SureSelect 1 文库制备试剂盒专门针对完整样品和 FFPE 样品进行了优化, 分析周期为 8 小时,DNA 起始量低至 10 ng 分子条形码功能可准确灵敏地检测低频等位基因变异最近一项研究表明,SureSelect 工作流程能够实现高灵敏度 ( 检测极限约为 0.1%) 和易定制

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或野谢
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1 应用简报六种不同文库制备试剂盒用于 FFPE 样品外显子序列捕获应用的比较作者 Jesse D. Luce Prashant K. Singh Sean T. Glenn 罗斯威尔帕克癌症研究所肿瘤遗传学与基因组学系美国纽约州布法罗 Josh Zhiyong Wang Bahram Arezi Bilan Hsue 安捷伦科技公司美国加利福尼亚州圣克拉拉摘要外显子组测序和靶向基因组合测序是常用的新一代测序 (NGS) 方法, 用于鉴定和表征科研与临床样品 ( 如癌症样本 ) 中的不同基因突变基因组合靶标设计实验室处理操作和生物信息学分析等许多因素都会影响变异 / 畸变检测的灵敏度和准确性本文展示相同 FFPE 样品在多个的六种不同文库制备试剂盒中得到的对比结果在 100X 原始测序深度下, SureSelect 文库制备试剂盒在四个关键指标上表现出最佳性能, 即在靶率平均读出序列深度 20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率以及捕获前文库产率 A 试剂盒在 20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率和捕获前文库产率两个指标中排名第二 ; E 在在靶率和平均读出序列深度两个指标中排名第二总体来说, SureSelect 试剂盒的性能优于评估的其他 5 种试剂盒前言检测 DNA 样品中出现的遗传变异是基础与临床研究中至关重要的一步靶向测序和外显子组测序是研究具有复杂突变谱样品 ( 如肿瘤样品 ) 的重要工具聚焦于与疾病或表型相关的选定基因或基因区域, 可使研究人员以更经济的方式进行更深度的测序在不同的靶标序列捕获工作流程中, 杂交型靶向序列捕获可提供极大的灵活性和高质量的测序数据标准靶标序列捕获工作流程包括捕获前 DNA 文库制备目标区域的杂交捕获以及捕获后 PCR, 以产生足够的测序文库为最大限度提高杂交捕获效率, 捕获前文库必须具有高产率和高复杂度不同的市售文库制备试剂盒利用不同的酶试剂和工作流程来优化捕获前文库制备效率

2 SureSelect 1 文库制备试剂盒专门针对完整样品和 FFPE 样品进行了优化, 分析周期为 8 小时,DNA 起始量低至 10 ng 分子条形码功能可准确灵敏地检测低频等位基因变异最近一项研究表明,SureSelect 工作流程能够实现高灵敏度 ( 检测极限约为 0.1%) 和易定制化的 ctdna 测序 2 在本应用简报中, 我们对比了六个不同的文库制备试剂盒由 4 个降解 FFPE 样品制备捕获前文库, 然后与 SureSelect 人全外显子 V6 杂交在 Illumina HiSeq2500 上对捕获文库进行测序用多个测序 QC 指标确定这些试剂盒的性能材料与方法样品与文库制备本研究使用四种黑色素瘤 FFPE 样品, 分别记为 FFPE1 FFPE2 FFPE3 和 FFPE4 使用安捷伦 NGS FFPE 质控试剂盒 (ddcq 范围为 ) 确定样品的质量 (ddcq 值 ) 采用 Covaris S220 聚焦超声发生器对 DNA 进行打断在所有 QC 步骤中使用 4200 TapeStation 评估打断文库制备和捕获后 PCR 步骤中的 DNA 片段大小使用 SureSelect 和五种其他文库制备试剂盒 ( 分别以 A B C D 和 E 表示 ) 制备文库, 共六种文库在产生捕获前文库后, 按照制造商的方案用 SureSelect 人全外显子 v6 进行杂交捕获将捕获后 PCR 循环次数设为 9 安捷伦产品信息见表 1 表 1. 本研究所用的安捷伦产品产品名称 SureSelect 试剂盒, 标签人全外显子组 v6 靶向序列捕获探针,16 次反应 SureSelect 试剂盒, 标签人全外显子组 v6 靶向序列捕获探针,16 次反应 SureSelect 试剂盒, 标签人全外显子组 v6 靶向序列捕获探针,96 次反应目录号 G9704K G9705K G9706K 将最终文库混合并以 16 pm 加载, 用于多个快速模式 v2 流通池的板上簇生成, 然后在 Illumina HiSeq 2500 系统上按每份样品约 M 读出序列的深度测序个循环采用 Illumina CASAVA 软件执行碱基识别和多重性分解数据分析将过滤后的读出序列归一化至六千万个读出序列, 达到 100X 的测序深度, 然后用 BWA 比对工具将其映射到参考人基因组 (hg19) 三个文库未能产生六千万个读出序列, 其中包括使用 A 的 FFPE2 和使用 C 的 FFPE3 采用 bedtools ( 分析测序指标 ( 在靶率和读出序列深度 ) 使用 SureCall 软件分析 SureSelect 文库分子条形码结果与讨论六种不同试剂盒捕获前文库产率对比由于 FFPE DNA 样品在质量或降解程度方面可能有很大差异, 使用 Qubit 对 FFPE DNA 样品的 DNA 定量分析并不能反映可扩增数量, 而这一指标在涉及 PCR 的许多 NGS 应用中至关重要因此, 用于测定 FFPE DNA 样品质量和可扩增数量的 qpcr 方法成为了产生归一化 DNA 完整性评分 (ddcq) 的常用方法, 较低的 ddcq 值表示样品质量较好, 较易扩增本对比研究选择的四种 FFPE DNA 样品分别命名为 FFPE1 FFPE2 FFPE3 和 FFPE4, 各自 ddcq 值分别为和 2.32 对于本对比研究, 根据每个 FFPE 样品的 Qubit 浓度使用 100 ng 的 DNA 起始量由于所有非安捷伦试剂盒方案均未要求根据 ddcq 值调整 DNA 起始量, 因此本研究也不根据其 ddcq 值调整 DNA 起始量本研究包含 SureSelect 试剂盒以及另外 5 个指定 A B C D 和 E 的非安捷伦文库制备试剂盒请注意, 以上六种试剂盒的实验方案均包含七个类似步骤 : 基因组 DNA 剪切末端修复 da 加尾接头连接捕获前 PCR 捕获杂交和最终文库的捕获后 PCR 但是, 以上方案在所执行的 Agencourt AMPure XP 纯化步骤 (2 6 步 ) 数量每个酶催化步骤的孵育时间 PCR 循环次数以及由此产生的文库制备总操作时间方面存在较大差异表 2 对比了使用六种文库制备试剂盒对上述 4 种 FFPE 样品的捕获前文库产率 PCR 循环次数影响整体文库产率, 循环次数越多, 产率越大三种试剂盒 ( A D 和 E) 根据其方案建议采用了 10 次循环, 而另外三种试剂盒 ( SureSelect B C) 根据各自方案采用了 12 次循环通常, 与样品 FFPE3 或 FFPE4 相比, 使 2

3 用样品 FFPE1 和 FFPE2 的所有试剂盒 PCR 产率更高这可能是由于 FFPE1 和 FFPE2 的 ddcq 值较低, 因此具有较高的 DNA 完整性, 更适用于 PCR 在采用 10 次 PCR 循环的三种试剂盒中, A 的试剂盒比 D 和 E 的试剂盒文库产率更高在采用 12 次 PCR 循环的三种试剂盒中, SureSelect 试剂盒比 B 和 C 试剂盒的捕获前文库产率更高事实上, SureSelect 试剂盒产生的捕获前文库 DNA 是竞争对手试剂盒的倍表 2. 捕获前文库制备产率对比 (ng DNA) PCR 循环次数 ddcq A B C D E FFPE FFPE FFPE FFPE 总体来说, SureSelect 和 A 试剂盒的捕获前文库制备产率居于六种试剂盒的前两名使用方案中的默认参数, SureSelect 试剂盒可在所有 4 个 FFPE 样品中得到稳定的捕获前文库产率样品 FFPE3 的产率稍低, 为 762 ng, 但已足够进行捕获杂交在靶测序率对比对于 SureSelect 文库的测序数据, 需要使用 SureCall 软件进行额外分析, 以包括分子条形码信息的读出序列这些数据在本应用简报中以 MBC 表示 ( 图 1 3) 评估外显子组靶向序列捕获工作流程的性能时, 外显子组区读出序列百分比是一个有用的指标使用国际 HapMap 项目的高质量样品和 SureSelect 人全外显子 V6 捕获文库时, 在靶率通常可达 70% 85% 图 1 所示为本研究中试剂盒得到的所有文库的在靶率对比对于 SureSelect 和 SureSelect MBC 数据而言, 尽管 FFPE3 和 FFPE4 由于 ddcq 值较低而质量远低于 FFPE1 或 FFPE2, 但所有 4 种 FFPE 样品的在靶率始终保持在 75% 85% 之间上述结果说明 SureSelect 试剂盒在各种不同质量 FFPE 样品中都保持了高水平性能 ( 按照在靶率 ), 且在使用降解程度更高的 FFPE 样品时, 其在靶率指标明显优于其他试剂盒 ( 图 1) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MBC 图 1. DNA 测序在靶率对比 A 在靶率 B C FFPE 1 FFPE 2 FFPE 3 FFPE 4 D E 相比之下, 其他的文库制备试剂盒的在靶率较低 E 的试剂盒在其中表现最佳, 在靶率始终保持在 65% 71% 之间, 比 SureSelect 试剂盒的在靶率低 10% 15% 左右使用竞争对手试剂盒对两种低质量样品 (FFPE3 和 FFPE4) 获得的在靶率低于高质量 FFPE1 和 FFPE2 样品的在靶率例如, 使用 A 和 B 试剂盒时,FFPE4 样品获得的在靶率分别为 46.1% 和 47.5% C 试剂盒在四个 FFPE 样品中产生的在靶率始终保持在 57% 至 59.4% 之间在 20X 读出序列深度下的平均读出序列深度与靶标碱基覆盖率对比靶向 NGS 实验的主要目的是在目标基因组区域产生足够的读出序列深度, 从而可靠地鉴定出参考序列的变异因此, 确定靶向序列捕获解决方案的有效性时, 根据所达到的平均测序读出序列深度以及在特定读出序列深度 (10X 20X 或 100X 等 ) 处的靶标碱基覆盖率评估的性能是最重要的 QC 指标由于使用了相同的捕获探针组 (SureSelect 人全外显子 v6), 所观察到的差异均是由用于对比的文库制备试剂盒引起的, 而不是捕获杂交探针组通常, 实验所需的测序读出序列深度取决于预期突变的等位基因频率在预期纯合子或杂合子基因突变的遗传性疾病样品 NGS 实验中, 认为 20X 的读出序列深度足以实现高度可靠的 3

4 变异识别然而, 在预期低频等位基因变异的癌症样品 NGS 实验中, 可能需要 200X 1000X 甚至 20000X 的读出序列深度以及分子条形码分析, 才能实现高度可靠的变异识别 2 但是, 在测序实验中,20X 读出序列深度下的较高靶标碱基覆盖率通常与超过 100X 或 1000X 读出序列深度的较高靶标碱基覆盖率相关因此, 在本应用简报中, 尽管使用 FFPE 癌症样品进行外显子组测序, 但仍将平均读出序列深度和 20X 读数深度下的靶标碱基覆盖率作为 QC 指标, 来对比六种不同的文库制备试剂盒表 3 显示了所有试剂盒和所有四种 FFPE 样品的平均读出序列深度以及在 20X 读出序列深度数据下的靶标碱基覆盖率图 2 显示了与原始测序读出序列深度为 100X 的多数样品进行的平均读出序列深度对比, 对比中不包括上文 ( 材料与方法 ) 提到的测序深度为 75X 85X 的 3 个样品对于 FFPE1 和 FFPE2 样品, SureSelect 试剂盒在所有试剂盒 ( 表 3) 中具有最高读出序列深度 (62X 与 71X), D 试剂盒 (52X 与 65X) 和 E 试剂盒 (60X 与 56X) 的读出序列深度排名第二对于 FFPE3 样品, D 试剂盒 (52X) 和 E 试剂盒 (46X) 具有最高的平均读出序列深度但对于 FFPE4 样品, SureSelect 试剂盒再次成为表现最佳的产品, 平均读出序列深度为 60X, E 试剂盒 (52X) 排名第二图 3 对比了所有六种试剂盒在 20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率对于 FFPE1 和 FFPE2 样品, SureSelect 表 3. 平均读出序列深度和指定读出序列深度下的靶标碱基覆盖率对比 MBC FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度 : 至少 1 个读出序列 : 97.7% 97.3% 97.4% 97.4% 97.7% 97.3% 97.3% 97.3% 至少 10 个读出序列 : 94.6% 92.8% 92.8% 91.6% 93.8% 91.8% 92.1% 90.4% 至少 20 个读出序列 : 87.0% 85.1% 81.2% 80.3% 84.3% 82.7% 79.4% 77.5% 至少 50 个读出序列 : 51.7% 56.7% 29.5% 45.7% 45.3% 51.0% 28.8% 41.2% A B FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 46.6M * 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度 : 至少 1 个读出序列 : 97.8% 97.7% 97.4% 97.4% 97.7% 97.6% 97.2% 97.2% 至少 10 个读出序列 : 95.3% 94.2% 93.8% 87.2% 94.3% 94.3% 88.5% 83.3% 至少 20 个读出序列 : 86.2% 82.1% 82.6% 62.1% 82.4% 83.3% 65.5% 54.7% 至少 50 个读出序列 : 40.3% 28.1% 30.2% 19.7% 37.1% 33.4% 9.9% 10.6% * 78X 测序深度 * 85X 深度 ** 75X 测序深度 C D E FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 FFPE1 FFPE2 FFPE3 FFPE4 读出序列数 60M 51M * 45M ** 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 60M 平均读出序列深度 : 至少 1 个读出序列 : 97.8% 97.7% 97.3% 97.5% 97.2% 97.3% 96.7% 95.8% 97.1% 97.0% 96.5% 96.3% 至少 10 个读出序列 : 95.2% 94.5% 89.9% 91.1% 82.8% 88.0% 83.6% 72.2% 82.3% 83.9% 81.6% 77.3% 至少 20 个读出序列 : 84.9% 82.3% 70.5% 74.0% 62.7% 72.2% 65.4% 50.6% 63.5% 65.1% 62.3% 56.4% 至少 50 个读出序列 : 39.2% 31.1% 17.7% 28.7% 34.2% 41.4% 34.2% 27.1% 37.3% 35.5% 30.7% 31.1% 4

5 试剂盒的性能最佳 ( 分别为 87% 和 85.1%), A 试剂盒 (86.2% 和 82.1%) 位居第二, C 试剂盒 (84.9% 和 82.3%) 和 B 试剂盒 (82.4% 和 83.2%) 紧随其后供应商 D 或 E 试剂盒的性能大幅下降 (62% 72%), 结果令人惊讶, 因为 D 和 E 试剂盒的平均读出序列深度较为出色可能的原因是, D 和 E 试剂盒在不同靶标碱基上无法产生良好的一致性, 较高的平均读出序列深度是由某组深度覆盖率非常高的靶标碱基获得的对于 FFPE3 和 FFPE4 样品 (ddcq 值最差的两个样品 ), SureSelect 试剂盒表现出了最佳性能, 在 20X 读出序列深度下分别具有 81.2% 和 80.3% 的靶标碱基覆盖率 A 试剂盒 (82.6% 和 62.1%) 和 C 试剂盒 (70.5% 和 74.0%) 的 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MBC A FFPE 1 FFPE 2 FFPE 3 FFPE 4 平均测序深度 : 平均读出序列深度 B 78x C 85x D 75x E 图 2. 除非特别说明,100X 测序深度 ( 六千万个读出序列 ) 下的平均读出序列深度对比 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MBC 20x 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率 A B C FFPE 1 FFPE 2 FFPE 3 FFPE 4 平均测序深度 : 78x 85x 75x D E 图 3. 除非特别说明,20X 读出序列深度和 100X 测序深度 ( 六千万个读出序列 ) 下的靶标碱基覆盖率靶标碱基覆盖率分别位居第二和第三采用 FFPE1 和 FFPE2 样品时 B 和 C 试剂盒的性能相似, 但采用 FFPE3 和 FFPE4 样品时二者性能差异很大结果表明 C 试剂盒在处理降解程度更高的 FFPE 样品方面比 B 试剂盒性能更好 ( 图 3) 总体而言, SureSelect 试剂盒是唯一能够在 20X 读出序列深度下始终实现至少 80% 靶标碱基覆盖率, 且所有 4 种不同质量 FFPE 样品均有 100X 测序深度的试剂盒此外, SureSelect 试剂盒在读出序列深度为 50X 时具有最高的靶标碱基覆盖率, 表现出卓越的性能一致性 SureSelect 试剂盒的附加功能本研究根据 Qubit 值以 100 ng 的 DNA 起始量进行文库制备, 不考虑样品的降解状态, 以便在相同参数下评估所有试剂盒应该注意,Qubit 值不能反映出 DNA 的可扩增量,DNA 起始量的确定也应考虑据其他 DNA 完整性指标, 例如 ddcq 值或 DNA 完整值 (DIN) 在评估的六种试剂盒中, SureSelect 试剂盒是唯一一款以 DNA 质量为调整起始量和测序深度提供指导的试剂盒 SureSelect 试剂盒也是唯一包含分子条形码技术的试剂盒, 可提高变异识别准确度, 并能灵敏地检测低频等位基因变异 2 请注意, 当测序读出序列深度较高 (> 10000X) 和 / 或 gdna 起始量较低 (< = 25 ng) 时, 分子条形码分析对整体读出序列深度 ( 去冗余后 ) 和误差校正 ( 一致化 ) 的影响更加明显 2 对于本研究中使用的 SureSelect 试剂盒, 还利用分子条形码进行了单独分析分子条形码分析使在靶率略有提升 ( 图 1) 平均读出序列深度和 20X 读出序列深度下的靶标碱基覆盖率均略有下降 ( 图 2 和图 3) 这很可能是因为与参考文献 2 相比, 本实验使用的原始测序深度较低 (100X), 同时 gdna 起始量较高 (100 ng) 参考文献 1. SureSelect 靶向序列捕获试剂盒, 安捷伦出版号 CHCN 2. 使用 SureSelect 靶向序列捕获工作流程进行超灵敏的癌症液体活检分析安捷伦出版号 ZHCN 5

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8 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用于诊断目的本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知 PR 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 4 月 13 日, 中国出版 ZHCN

前言实验部分结果和讨论最常用的临床样品保存和存档方法之一材料是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组 FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈织全世界的组织库医院及实验室内存山医学院捐赠 ( 美国纽约州纽约市 ), 档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个组织 NA

前言实验部分结果和讨论最常用的临床样品保存和存档方法之一材料是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组 FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈织全世界的组织库医院及实验室内存山医学院捐赠 ( 美国纽约州纽约市 ), 档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个组织 NA 靶向序列捕获和新一代测序前对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行 DNA 质量控制应用简报核酸分析作者 Melissa Huang Liu 安捷伦科技有限公司美国加利福尼亚州拉霍亚 Maria Celeste Ramirez 安捷伦科技有限公司美国加利福尼亚州圣克拉拉摘要本文将介绍利用 Agilent 2100 生物分析仪系统的微流控芯片电泳, 在新一代测序工作流程的 SureSelect