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VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina ND604 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 6.1

目录 Contents 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 02 05/ 自备材料... 03 06/ 注意事项... 03 06-1/ 关于 Input DNA 和 Fragmentation...... 03 06-2/ 关于 Adapter... 04 06-3/ 关于 Adapter Ligation 产物纯化... 04 06-4/ 关于磁珠的使用... 05 06-5/ 关于长度分选... 06 06-6/ 关于 Library Amplification... 06 06-7/ 关于文库的质量控制... 07 06-8/ 其他注意事项... 08 07/ 实验原理与流程概要... 09 08/ 标准实验方案... 11 附一 双轮磁珠分选... 14 附二 cfdna 建库方案... 16 附三 FFPE DNA 建库方案... 17 附四 靶向捕获建库方案...18 1

01/ 产品概述 VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 是针对 Illumina 高通量测序平台定向优化而成的文库构建试剂盒 本试剂盒可以将 100 pg - 1 μg Input DNA 转换成 Illumina 高通量测序平台专用文库 作为全新的升级版本,VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 通过合并多个步骤显著缩短了建库耗时, 单个文库的构建时间最短仅需 75 min, 具有流程更简捷 文库转化率更高 样本兼容性更广等诸多优势, 广泛适用于多种样本的 PCR 或 PCR-Free 文库构建, 且兼容靶向捕获流程 试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性 02/ 产品组分 组分 ND604-01 (24 rxn) ND604-02 (96 rxn) ND604-03 (24 rxn) ND604-04 (96 rxn) End Prep Mix 2 Rapid Ligation Buffer Rapid DNA Ligase PCR Primer Mix Amplification Mix 2 Control DNA (264 bp,50 ng/ul) 360 μl 600 μl 1 μl 1 μl 600 μl 10 μl 4 360 μl 4 600 μl 480 μl 480 μl 4 600 μl 10 μl 360 μl 600 μl 1 μl --- --- 10 μl 4 360 μl 4 600 μl 480 μl --- --- 10 μl 03/ 保存条件 所有组分于 - 保存 04/ 适用范围 适用于制备 Illumina 高通量测序平台专用文库 兼容多种样本类型 : 基因组 DNA (Genomic DNA) 游离 DNA (cfdna ctdna) 石蜡切片 DNA (FFPE DNA) 免疫共沉淀 DNA (ChIP DNA) 多重扩增子 (Amplicons) 等 对于简单基因组 (Small Genome) 游离 DNA (cfdna ctdna) 免疫共沉淀 DNA (ChIP DNA) 多重扩增子(Amplicons) 等复杂程度较低的样本,Input DNA 量最低可至 100 pg 推荐应用于 : 全基因组测序 全外显子或其他靶向捕获测序 ( 配合 Roche NimbleGen SeqCap EZ Agilent SureSelect Illumina TruSeq or IDT xgen Lockdown Probes 或其他杂交捕获系统 ) 扩增子测序 免疫共沉淀测序 宏基因组测序 甲基化测序 ( 配合 Phanta UC Super-Fidelity DNA Polymerase for Library Amplification, Vazyme #P507) 2

05/ 自备材料 纯化磁珠 :VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 或其他等效产品 ; DNA 质控 :Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或其他等效产品 ; DNA Adapter: VAHTS TM DNA Adapters for Illumina (Vazyme #N801/N802 或 N805/N806/N807/N808) 或其他等效产品 ; #N801/N802 为 24 种单端 6 bp Indexed Adapters, 各 12 种 ; #N805/N806/N807/N808 为 96 种单端 8 bp Indexed Adapters, 各 24 种 其他材料 : 无水乙醇 灭菌超纯水 0.1 TE 洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0-8.5); 低吸附 EP 管 PCR 管 磁力架 PCR 仪等 06/ 注意事项 受样本 方案 设备 操作等诸多因素影响, 文库构建流程参数可能需要根据实际情况进行 调整 为了能够获得高质量的测序文库, 请务必仔细阅读下述注意事项 使用过程中如遇任何问题, 可联系 Vazyme 技术支持获取帮助 :support@vazyme.com 06-1/ 关于 Input DNA 和 Fragmentation 试剂盒兼容的 Input DNA 量范围为 100 pg - 1 μg 应尽可能使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高质量 Input DNA Table 1 中列举了常见应用中推荐的 Input DNA 量 Table 1. 常见应用中推荐 Input DNA 量 应用 样本类型 推荐 Input DNA 量 全基因组测序 复杂基因组 50 ng - 1 μg 靶向捕获测序 复杂基因组 10 ng - 1 μg 全基因组 / 靶向捕获测序 FFPE DNA 50 ng 全基因组 / 靶向捕获测序 cfdna/ctdna 100 pg 全基因组测序 微生物基因组 1 ng - 1 μg 全基因组测序 (PCR-Free 文库 ) 复杂 / 简单基因组 50 ng ( 不进行长度分选 ) 0 ng ( 进行长度分选 ) 免疫共沉淀测序 ChIP DNA 100 pg 靶向测序 扩增子 100 pg 上表为使用高质量 DNA 时推荐的 Input DNA 量, 当 Input DNA 质量较差时, 应适当上调使用量 Input DNA 特指投入 End Preparation 步骤中的 DNA 如 DNA 样品在 Fragmentation 后进行 过纯化或长度分选, 需再次测定其浓度, 不能直接以 Fragmentation 之前的 DNA 量作为 Input DNA 量 否则, 可能会因文库扩增循环数不足导致文库产出偏低 若 Input DNA 制备过程中带入高浓度金属离子螯合剂或其他盐, 可能会影响 End Preparation 步骤的效率 当使用机械法进行 Fragmentation 且产物不进行纯化或长度分选直接建库时, 请将 DNA 稀释在 0.1 TE 中进行 Fragmentation, 请勿在灭菌超纯水中进行 ; 当使用酶切法进行 Fragmentation 且产物不进行纯化或长度分选直接建库时, 请确认 Stop Buffer 中不包含过量的金属离子螯合剂 如条件不满足, 可先将 Fragmentation 产物纯化或长度分选后溶于 0.1 TE 或灭菌超纯水中 ( 50 μl), 再进行文库构建 3

06-2/ 关于 Adapter 针对 Illumina 测序平台,Vazyme 提供两套 Indexed Adapters, 可根据需 Pooling 的样本数量选择 : #N801/N802, 提供 24 种单端 6 bp Indexed Adapters, 各 12 种 ; #N805/N806/N807/N808, 提供 96 种单端 8 bp Indexed Adapters, 各 24 种 同时,VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 也可以兼容诸如 Illumina TruSeq Roche NimbleGen SeqCap EZ Agilent SureSelect 等常规应用体系中使用到的各种 Non-indexed 单端 Indexed 及双端 Indexed Adapters 您也可以自行合成或从别的途径购买类似的 TA-ligation Adapters 应用于 Illumina 或其他测序平台 Adapter 的质量和用量直接影响建库效率和文库的质量 推荐 Adapter:Input DNA 摩尔比在 10:1-0:1 之间 Adapter 投入量过高可能会导致 Adapter 或 Adapter Dimer 残留 ; 投入量不足又会影响连接效率进而导致文库产出降低 Table 2 列举了不同 Input DNA 量推荐的 Adapter 使用量 Input DNA 500 ng - 1 μg 100 ng - 500 ng 25 ng - 100 ng 5 ng - 25 ng 100 pg - 5 ng Table 2. 100 pg - 1 μg Input DNA 推荐的 Adapter 使用浓度 Adapter:Input DNA 摩尔比 10:1 - :1 :1-100:1 50:1-0:1 40:1-0:1 60:1-3000:1 其他来源 Adapter 工作浓度 10 μm 10 μm 5 μm 1 μm 0.3 μm Vazyme Adapter 预稀释倍数不稀释不稀释 1:2 1:10 1:30 Input DNA 摩尔数可根据下述公式粗略计算 : Input DNA 摩尔数 (pmol) Input DNA 质量 (ng)/ [0.66 Input DNA 平均长度 (bp)] 推荐根据表中的浓度值或 Vazyme Adapter 的稀释倍数使用 0.1 TE 预先稀释 Adapter, 这样可以保证建库过程中 Adapter 的使用体积为固定数值 (5 μl), 避免加样体积错误 Adapter 的质量会直接影响 Adapter 与 Input DNA 的摩尔比, 进而影响连接效率和文库产出 应选用优质的 Adapter; 使用 0.1 TE 稀释和保存 Adapter 溶液 ; 尽量避免反复冻融 提高 Adapter 的使用量可以在一定程度上提高文库产出, 尤其当 Input DNA 25 ng 时 当需要优化建库效率时, 可在上表推荐条件下额外尝试几个更高的 Adapter 使用量 ( 推荐 2-10 倍范围内 ) 如 Adapter 原液浓度限制无法提高使用量, 可通过提高 Adapter 使用体积来尝试 如 : 默认 Adapter 使用体积为 5 μl, 当 Input DNA 为 500 ng - 1 μg 时可提高 Vazyme Adapter 使用量至 10 μl 以增加 5-15% 的文库产出 06-3/ 关于 Adapter Ligation 产物纯化 Adapter Ligation 产物需先去除过剩的 Adapter, 再进行后续文库扩增 (PCR 文库 ) 或直接上机测序 (PCR-Free 文库 ) 默认纯化条件 0.8 ( 产物 100 μl, 磁珠 80 μl) 适用于绝大多数情况 如需获得 Insert Size 更长的文库, 可通过适当降低磁珠使用量以减少小片段文库的含量, 但这种调整只能粗略改变文库主峰的位置, 如需要准确控制文库长度分布, 可在此步纯化之后进行长度分选 如之后进行文库长度分选, 推荐洗脱体积为 105 μl; 否则, 推荐洗脱体积为 22.5 μl 4

如数据显示纯化产物中 Adapter 或 Adapter Dimer 污染严重, 可对其再进行一次磁珠纯化 : 使用灭菌超纯水将第一次纯化产物体积补至 50 μl, 加入 50 μl 磁珠 (1 ) 进行第二次纯化 这样可以显著降低 Adapter 或 Adapter Dimer 的残留水平, 尤其是当构建 PCR-Free 文库时 有时可能还需要配合 Adapter 的使用量降低才能完全消除 Adapter 或 Adapter Dimer 的残留 06-4/ 关于磁珠的使用 试剂盒推荐使用 VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 或 Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter ) 进行磁珠纯化 注意 : 如使用其他来源磁珠, 纯化条件可能需要更改! 磁珠操作通用注意事项 : 磁珠使用量常用乘数 进行标识, 表示相对于原始样品体积而言使用多少倍体积的磁珠 如样品原始体积为 100 μl,1 纯化时磁珠使用体积为 1 100 μl = 100 μl; 0.6 / 0.2 分选时第一轮磁珠用量为 0.6 100 μl = 60 μl, 第二轮磁珠用量 0.2 100 μl = μl 磁珠使用量直接影响可纯化的 DNA 长度下限 乘数越高, 可纯化的 DNA 长度下限越短 ; 反之, 则越长 例如 :1 磁珠只能高效纯化长于 250 bp 的 DNA, 更短的 DNA 会在纯化过程中大量丢失 ; 提高至 1.8 后,150 bp 的 DNA 也可进行高效纯化 磁珠使用前应先平衡至室温 ( 室温放置 30 min), 否则会导致得率下降 分选效果不佳 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀 样品与磁珠充分混匀后置于磁力架上进行分离时, 请于溶液彻底澄清后再吸取上清, 吸取上清时应余留 2-3 μl 若不慎吸到磁珠, 会造成得率下降 分选效果不佳甚至影响后续酶反应 此时可将磁珠混匀重新置于磁力架上再次分离即可 由于磁力架吸力不同等原因, 默认分离时间有时可能需要延长, 以彻底分离磁珠和液体 磁珠漂洗应使用新鲜配制并平衡至室温的 80% 乙醇 漂洗过程中 EP 管应始终置于磁力架中, 请勿扰动磁珠 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥 干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应 ; 过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率 通常情况下, 室温干燥 5-10 min 足以让磁珠充分干燥, 请勿加热干燥 ( 如置于 37 烘箱干燥 ) 通常情况下, 推荐使用洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0-8.5) 进行产物洗脱, 这样更有利于产物的稳定保存 然而, 当后续需对文库进行靶向捕获时, 为了利于捕获前文库干燥浓缩且避免对后续捕获反应产生影响, 应使用灭菌超纯水进行产物洗脱 洗脱产物可于 4 稳定保存一周 ; 长期保存时应置于 -, 避免不必要的反复冻融 5

06-5/ 关于长度分选 如 Input DNA 分布范围较宽, 建库过程中通常需要进行长度分选以控制最终文库长度分布范围 推荐使用双轮磁珠分选方案, 也可通过切胶纯化的方式进行分选 长度分选执行位置有多种选择, 可置于 End Preparation 之前 Adapter Ligation 之后或 Library Amplification 之后 标准实验方案中不包含长度分选步骤 如需进行, 请参考附一 双轮磁珠分选 进行长度分选,DNA 损失量约为 60% - 95% 有时需要在文库长度分布( 进行长度分选 ) 和文库复杂度 ( 不进行长度分选 ) 之间进行选择 当 Input DNA 量较低时, 应保证长度分选执行位置的唯一性, 进行两次或者两次以上的长度分选会导致文库复杂度和产出严重下降! 过度扩增的文库进行长度分布检测时, 常见高分子量位置出现拖带或尾峰 对应产物多为非互补链交叉退火产物 ( 参考 06-6/ 关于 Library Amplification) 推荐解决方案为调整扩增循环数, 避免过度扩增, 不建议通过长度分选去除拖带或尾峰 Rapid Ligation Buffer 中包含的高浓度 PEG6000 会对双轮磁珠分选和切胶纯化产生显著影响 因此, 如在 Adapter Ligation 之后进行长度分选,Adapter Ligation 产物纯化步骤 (08/ 标准方案 / 步骤二 /6. 使用 VAHTS DNA Clean Beads 对反应产物进行纯化 ) 必须进行, 不能省略! 将纯化产物洗脱至合适体积的洗脱液中, 再进行双轮磁珠分选或切胶纯化 ; 如在 End Preparation 之前或 Library Amplification 之后进行长度分选, 可将原处纯化步骤直接替换为双轮磁珠分选或切胶纯化 06-6/ 关于 Library Amplification PCR Primer Mix 适用于扩增含完整长度 Adapter 的 Illumina 高通量测序平台文库 非完整长度 Adapter 或者其他平台文库需自行更换扩增引物, 推荐每条引物的扩增终浓度为 0.5-4 μm PCR 反应后期, 引物通常会先于 dntp 被耗尽 此时, 过多的循环会造成扩增产物解链后进行非特异性退火, 产生非互补链交叉退火产物 这些产物在依赖电泳的检测方式中迁移速率比较慢, 在高分子量区域呈现弥散分布 它们是由正确长度的单链文库构成, 在变性后能够与 Flow Cell 正常结合并被测序 因此, 其存在与否对测序而言并无显著影响 然而, 这种产物的存在对于文库定量方式的选择会产生决定性影响 因产物不是完整的双链结构, 当使用基于识别双链 DNA 的荧光染料 (Qubit 等 ) 来进行文库定量时, 定量结果会比实际值偏低 ; 但基于 qpcr 的文库定量体系 ( 如 VAHTS TM Library Quantification Kit for Illumina,Vazyme #NQ101 - NQ104) 在定量过程中包含变性过程, 仍然可以准确定量这种过度扩增的文库 Library Amplification 步骤需要严格控制扩增循环数 循环数不足, 会导致文库产出不足 ; 循环数过多, 又会导致过度扩增 偏好性增加 重复度增加 嵌合产物增加 扩增突变积累等多种不良后果 Table 3 列举了当使用 100 pg - 1 μg 高质量 Input DNA 时, 获得 100 ng 或 1 μg 文库推荐的扩增循环数 6

Input DNA (Into End Preparation) 100 pg 1 ng 5 ng 10 ng 50 ng 100 ng 250 ng 500 ng 1 μg Table 3. 100 pg - 1 μg Input DNA 扩增循环数推荐表 Number of cycles required to generate 100 ng 1 μg 15-17 9-11 7-9 6-8 4-6 2-4 1-3 0 0 --- 14-15 12-14 10-12 8-10 7-9 5-7 4-6 3-5 上表为使用 ~ 0 bp 高质量 Input DNA 时测得的循环数参数 当 DNA 质量较差 文库长度较长时, 需适当提高循环数以获取足量文库 若建库过程中进行过长度分选, 则参照较高循环数进行 Library Amplification; 否则, 参照较低循 环数即可 当 Adapter Ligation 步骤中使用其他来源的非完整长度 Adapter 时, 须至少扩增 2 个循环以补全文库 末端 Adapter 序列 当 Adapter Ligation 时使用完整长度的 Adapter ( 如 Vazyme #N801/N802 或 #N805/N806/ N807/N808), 且文库产出能够满足应用需要, 可不进行 Library Amplification 步骤, 从而 获得 PCR-Free 文库 06-7/ 关于文库的质量控制通常情况下, 构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价 文库长度分布检测 : 文库长度分布可通过 LabChip GX GXII GX Touch (PerkinElmer);Bioanalyzer Tapestation (Agilent Technologies);Fragment Analyzer (Advanced Analytical) 等基于电泳分离原理的设备进行检测 VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 建库过程中各步骤产物的长度分布检测如下图所示 最终文库 ( 不进行长度分选 ) Input DNA 最终文库 (Adapter Ligation 后长度分选 ) Adapter Ligation 产物 VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 建库过程 中各步骤产物的长度分布检测 7

常规适用于 Illumina 平台的 Adapter 均为 Y 型 Adapter, 末端存在单链分叉区域 因此, Adapter Ligation 之后未经扩增的 PCR-Free 文库两端都存在单链分叉区域 当进行文库长度分布检测时, 这种单链的分叉结构会造成文库迁移速率变慢, 进而导致检测结果偏长 分布范围变宽 峰型异常等问题 为了准确检测文库长度分布, 可取少量 PCR-Free 文库进行适度 PCR 扩增, 取扩增产物进行检测以反映 PCR-Free 文库的长度分布情况 也可通过检测 VAHTS TM Library Quantification Kit for Illumina (Vazyme #NQ101 - NQ104) 扩增产物来反映 PCR-Free 文库的长度分布情况 文库浓度检测 : 常用文库浓度检测方法有两种 : 基于双链 DNA 荧光染料的方法, 如 Qubit PicoGreen 等 ; 基于 qpcr 绝对定量的方法, 如 VAHTS TM Library Quantification Kit for Illumina (Vazyme #NQ101 - NQ104) 虽然前者简单易行, 但介于下述原因, 推荐使用基于 qpcr 绝对定量的方法进行文库浓度测定 当使用完整长度 Adapter, 且完成 Adapter Ligation 步骤之后, 任何一个步骤产物都可以使用基于 qpcr 绝对定量的方法进行浓度测度 可以明确监控 End Preparation 磁珠纯化/ 分选 Library Amplification 各步骤效率, 进而能为体系优化和建库异常原因分析提供依据 因 PCR-Free 文库缺少 Library Amplification 步骤, 构建好的文库中包含一定比例的单端连接 Adapter 的产物和两端都不连接 Adapter 的产物 当使用 Qubit PicoGreen 等基于双链 DNA 荧光染料的浓度测定方法时, 无法有效区分这些产物 但 qpcr 绝对定量基于 PCR 扩增原理, 只定量样品中两端 Adapter 完整的文库 ( 即可测序文库 ), 可以排除单端或双端都不连接 Adapter 的不可测序文库的干扰 因此,PCR-Free 文库只能使用基于 qpcr 绝对定量的方法进行浓度测定 过度扩增的文库因包含大量不完整双链结构, 不能使用 Qubit PicoGreen 等基于双链 DNA 荧光染料的浓度测定方法 但基于 qpcr 绝对定量的方法不受过度扩增影响 ( 参考关于 06-6/ 关于 Library Amplification) 06-8/ 其他注意事项 使用前请将试剂盒各组分置于室温解冻 解冻后上下颠倒数次充分混匀, 短暂离心后置于冰上待用 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀, 剧烈振荡可能会造成文库产出下降 为避免样品交叉污染, 推荐使用带滤芯的枪头, 吸取不同样品时请更换枪头 推荐在带热盖的 PCR 仪中进行各步骤反应, 使用前应预热 PCR 仪至反应温度附近 PCR 产物因操作不当极容易产生气溶胶污染, 进而影响实验结果准确性 因此, 我们推荐将 PCR 反应体系配制区和 PCR 产物纯化检测区进行强制性的物理隔离 ; 使用专用的移液器等设备 ; 并定时对各实验区域进行清洁 ( 使用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂进行擦拭清理 ), 以保证实验环境的洁净度 8

07/ 实验原理与流程概要 Input DNA End Preparation Adapter Ligation PCR-Free Library ends here Library Amplification P5 IX P7 VAHTS DNA Adapter for Illumina Compatible with: - DNA - ChIP-DNA - RNA (non-small RNA) 5 Phosphate 3 da Tail 3 dt Tail IX, Index P5 sequence P7 sequence VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 建库原理 9

dsdna 可分选位置 1 分选条件参考 Table 5 (Page.14) 常见应用中推荐的 Input DNA 量参考 Table 1 (Page.03) 根据应用类型与 Input DNA 量参考 Table 4 (Page.14) 选择合适的位置进行分选操作 dsdna Fragmentation Input DNA End Preparation (65 μl),15 min 65,15 min Safe Stopping Point 1 可进行 Input DNA 长度分布与浓度检测 ( 此处推荐浓度测定方案 :Qubit ) 不同 Input DNA 量推荐 Adapter 用量参考 Table 2 (Page.04) Adapter Ligation (100 μl),15 min 可分选位置 2 分选条件参考 Table 5 (Page.14) 不同 Input DNA 量推荐扩增 Cycle 数参考 Table 3 (Page.07) Cleanup (180 μl) 0.8 DNA Clean Beads Library Amplification (50 μl) Safe Stopping Point 2 PCR-Free 文库构建至此结束 可进行文库长度分布与有效浓度检测 ( 此处推荐浓度测定方案 :VAHTS Library Quantification Kit) 可分选位置 3 分选条件参见 Table 5 (Page.14) Cleanup (95 μl) 0.9 DNA Clean Beads 靶向捕获或测序 Safe Stopping Point 3 可进行文库长度分布与有效浓度检测 ( 此处推荐浓度测定方案 :Qubit / VAHTS Library Quantification Kit) VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 建库流程概要 10

08/ 标准实验方案 步骤一 :End Preparation 这一步骤将 Input DNA 末端补平, 并在 5 端进行磷酸化和 3 端加 da 尾 1. 将 End Prep Mix 2 解冻后颠倒混匀, 于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 组分 Input DNA End Prep Mix 2 ddh2o 体积 x μl 15 μl To 65 μl 2. 使用移液器轻轻吹打混匀 ( 请勿振荡混匀 ), 并短暂离心将反应液收集至管底 3. 将 PCR 管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 温度热盖 105 65 4 时间 On 15 min 15 min Hold 步骤二 :Adapter Ligation 这一步骤将在 End Preparation 产物末端连接 Adapter 1. 根据 Input DNA 量按 Table 2 (Page.04) 稀释 Adapter 至合适浓度 2. 将 Rapid Ligation buffer 解冻后颠倒混匀, 置于冰上备用 3. 在 End Preparation 步骤 PCR 管中配制如下反应 : 组分 End Preparation 产物 Rapid Ligation buffer Rapid DNA ligase DNA Adapter X 总计 体积 65 μl 25 μl 5 ul 5 μl 100 μl Rapid Ligation buffer 与 Rapid DNA ligase 预混后, 可于 4 存放不超过 24 hrs 4. 使用移液器轻轻吹打混匀 ( 请勿振荡混匀 ), 并短暂离心将反应液收集至管底 5. 将 PCR 管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 温度热盖 105 4 时间 On 15 min Hold 当 Input DNA 量较低时, 可尝试将连接时间延长一倍 但延长反应时间可能会导致 Adapter Dimer 增加, 必要时需同时调整 Adapter 使用浓度 11

6. 使用 VAHTS DNA Clean Beads 对反应产物进行纯化 : 1/ 磁珠平衡至室温后, 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取 80 μl VAHTS DNA Clean Beads 至 100 μl Adapter Ligation 产物中, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 3/ 室温孵育 5 min 4/ 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 5/ 保持 PCR 管始终置于磁力架中, 加入 0 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 6/ 重复步骤 5, 总计漂洗两次 7/ 保持 PCR 管始终置于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 5-10 min 至无乙醇残留 8/ 将 PCR 管从磁力架中取出, 进行洗脱 : 如纯化产物不进行双轮磁珠分选 : 加入 22.5 μl 洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0 - ph 8.5) 洗脱, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min, 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移取 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠 如纯化产物需进行双轮磁珠分选 : 加入 105 μl 洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0 - ph 8.5) 洗脱, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min, 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移取 100 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠, 根据 Table 5 (Page.14) 双轮磁珠分选条件进行长度分选 此处样品可于 4 稳定保存一周 长期保存置于 -, 避免不必要的反复冻融 步骤三 :Library Amplification ( 选做 ) 这一步骤将对纯化或长度分选后的 Adapter Ligation 产物进行 PCR 扩增 是否需要进行这一步骤取决于 Input DNA 量 Adapter 是否为完整长度 应用需要等因素 如使用非完整长度 Adapter, 必须进行这一步骤 如使用完整长度 Adapter, 当 Input DNA < 50 ng 时, 推荐进行 Library Amplification; 当 Input DNA 50 ng 或者不需要进行文库扩增富集时, 此步骤可不进行, 直接进入步骤四 1. 将 PCR Primer Mix Amplification Mix 2 解冻后颠倒混匀, 于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 组分纯化或分选过的 Adapter Ligation 产物 PCR Primer Mix Amplification Mix 2 总计 体积 μl 5 μl 25 μl 50 μl 2. 使用移液器轻轻吹打混匀 ( 请勿振荡混匀 ), 并短暂离心将反应液收集至管底 12

3. 将 PCR 管置于 PCR 仪中, 进行下述反应 : 温度 95 98 60 72 72 4 时间 3 min sec 15 sec 30 sec 5 min Hold 循环数 1 循环数选择参照 Table 3 (Page.07) 1 4. 如需进行长度分选, 参考附一 双轮磁珠分选进行 ; 如不需要进行长度分选, 使用 VAHTS DNA Clean Beads 对反应产物进行纯化 : 1/ 磁珠平衡至室温后, 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取 45 μl VAHTS DNA Clean Beads 至 50 μl Library Amplification 产物中, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 3/ 室温孵育 5 min 4/ 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 5/ 保持 PCR 管始终置于磁力架中, 加入 0 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 6/ 重复步骤 5, 总计漂洗两次 7/ 保持 PCR 管始终置于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 5-10 min 至无乙醇残留 8/ 将 PCR 管从磁力架中取出, 进行洗脱 : 如后续不进行靶向捕获 : 加入 22.5 μl 洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0 - ph 8.5) 洗脱, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min, 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置, 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移取 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠 如后续需进行靶向捕获 : 加入 22.5 μl 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min, 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置, 待溶液澄清后 ( 约 5 min ), 小心移取 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠 此处样品可于 4 稳定保存一周 长期保存置于 -, 避免不必要的反复冻融 步骤四 : 文库质量控制 参考 06-7/ 关于文库的质量控制 13

附一 双轮磁珠分选 为了满足不同应用的需要, 建库过程中通常需要进行双轮磁珠分选以控制文库 Insert Size 的分布范围 一般情况下, 推荐将分选置于 Adapter Ligation 之后 也可根据 Input DNA 量与分布范围情况, 将分选置于 End Preparation 之前或者 Library Amplification 之后 应保证分选方案执行位置的唯一性, 进行两次或者两次以上的分选会导致文库复杂度和产出严重下降! 分选方案执行位置的选择和优缺点参见 Table 4 Table 4 分选方案执行位置选择 分选方案执行位置 End Preparation 之前 Adapter Ligation 之后 ( 推荐方案 ) Library Amplification 之后 建库过程中不进行分选 适用情况 Input DNA 量充足, 但分布范围宽或主峰与预期文库 Insert Size 不一致 ;Input DNA 纯度较差 Input DNA 分布范围适合且量充足 *** Input DNA 量少 *** Input DNA 分布范围已满足建库要求 ; Input DNA 量少 优点分选产物长度分布集中 ; 能准确控制 Input DNA 量 ; 能进一步提高 Input DNA 纯度, 提高建库成功率减少短片段 DNA 丢失 ; 绝大多数情况下通用 减少建库过程中 Input DNA 的损失, 提高文库复杂度减少建库过程中 Input DNA 的损失, 提高文库复杂度 缺点 DNA 损失大 ; 文库分布范围略宽 * 文库分布范围略宽 * 文库分布范围宽 ** 无法控制文库 Insert Size 适用样本列举 Fragmentation 不充分或过度的基因组 DNA Fragmentation 适度的基因组 DNA 或分布范围较宽的 FFPE DNA cfdna 多重 PCR 产物 断裂程度较高的 FFPE DNA * 双轮磁珠分选效果受 DNA 末端情况影响,Input DNA 末端的单链部分以及 Y 型 Adapter 的单链非互补区域会导致分选产物长度分布范围变宽 ** 相对于其他位置分选而言 因其他位置分选产物进行 Library Amplification 之后, 文库分布会进一步集中 *** 推荐当 Input DNA 量 50 ng 时, 选择在 Adapter Ligation 之后进行分选 ; 当 Input DNA 量 50 ng 或样品拷贝数有限时, 将分选置于 Library Amplification 之后 双轮磁珠分选是通过控制磁珠的使用量来进行 DNA 长度选择的 其基本原理为 : 第一轮磁珠结合分子量较大的 DNA, 通过丢弃磁珠去除这部分产物 ; 第二轮磁珠结合剩余产物中分子量较大的 DNA, 通过丢弃上清去除分子量较小的 DNA 初始样品中的很多组分都会干扰双轮磁珠分选效果 因此, 当分选方案执行位置不同时, 双轮磁珠使用量也不尽相同 可根据预期文库 Insert Size 和分选方案执行位置在 Table 5 中选择最适分选参数 Table 5. 文库长度分选 预期文库 Insert Size (bp) 分选方案执行位置与条件 End Preparation 之前分选 ( 样品体积补至 100 μl) Adapter Ligation 之后分选 ( 样品体积 100 μl ) Library Amplification 之后分选 ( 样品体积补至 100 μl) 磁珠轮数一轮 X (ul) 二轮 Y (ul) 一轮 X (ul) 二轮 Y (ul) 一轮 X (ul) 二轮 Y (ul) 150 100 30 78 78 0 90 68 70 250 80 65 15 63 300 70 59 15 55 350 60 56 12 50 400 55 53 12 46 450 52 15 51 10 45 500 50 15 50 10 44 15 550 48 15 / / / / 700 43 12 / / / / 14

使用磁珠进行长度分选时,Insert Size 越大最终产物分布越宽 当 Insert Size > 700 bp 时, 双轮磁珠几乎不具有分选效果 此时建议通过切胶纯化的方案进行长度分选 样品和磁珠的体积比对于分选效果至关重要, 应尽可能保持样本初始体积和移液体积的准确性 样品预处理 ( 重要!) 如在 End Preparation 之前进行长度分选, 样品体积应为 100 μl, 不足时使用灭菌超纯水补齐 ; 如在 Adapter Ligation 产物纯化之后进行长度分选, 样品体积应为 100 μl, 不足时使用灭菌超纯水补齐 ; 如在 Library Amplification 之后进行长度分选, 样品体积应为 100 μl, 不足时使用灭菌超纯水补齐 ; 如不对样品进行体积预处理, 也可按样品实际体积等比例调整磁珠用量 但样品体积太小会导致移液误差增大, 进而影响分选的准确性 因此, 不推荐对体积 < 50 μl 的样品直接进行分选 分选方案 [ 参考 Table 5 (Page.14) 确定 X 和 Y 的值 ] 1/ 磁珠平衡至室温后, 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取 X μl VAHTS DNA Clean Beads 至上述 100 μl 产物中, 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 3/ 室温孵育 5 min 4/ 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心转移上清至新 PCR 管中, 丢弃磁珠 5/ 吸取 Y μl VAHTS DNA Clean Beads 至上清中, 用移液器轻轻吹打 10 次充分混匀 6/ 室温孵育 5 min 7/ 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移除上清 8/ 保持 PCR 管始终处于磁力架中, 加入 0 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 9/ 重复步骤 8, 总计漂洗两次 10/ 保持 PCR 管始终置于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 5-10 min 至无乙醇残留 11/ 将 PCR 管从磁力架中取出, 进行洗脱 : 如后续不进行靶向捕获 : 加入 22.5 μl 洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.0-8.5) 洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移取 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠 如后续需进行靶向捕获 : 加入 22.5 μl 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 min 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后 ( 约 5 min), 小心移取 μl 上清至新 EP 管中, 切勿触碰磁珠 15

附二 cfdna 建库方案 cfdna ( 游离 DNA) 是一种来源于血液的碎片化 DNA, 具有高度片段化 (~180 bp) 含量低等显著特点, 在无创产前诊断 (NIPT) 以及液体活检 (ctdna 检测 ) 等领域具有极高的检测价值 针对这类样品,VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 提供高度简化和优化的建库方案 注意事项 Input DNA 特指投入到 End Preparation 的 DNA, 体积 50 μl cfdna 本身高度片段化, 不需要进行 Fragmentation 为保证建库质量, 推荐对 cfdna 模板进行长度分布 (2100 Bioanalyzer) 和浓度 (Qubit ) 检测 建库流程 步骤一 :End Preparation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤一 ) Input DNA 量 :100 pg - 100 ng 步骤二 :Adapter Ligation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤二 ) Adapter: 根据 Table 2 (Page.04) 预先稀释 Cleanup: 采用 0.8 磁珠纯化,22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清进行下一步骤 步骤三 : Library Amplification ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤三 ) 循环数 : 推荐 12-17, 根据文库产出需求自行调整 Cleanup:cfDNA 文库是否进行长度分选由样本情况与数据分析需要决定 如不进行双轮磁珠分选 : 采用 0.9 磁珠纯化,22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清至新 EP 管中,- 保存 如进行双轮磁珠分选 : 采用 0.73 / 0.25 双轮磁珠分选,22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清至新 EP 管中,- 保存 步骤四 : 文库质量控制文库浓度测定 : 推荐使用荧光染料法 (Qubit 或 Picogreen ) 或 qpcr 绝对定量法进行文库浓度测定 文库长度分布检测 : 通过 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行长度分布检测 磁珠法提取的 cfdna cfdna 文库 ( 不进行长度分选 ) cfdna 文库 ( 进行长度分选 ) 16

附三 FFPE DNA 建库方案 FFPE DNA 是从福尔马林固定石蜡包埋 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE) 的切片中获得的 DNA, 具有提取困难 ( 与组蛋白紧密交联 ) 质量较低( 降解严重 ) 等特点 FFPE 样本易于保存且来源广泛, 在医学领域具有极高的应用价值 针对这类样品, VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 提供高度简化和优化的建库方案 注意事项 Input DNA 特指投入到 End Preparation 的 DNA, 体积 50 μl 因组织差异 包埋质量 保存时间等因素影响, 提取到的 FFPE DNA 质量不尽相同 使用低质量的 FFPE DNA 建库时应适当提高 Input DNA 量或增加扩增循环数 为了保证建库质量, 推荐对 FFPE DNA 模板进行长度分布 (2100 Bioanalyzer) 和浓度 (Qubit ) 检测 也可使用基于 qpcr 法的 FFPE DNA 质量评价体系预先对模板进行检测 当 FFPE DNA 片段化程度不足, 平均分子量偏大时, 建库前需要先进行 Fragmentation 建库流程 步骤一 :End Preparation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤一 ) Input DNA 量 : 50 ng 步骤二 :Adapter Ligation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤二 ) Adapter: 根据 Table 2 (Page.04) 预先稀释 Cleanup: 采用 0.8 磁珠纯化 如纯化产物不进行双轮磁珠分选 : 用 22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清 如纯化产物需进行双轮磁珠分选 : 用 105 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 100 μl 上清, 后根据 Table5 (Page.14) 双轮磁珠分选条件进行文库长度分选 步骤三 : Library Amplification ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤三 ) 循环数 : 参照 Table 3 (Page.07), 根据样本质量调整 Cleanup: 如扩增产物不进行双轮磁珠分选 : 采用 0.9 磁珠纯化,22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清至新 EP 管中,- 保存 如扩增产物需进行双轮磁珠分选 : 用灭菌超纯水补至 100 μl, 后根据 Table5 (Page.14) 双轮磁珠分选条件进行文库长度分选 步骤四 : 文库质量控制 文库浓度测定 : 推荐使用荧光染料法 (Qubit 或 Picogreen ) 或 qpcr 绝对定量法进行文库浓度测定 文库长度分布检测 : 通过 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行长度分布检测 FFPE DNA 最终文库 (Adapter Ligation 后长度分选 ) FFPE DNA 文库 ( 进行长度分选 ) 17

附四 靶向捕获建库方案 以 NimbleGen SeqCap EZ 捕获流程为例,VAHTS TM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 可以用于构建预捕获文库 注意事项 Input DNA 特指投入到 End Preparation 的 DNA, 体积 50 μl Input DNA 范围应介于 180-2 bp 范围内, 具体打断条件参照 Covaris 或其他 DNA 片段化设备的使用说明书 为保证建库质量, 推荐对 Input DNA 进行长度分布 (2100 Bioanalyzer) 和浓度 (Qubit ) 检测 建库流程 步骤一 :End Preparation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤一 ) Input DNA 量 : 根据样本类型参照 Table 1 (Page.03) 选择 步骤二 :Adapter Ligation ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤二 ) Adapter: 根据 Table 2 (Page.04) 预先稀释 VAHTS TM DNA Adapters for Illumina (Vazyme #N801/N802) 可完美兼容 NimbleGen SeqCap EZ 使用其他来源的 Adapter 或者捕获试剂时,Adapter 的选择需要参考捕获试剂中的 Blocking 试剂 Cleanup: 采用 0.8 磁珠纯化,105 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 100 μl 上清 ; 后进行 0.68 / 0.2 双轮磁珠分选,22.5 μl 洗脱液洗脱 DNA, 移取 μl 上清进行下一步骤 步骤三 : Library Amplification ( 参照 08/ 标准实验方案 / 步骤三 ) 循环数 : 参照 Table 3 (Page.07), 推荐按上限循环数扩增 按推荐上限循环数扩增可获得 1 μg 的文库产出 ; 若捕获前先进行样本 Pooling, 应确保每个样本的文库产出 1 μg/n (n = 样品数量 ) 此时, 可降低各样品扩增循环数, 以提高文库复杂度 降低 Duplication rates Cleanup: 采用 0.9 磁珠纯化,22.5 μl 灭菌超纯水洗脱 DNA, 移取 μl 上清至新 EP 管中 步骤四 : 文库质量控制参照 SeqCap EZ Library SR User s Guide v5.1 (Chapter 4,Step 5) (Roche document number 06588786001,09/15) 进行文库质量控制 步骤五 : 靶向富集参照 SeqCap EZ Library SR User s Guide v5.1 第 5-8 章完成靶向捕获流程 18

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