体封闭法 (Platinum IVTG) 利用 Taq 抗体 ( 来源于哺乳动物 ), 有残留 DNA 污染的潜在风险酶的催化活性域不唯一, 酶的催化活性域不唯一无法 100% 封闭酶活, 无法 100% 封闭酶活基因改造 (TransTaq-T TransTaq HiFi TransGen) 不使用抗体, 无需预加热酶的催化活性域不唯一, 改造后的酶仍然无法 100% 封闭酶活

8 开发思路反其道而行之不针对酶本身进行封闭, 而是封闭引物与模板, 让酶的活性无用武之地? 如何封闭?

9 TransStart 热启动原理双封闭法利用两种高效的蛋白, 分别与引物和模板结合, 阻断低温下引物形成二聚体以及阻断酶与模板的结合, 使引物与模板不被 DNA polymerase 所利用, 有效地封闭 DNA 的合成高效小蛋白相对模板引物过量, 封闭效率达 100% 随 PCR 变性步骤的进行, 两种蛋白失活, 释放出引物与模板参与扩增反应

10 TransStart 双封闭法原理

11 TransStart 热启动技术的应用 TransStart Taq DNA Polymerase 新型热启动酶双封闭法, 提高扩增能力, 增强扩增特异性

12 TransStart Taq 扩增能力和特异性比较 M M:Trans2K Plus DNA Marker 1:DMD1, 0.3kb 2:Numb, 0.3kb 3:P53, 0.5kb 4:P1P2, 1.2kb 左道为非热启动 Taq DNA 聚合酶右道为 TransStart Taq DNA 聚合酶

13 TransStart 热启动技术的应用 TransStart Taq DNA Polymerase TransStart TopTaq DNA Polymerase TransStart Green qpcr SuperMix TransStart Green qpcr SuperMix UDG TransStart Top Green qpcr SuperMix TransStart Probe qpcr SuperMix

14 TransStart Green qpcr SuperMix TransStart Top Green qpcr SuperMix 数据的准确使用 TransStart Taq, 增强特异性, 数据准确双阳离子配方, 减少引物二聚体的形成, 保证数据准确应用 Passive Reference Dye 或 PCR Enhancer, 保证数据准确作用调整加样误差引起的管间差异 Passive Reference Dye 的必要性 Passive Reference Dye 的特异性

15 独特双阳离子 Buffer 配方, 减少引物二聚体, 提高特异性钾离子能够稳定引物的退火, 它能和镁离子一起中和 DNA 的电荷, 从而有利于引物与模板的结合, 提高扩增的产量氨根离子能够将非特异性退火的碱基对之间的氢键去稳定化, 从而增强扩增的特异性

16 Passive Reference Dye 的校正作用 ( 必要性 ) 未校准加样误差已校准加样误差 Passive Reference Dye II,Stratagene Mx3000

17 Passive Reference Dye 的特异性不同的仪器公司, 生产各自仪器的同时, 也生产与之相配套的 qpcr SuperMix 其产品配有 Passive Reference Dye 但是不同的仪器, 所需 Passive Reference Dye 不同, 不同厂家的仪器与试剂之间, 无法实现兼容 e.g.abi 7900/7500, Reference Dye I/II 世界上没有任何一种 Passive Reference Dye, 可以适用于各个品牌的荧光定量 PCR 仪 TransGen: Reference Dye I/II/III, PCR Enhancer

18 TransStart Green qpcr SuperMix UDG 数据的准确具有 TransStart Green qpcr SuperMix 的所有特点采用 UDG 酶和 dutp 组合, 有效防止 PCR 产物的交叉污染 ( 得到的 CT 值比实际 CT 值小或其它影响 ) 原理 :dutp 取代 dttp, 扩增产物中 U 取代了 T, 如果有 PCR 产物的残留污染, 在孵育步骤时 (50 2 min),udg 酶可以消化含 U 的 PCR 产物, 而不会影响含 T 的模板, 去除污染随后的变性步骤 ( min ), 彻底失活 UDG 酶, 避免了降解新的扩增产物的可能

19 TransStart FastPfu 快速高保真酶

20 开发思路 PCR 酶性能扩增能力 ; 特异性 ; 保真性保真方面,Pfu 酶的效果较好

21 目前世界上, 保真性相对优秀的酶为 Pfu 系列多用于基因功能的研究定点突变等要求高保真的实验最主要的缺点聚合速度慢, 仅有 0.5 kb/min 以定点突变试验为例, 一般需要 5 小时以上甚至十余小时, 大大制约了实验进度扩增能力较 Taq 系列酶弱开发思路

22 保真性速度 Pfu 酶能否和 Taq 酶具有同样的扩增速度呢? 但一般认为, 合成速度的提升, 往往会以牺牲保真性为代价如何在提高聚合速度的同时还能确保保真性, 成为改造 Pfu 酶必须解决的问题

23 快速高保真酶 TransStart FastPfu FastPfu Fly 改造原理 : 对 EasyPfu 酶进行基因改造, 对酶的不同催化活性域进行突变, 在提高扩增速度与扩增效率的同时, 还提高了保真性解决了扩增速度与保真性的矛盾

24 TransStart FastPfu DNA Polymerase 快速 : Plasmid DNA: 4 kb/min, cdna Genomic DNA: 2 kb/min 速度 :FastPfu 是传统 Pfu 的 4~8 倍 ( 传统 Pfu: 0.5 kb/min) 保真性 :FastPfu 是传统 Pfu 的 3 倍

25 TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 更高的扩增效率更快的速度 FastPfu Fly: FastPfu: 更高的保真性 FastPfu Fly: FastPfu: 2~6 kb/min 2~4 kb/min 是传统 Pfu 的 6 倍是传统 Pfu 的 3 倍

26 TransStart FastPfu FastPfu Fly 与 EasyPfu 酶扩增速度比较

27 实验数据 Human cdna 模板 M M2 M1:1 Kb Plus DNA Ladder M2:Trans15K DNA Marker 1:ACTR 3.5 kb 2 hrs 14 min 2:VIN 4.6 kb 2 hrs 34 min 3:Pol 6.8 kb 3 hrs 09 min 4:APC 8.5 kb 3 hrs 41 min 5:Dynein 12.3 kb 4 hrs 48 min

28 实验数据 Human Genomic DNA 模板 M M2 M1:1 Kb Plus DNA Ladder M2:Trans15K DNA Marker 1:Rhod 2.0 kb 1 hrs 19 min 2:β-globin 3.0 kb 1 hrs 27 min 3:Rhod 4.17 kb 1 hrs 29 min 4:Factor IX 7.5 kb 3 hrs 25 min 5:serum albumin 12.4 kb 4 hrs 48 min

29 实验数据 Plasmid DNA 模板 M M2 M1:Trans15K DNA Marker M2:Trans15K DNA Marker 1:UDG 7.0 kb 1 hrs 36 min 2:LN 10.0 kb 1 hrs 55 min 3:Fang 14.7 kb 2 hrs 26 min

30 TransDirect PCR 无需纯化 gdna 的 PCR

31 开发思路大量样本的高通量检测 : 先提基因组 DNA, 然后 PCR gdna 提取, 不仅费时, 而且样品之间的污染是一个严重问题模板裂解液直接扩增? 成分复杂, 杂质很多, 含有强 PCR 抑制剂

32 开发思路有效裂解组织抗抑制能力强扩增能力强的聚合酶适合于不同材料

33 TransDirect Animal Tissue PCR Kit TransDirect Plant Tissue PCR Kit TransDirect Blood PCR Kit 针对不同组织类型的裂解液系统 2 TransDirect PCR SuperMix 核心 TransBD Taq DNA 聚合酶通过 Gene Shuffling 技术获得的第二代 Taq DNA 聚合酶具有极强的抗抑制能力使用方便裂解液 / 血液直接作为模板, 只加入引物和水, 使 SuperMix 溶液的浓度为 1 即可进行反应

34 TransDirect Plant Tissue PCR Kit

35 TransDirect Animal Tissue PCR Kit

36 M TransDirect Blood PCR Kit M M M M 人血肝素抗凝 M 人血 EDTA 抗凝人血新鲜

37 TransDirect Blood PCR Kit M M M 1 2 M M M M 1 M 鸡血柠檬酸钠抗凝鼠血肝素抗凝人培养细胞人口腔上皮细胞

38 All-in-One 让反转录简单到极致

39 常规反转录体系模板引物 dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) RI 酶

40 优化的反转录体系 SuperMix 模板引物 Rxn Mix All-in-One dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) Enzyme Mix RI 酶

41 First -Strand Synthesis Other First -Strand Synthesis Kit Trans First -Strand Synthesis SuperMix TransScript All-in-One First- Strand cdna Synthesis SuperMix RNA RNA RNA + + Primer Primer + Buffer + dntps = + 2 RT Reaction Mix = + All-in-One + RT Enzyme + = + RT/RI Enzyme Mix RNase Inhibitor

42 All-in-One 除 RNA 模板外, 所有组分预混完毕, 最大程度简化操作优化的引物 Mix:Oligo dt/random Primer, 高效反转录各类模板

43 TransScript All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for PCR(AT321) TransScript II All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for PCR (AH321) 操作简单反应快速高兼容性长链合成效率高

44 TransScript All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AT341) TransScript II All-in-One First-Strand cdna Synthesis SuperMix for qpcr(one-step gdna Removal) (AH341) 操作简单反应快速高兼容性短链合成效率高 RT 同步去除 gdna

45 DNA 去除与 RT 同时进行材料 ( 培养细胞组织等 ) 模板制备 (RNA 提取 ) DNA 去除 /RT RNA cdna DNase I 处理 RNA (genomic DNAMinus) 反转录 cdna 合成步骤 /DNA 去除步骤同时进行 RTas e 失活 / DNase I 失活同时进行

47 No gdna Remover gdna Remover 值Ct D-1ul D-2ul D-4ul D-8ul R-1ul R-2ul R-4ul R-8ul DR-1ul DR-2ul DR-4ul DR-8ul 20 ng/μl gdna 100 ng/μl RNA 20 ng/μl gdna+100 ng/μl RNA TransScript TM One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix 通过 qpcr 观察作用效果

48 常规反转录条件变性 65~70 5 min 失活 min Add RNA Primer 退火 min 随机引物延伸 37~42 50 min 1.5 h 冰浴 2 min Add dntps Buffer RI RTas e 结束

49 All-in-One for PCR 失活 85 5 min 延伸 42~55 30 min 35 min Add All-in-one RNA H 2 O only! 结束

50 All-in-One for qpcr 失活 85 5 sec 延伸 42~55 15 min 15 min Add All-in-one RNA (gdna Remover) H 2 O only! 结束

51 EasySee Western Blot 可视化

52 开发思路 Western Blot 后, 需将 X 光片与 NC 膜或 PVDF 膜比对, 确认 Marker 与样品相对位置, 操作繁琐且不准确开发可以直接曝光的 Marker, 在一张 X 光片上同时看到 Marker 与样品, 实现 Western Blot 可视化

53 发光原理利用能与抗体结合的蛋白质作为 Marker 的发光条带 Marker 的广泛适用性 : 能够与不同的二抗结合, 应用于不同的 Western Blot 实验

54 发光原理条带含有 IgG IgM 结合位点, 本身即相当于一抗, 直接与二抗结合广泛适用于各种抗体, 满足广大客户需求可与目的蛋白条带同时结合抗体用同样标记抗体来检测

55 EasySee Western Marker

56 EasySee II Western Marker

57 TransLipid 高效低毒的新型阳离子脂质体转染试剂

58 阳离子脂质体转染试剂目前应用最为普遍的转染试剂,Invitrogen 公司的 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(LF2K) 是其代表双层膜结构的脂双分子层, 表面带正电荷, 可通过静电作用将 DNA 分子包裹入内也能被表面带负电的细胞膜吸附, 通过融合或内吞作用将 DNA 传递入细胞

59 开发思路无论是与 DNA 分子的结合, 还是与细胞膜的相互作用, 都依赖于正负电荷的相互作用开发思路改变脂质体表面的电荷状态

60 改造原理通过化学修饰, 改变脂质体表面的电荷状态, 从而提高脂质体对核酸的装载效率通过化学修饰, 改变脂质体表面的电荷状态, 增强脂质体对细胞膜的亲和性通过化学修饰, 调节脂膜的流动性, 降低脂膜的通透性, 增加了脂质体在体外的稳定性

61 实验数据 LF2K 1:2.5 ( 推荐比例 ) 1:1.25 1:2.5 1:5 1:1.25 1:2.5 1:5 HEK 293T, different DNA/Translipid Ratio

62 实验数据 HeLa,different time

63 实验数据 Control: LF2K TransLipid HEK 293T

64 TransLipid 已成功转染的细胞种类 ( 请登陆细胞转染的实验细节 Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, sirna, and high-throughput application. Methods 33 (2004)

65 Double Luciferase 荧光素酶报告基因系统

66 开发思路传统报告基因 ( 如 β-gal,cat,gfp 等 ) 检测方法虽然应用广泛, 但是在灵敏度线性范围有无内源活性干扰以及操作难易程度等方面, 却存在着很大局限性荧光素酶报告基因系统可以很好地避免以上限制因素

67 荧光素酶报告基因萤火虫荧光素酶报告基因 (Firefly Luciferase) 海肾荧光素酶报告基因 (Renilla Luciferase)

68 荧光素酶的生物发光原理 562 nm 480 nm 生物发光与荧光蛋白发光的区别 : 是否需要激发光源更加灵敏, 动力学范围更广

69 荧光素酶作为报告基因的优势背景低, 哺乳动物细胞中无内源表达活性操作简便, 检测迅速, 所有操作半小时内完成灵敏度高, 可检测低至 ~10 20 摩尔荧光素酶分子, 适合弱启动子低水平表达调控基因的检测检测范围广, 线性范围达 10 7 数量级

70 Double Luciferase 是双报告系统的上佳之选为什么要使用双报告基因系统实验结果受多种因素的影响不同处理间细胞状态与数目的差异不同处理间转染效率的差异不同处理间细胞裂解效率的差异为消除系统误差, 需要对不同处理样品的结果进行归一化处理双报告系统中, 以一个报告基因作为系统内参归一化反应 = 萤火虫荧光素酶活性海肾荧光素酶活性

71 双荧光素酶报告基因系统的优势传统双报告基因系统, 以 β-gal CAT GUS Luc 等混搭, 灵敏度不同, 检测方法不同, 需要分别检测, 费时费力双荧光素酶报告系统, 两种荧光素酶检测方法相同, 采用同一种裂解液在同一个试管中即可完成两种酶活性的检测, 省时省力, 灵敏度高, 检测范围广

72 荧光素酶报告基因的检测流程第一步 : 细胞裂解移除培养基, 用 1 PBS 润洗加入 1 Cell Lysis Buffer 转移至 EP 管中, 离心收集上清

73 萤火虫荧光素酶底物第二步 : 荧光素酶活性检测单荧光素酶报告基因检测 Single-Luciferase Reporter Assay Kit 海肾荧光素酶底物 -- 在淬灭上一个荧光反应的同时, 启动下一个荧光反应双荧光素酶报告基因检测 Double-Luciferase Reporter Assay Kit

74 应用领域研究基因转录调控元件 ( 如启动子 / 增强子 ) 研究信号转导通路 ( 如 p53, NF-kB 通路 ) 研究 mirna 的靶标 (3 -UTR) 研究蛋白对 RNA 的降解作用 ( 如抗病毒蛋白降解病毒 RNA) 研究蛋白 - 蛋白相互作用 ( 快速灵敏定性定量 ) 药物筛选 ( 特异靶点, 高灵敏性, 高通量筛选 )

75 实验数据

76 谢谢! 北京全式金生物技术有限公司

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PowerPoint Presentation 魅力 PCR 酶与缓冲液的珠联璧合北京全式金生物技术有限公司上篇下篇 PCR 历史与原理反应体系与条件的优化 PCR 酶分类特殊要求的 PCR PCR 酶性能常见问题与对策 PCR 历史与原理 PCR 与 Mullis 1972 年 U.C. Berkeley 博士学位 1979 年进入 Cetus 公司 1983 年顿悟 PCR 原理 1986 年 6 月首次将 Taq 酶应用于