PCR失败原因分析

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蟹矫童
7 years ago
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1 一模板质量问题 : PCR 失败原因分析 1. 模板提取不完整, 其中不含你的目的基因, 或目的基因含量太低可以跑个电泳看看提取的 DNA,PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别如果确定是这种问题, 可以增加模板量试试, 但不一定行得通 2. 模板里面残留某种试剂成份, 可能抑制 Taq 聚合酶的活性, 如果是这种情况, 可以用试剂盒把模板再纯化一下, 或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量 3. 为什么跑电泳会出现拖带呢? 1 有可能的因为你的电压调的太高了电泳跟很多因素有关, 其中就有一个是电压, 在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率, 但是要是超到一个临界值反而有害你可以适当的调低点看看 2 有时候发现上样量太多的话会有拖带你看能否回收之后, 按 1:50 或 1:100 等稀释后, 再当成模板扩一次怎么样二引物问题 1. 样品自身的基因型差异导致扩增失败也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好, 而和另一些基因型结合不好可以换一对更保守的引物试试祝顺利! 2. 普通 PCR 所用的一对引物中有一个引物加多了, 为正常的三倍只要引物特异性比较好, 那么不会产生大的影响如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话, 也许会扩出来非特异带在制备单链探针时候就采取这样的不对称 pcr, 没关系的三 Taq 酶处于失活状态因为活性降低了能出现二聚体 1.1 假阴性, 不出现扩增条带可能原因 : (1) 模板 :1 模板中含有杂蛋白质 ;2 模板中含有 Taq 酶抑制剂 ;3 模板中蛋白质没有消化除净, 特别是染色体中的组蛋白 ;4 在提取制备模板时丢失过多, 或吸入酚, 模板本身拷贝数低 ;5 模板核酸变性不彻底对策 : 纯化模板 ; 配制有效而稳定的消化处理液, 其程序亦应固定不宜随意更改 ; 如果怀疑污染了抑制剂, 可以使用乙醇沉淀 DNA (2) 酶失活

2 对策 : 需更换新酶, 或新旧两种酶同时使用, 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭 (3) 引物 : 引物质量引物的浓度两条引物的浓度是否对称, 是 PCR 失败或扩增条带不理想容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题, 两条引物一条浓度高, 一条浓度低, 造成低效率的不对称扩增, 对策 :1 选定一个好的引物合成单位 ;2 引物的浓度不仅要看 OD 值, 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳, 一定要有引物条带出现, 而且两引物带的亮度应大体一致, 如一条引物有条带, 一条引物无条带, 此时做 PCR 有可能失败, 应和引物合成单位协商解决如一条引物亮度高, 一条亮度低, 在稀释引物时要平衡其浓度 ;3 引物应高浓度小量分装保存, 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质降解失效 ;4 引物设计不合理, 如引物长度不够引物之间形成二聚体等, 需重新设计引物 (4)Mg2+ 浓度 :Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大, 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性, 浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带对策 : 调整 Mg2+ 浓度, 从 1mM 到 3mM, 间隔 0.5mM 进行一系列反应, 确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度注意 : 对实时定量 PCR, 使用 3mM 到 5mM 的镁离子浓度 (5) 反应体积的改变 : 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 30ul 50ul 或 100ul, 应用多大体积进行 PCR 扩增, 是根据科研和临床检测不同目的而设定, 在做小体积如 20ul 后, 再做大体积时, 一定要摸索条件, 否则容易失败 (6) 物理原因 : 变性对 PCR 扩增来说相当重要, 如变性温度低, 变性时间短, 极有可能出现假阴性 ; 退火温度过低, 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率对策 : 优化 PCR 温度, 有时还有必要用标准的温度计, 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性退火和延伸温度 (7) 靶序列变异 : 如靶序列发生突变或缺失, 影响引物与模板特异性结合, 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列, 其 PCR 扩增是不会成功的 1.2 假阳性 : 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致, 有时其条带更整齐, 亮度更高可能原因 : (1) 引物设计不合适 : 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行 PCR 扩增时, 扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短, 容易出现假阳性对策 : 需重新设计引物

3 (2) 靶序列或扩增产物的交叉污染 : 这种污染有两种原因 : 一是整个基因组或大片段的交叉污染, 导致假阳性对策 :1 操作时应小心轻柔, 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 2 除酶及不能耐高温的物质外, 所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用 3 必要时, 在加标本前, 反应管和试剂用紫外线照射, 以破坏存在的核酸二是空气中的小片段核酸污染, 这些小片段比靶序列短, 但有一定的同源性可互相拼接, 与引物互补后, 可扩增出 PCR 产物, 而导致假阳性的产生对策 : 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除 1.3 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致, 或大或小, 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带非特异性条带的出现, 其原因 : (1) 引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体 (2)Mg2+ 离子浓度过高退火温度过低, 及 PCR 循环次数过多有关 (3) 酶的质和量, 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现, 酶量过多有时也会出现非特异性扩增对策 :1 必要时重新设计引物 2 减低酶量或调换另一来源的酶 3 降低引物量, 适当增加模板量, 减少循环次数 4 适当提高退火温度或采用二温度点法 (93 变性,65 左右退火与延伸 ) 5 降低 Mg2+ 浓度 1.4 出现片状拖带或涂抹带可能原因 : 酶量过多或酶的质量差,dNTP 浓度过高,Mg2+ 浓度过高, 退火温度过低, 循环次数过多对策 :1 减少酶量, 或调换另一来源的酶 2 减少 dntp 的浓度 3 适当降低 Mg2+ 浓度 4 增加模板量, 减少循环次数 tap 酶种类高特异性 Taq 酶高度特异性地扩增所需的片段是 PCR 最基本的要求, 影响 PCR 特异性的因素很多, 包括模板引物性质及质量反应条件的控制等等, 而高特异性 Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程, 也为 PCR 产物快速有效的纯化 (PCR 产物直接纯化 ) 打下了基础这类酶最典型的代表是热启动 Taq 酶大家都知道, 在 PCR 第一个循环变性之前, 有一个升温的过程, 引物和模板会有一些非特异性配对, 如果这时 Taq 酶发挥活性, 就很容易产生非特异性扩增, 由于循环初期模板量非常少, 产生的非特异性条带经过后面的指数扩增, 就

4 会严重干扰目的片段的扩增, 甚至导致特异性条带不能扩出而热启动 Taq 酶是必需经过高温才能激活的酶, 因此在初始循环的变性之前它没有活性, 不会产生非特异性扩增, 这就大大提高了 PCR 扩增的特异性第一代热启动 Taq 酶往往直接在 Taq 酶上做一些修饰, 比如用抗体抑制, 蜡封等, 如 Clontech Stratagen Gibcol-LTI 的一些产品, 由于抗体蜡等异物的掺入, 对实验造成一定的影响, 也给试验者带来一些不便新一代的热启动 Taq 酶是通过内部改造的重组酶, 真正实现便利的热启动, 代表产品如 QIAGEN 公司的 HotStar 系列, 无需别的辅助抑制物, 也不用担心抑制不稳定, 使用起来方便高效此外, 由于几乎所有的 Taq 酶产品都带有相应的反应缓冲液, 缓冲液的品质也对保证 Taq 酶特异性扩增起着不可忽视的作用, 一般的缓冲液中调节 H 键作用的盐只有 KCl,QIAGEN 公司的缓冲体系通过 KCl (NH4)SO4 盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性此外, 热启动的 Taq 酶也是实现一步法 RT-PCR 的基础如 QIAGEN 公司的 OneStep RT-PCR 试剂盒, 在 RT 反应较低温度下,Taq 酶没有活性, 逆转录酶发挥活性 ;RT 反应结束, 高温灭活逆转录酶的同时, 激活 Taq 酶, 进行 PCR 反应另一家公司 Epicentre 有一种 MasterAmpTM Tth DNA 聚合酶, 本身就具有逆转录酶活性, 也可用作 RT-PCR 高保真 Taq 酶下游应用为基因筛选测序突变检测, 分子诊断等等的用户, 往往对 PCR 保真性要求很高, 保真性的一个通用标准是错配率, 错配率越低保真性越好普通 Taq 酶的错配率在 2-5X10-5 碱基 / 循环数, 而高保真 Taq 酶错配率可达 10-6 数量级, 大大降低了出错的可能其原理主要是因为高保真 Taq 酶具有 3' 到 5' 核酸外切酶 (Proofreading) 的活性, 扩增途中如果产生了错配的碱基, 它可以将其切掉, 从而保证了扩增的准确性需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能, 往往扩增效率低一些, 有的还容易降解引物, 且产物一般不宜用 TA 或 UA 克隆法克隆目前市面上主要有两类产品, 一类是混合型的高保真酶, 将带有 Proofreading 活性的酶与普通 Taq 酶 ( 用于提高扩增效率 ) 混合起来, 错配率在 8-9 X10-6 碱基 / 循环数 Clontech LTI 等公司都有此类产品如果要求更高的保真度, 就要选择单一型的高保真酶, 如 Stratagene 的 Pfu,NEB 公司的 Vent DNA 聚合酶, 错配率 5.7 X10-5 碱基 / 循环数 ;QIAGEN 公司新推出的 ProofStart DNA 聚合酶, 兼特异性与保真性于一体, 其聚合酶及 Proofreading 活性都为热启动, 可避免引物降解, 错配率达碱基 / 循环数, 加上优化的反应体系, 可在室温下配置反应液, 可进行复杂模板 ( 高 GC 含量二级结构 ) 及长片段的扩增, 的确是这类酶中的佼佼者高耐热性 Taq 酶

5 对于有些模板变性温度较高, 需要时间较长的用户, 可能要求高耐热性 Taq 酶, 这里介绍 NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA 聚合酶系列, 两者都是从海底火山口分离出来后克隆的, 是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上, 前者在 95 半衰期近 7 小时,100 近 2 小时 ; 后者更甚, 分别为 23 小时和 8 小时超长片段扩增 Taq 酶对于作基因组图谱测序及分子遗传学研究的用户, 可能会用到超长片段的扩增, Clontech 公司的 Advantage Genomic 系列混有 Tth DNA 聚合酶,Proofreading 酶和热启动抗体, 对复杂模板可扩增 10kb 片段, 简单模板可达 40kb 关于复杂模板的扩增对于模板结构复杂, 如 GC 含量高 (>60%), 有二级结构等, 普通的 Taq 酶可能难以延伸下去, 加入 DMSO 等助熔剂可帮助扩增顺利进行, 但 DMSO 有毒, 而且用量需要优化 QIAGEN 公司的任何一种 Taq 酶都附有特制的 Q- 溶液, 操作方便安全, 对复杂模板的扩增特别有效关于条件的优化现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液, 如 QIAGEN 公司的缓冲体系, 对温度和 Mg2+ 的耐受性很强, 随试剂盒有推荐的操作手册, 大大减少了反应条件的优化, 如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物, 一次成功率极高但任何东西都不是万能的, 如果碰到比较特殊的情况, 还需要仔细分析, 优化调整以上就 Taq 酶的一些基本分类分别进行了介绍, 具体选购时要根据实验需要择其重点, 再参照其他参数, 才能选到最合适的 Taq 酶我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家, 希望能帮助大家更快更好的达到实验目的四五六模板浓度过低退火温度过高有可能, 可以做个梯度 PCR 试一下循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够这个可能性不大七 dntp 浓度低时 PCR 产率及特异性均增高, 适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素当 100μl PCR 液中含 dntp 各 40μmol/L 时就足以合成 2.6μg 的 DNA(dNTP 消耗一半 ), 所以, 你不小心多加了 4 倍的量, 会很影响 PCR 结果, 即 Taq 酶活力要降低 20~30%, 即底物抑制八 PCR 产物电泳

6 1. 电泳图不清晰, 可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试 marker 都出问题说明是你的胶的问题, 或者电泳操作的问题 2. PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于酶量过多或酶的质量差, dntp 浓度过高,Mg2+ 浓度过高, 退火温度过低, 循环次数过多引起如下图 : 其对策有 : 1 减少酶量, 或调换另一来源的酶 2 减少 dntp 的浓度 3 适当降低 Mg2+ 浓度 4 增加模板量, 减少循环次数 3. 如何获得亮的电泳条带 PCR 反应前 5 个循环可以降低退火温度 5, 后面个循环恢复正常退火温度也可以以第一次 PCR 的产物作为二次 PCR 的模板

Microsoft Word - PCR常见问题总汇

Microsoft Word - PCR常见问题总汇 PCR 常见问题总汇 PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内, 有些最好于当日电泳检测, 大于 48h 后带型不规则甚致消失假阴性, 不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有 1 模板核酸的制备,2 引物的质量与特异性,3 酶的质量及, 4 PCR 循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究模板 :1 模板中含有杂蛋白质,2 模板中含有 Taq 酶抑制剂,3 模板中蛋白质没有消化除净,