分子生物学技术在妇幼保健精准 医疗中的应用 : 问题与思考 李金明国家卫生计生委临床检验中心
临床分子检测技术发展历程 : 几个里程碑 1953 年 :DNA 双股螺旋的发现 1963 年 : 放射免疫测定技术 1972~1977 年 : 重组 DNA 技术 核酸测序方法 1983 年 :PCR 测定技术 1991-1993 年 : 实时荧光 PCR 技术和芯片技术 2003 年 : 人类基因组计划基本完成 后基因组的功能基因组研究, 药物基因组学 2007 年 -- 新一代高通量测序技术 经济可靠的技术进步给我们带来了什么?
方法 实时荧光 PCR 方法 ( 扩增阻碍突变系统法 (Amplification Refractory Mutation System,ARMS) PCR- 高分辨溶点曲线分析 (HRM) 数字 PCR 等 ) PCR- 杂交法 ( 膜上 芯片 [ 基因芯片 ] 乳胶颗粒 [Luminex]) PCR-Sanger 测序 PCR- 焦磷酸测序 PCR- 新一代高通量测序 PCR-SSCP RFLP dhplc 等 荧光原位杂交 直接杂交 一些其他基因扩增检验方法 :TMA NASBA LAMP LCR 等 非扩增的信号放大 : bdna
我国分子检测技术的发展历程 1980 年代的斑点杂交技术 1990 年代初的 PCR- 琼脂糖凝胶电泳技术 1990 年代中期的 PCR- 琼脂糖凝胶电泳和 PCR-ELISA 并存, 以及实时荧光 PCR 技术的初升 2000 年 2013 年, 实时荧光 PCR 技术成为国内临床检测主流技术, 同时,PCR- 琼脂糖凝胶电泳 (α 地贫 ) PCR- 膜上杂交 (β 地贫 HPV 基因分型 药物基因 SNP) PCR- 基因芯片杂交 ( 耳聋基因 ) PCR- 乳胶颗粒杂交 (HLA 基因分型 病毒多重检测 ) TMA( 病原体 RNA 检测 ) PCR-Sanger 测序技术 PCR- 焦磷酸测序技术等各有应用 2014 年 -- 新一代高通量测序技术应用的如火如荼
分子诊断的概念 采用分子生物学方法 ( 基因扩增 测序 杂交 蛋白质组分析 代谢组学分析等 ) 检测患者体内特定遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断 分子诊断的靶标包括 DNA RNA 蛋白质和小分子代谢物
目前国内的临床分子检测现状 大部分用于病原体核酸检测 较少部分用于遗传病的产前诊断 无创产前筛查 个体化用药 ( 个体化医学 Personalized Medicine 或精准医学 Precision Medicine) 等的分子诊断的开展正如火如荼
精准医学的支柱 基因组学 转录组学 蛋白质组学 代谢组学 分子诊断 BMC Med Inform Decis Mak, 2009, 9: 17.
高通量测序技术的临床应用 染色体非整倍体无创产前筛查 (NIPT) 胚胎植入前遗传学筛查 ( Preimplantation Genetic Screening,PGS) 和胚胎植入前基因诊断 (Preimplantation Genetic Dignosis,PGD) 肿瘤靶向治疗基因突变检测 单基因遗传病检测 病原微生物检测 : 如 HPV 基因分型 宏基因组 (Metagenomics) 测序
标准唐氏筛查方法与 NIPT 对唐氏检测能力比较 一般的唐氏筛查手段仅能检出 50%~95% 的异常, 且有 5% 的假阳性率 [1,2] 根据 2015 年对 15,841 例妇女标准筛查方案的结果,21 三体的阳性预测值仅为 3.4%, 即 1000 个筛查阳性结果中只有 34 个为真阳性 [3] 1. Nicolaides KH. Prenat Diagn 2011;31:7 15. 2. Wright D, et al. Fetal Diagn Ther 2014; 35: 118 26. 3. Norton ME, et al. N Engl J Med. 2015 ;372(17):1589-97.
基本概念 假阳性率 : TP( 真阳性 ) 阳性预测值 : TP( 真阳性 ) FP( 假阳性 ) 假阴性率 : 阴性预测值 : TN FP( 假阳性 ) TN( 真阴性 ) FP( 假阳性 ) FN( 假阴性 ) TP( 真阳性 ) FN( 假阴性 ) TN( 真阴性 ) ( 真阴性 ) FN( 假阴性 ) 100% 100% 100% 100%
染色体非整倍体无创产前筛查 (NIPT) 的依据 用于 NIPT 的外周血 cffdna 特点 : 母体血浆中 cffdna 含量占总游离 DNA 的大约 5 10%, 长约 150bp, 怀孕 4 周即能检出, 其在血液中的半衰期只有 16min, 出现 2 小时后即不能测出 cffdna 在母体循环中较稳定, 可能与来源于胎盘的微粒能够保护他们免受核酸酶降解相关 Cff DNA 随着妊娠孕龄增加而增多, 在前三个月每周增加 21%, 在孕中期上升速度较慢, 在孕期的后八个星期又急剧上升 cff DNA 在 -20 下可稳定超过 4 年, 但血浆样本在 -20 下长时间保存, cff DNA 每月以 - 0.66GE/ml 速率降解
染色体非整倍体无创产前筛查 (NIPT) 原理 检测原理 : 如图所示, 以 21 号染色体为例, 假设每毫升母体外周血中的染色体有 1000 份基因组当量, 母体染色体所占比例为 900 份, 胎儿染色体所占比例为 100 份 对于怀有正常胎儿的孕妇, 胎儿的 100 份中含有 200 条 21 号染色体单体, 母亲的 900 份中含有 1800 条 21 号染色体单体, 两者相加, 共有 21 号染色体单体 2000 条 对于怀有 21- 三体综合征胎儿的孕妇, 由于胎儿的 21 号染色体多出一条, 则胎儿的 100 份基因组当量中含有 300 条 21 号染色体单体, 母亲的 900 份基因组当量中含有 1800 条 21 号染色体单体, 两者相加, 共有 21 号染色体单体 2100 条 根据数理统计的原理和血浆 DNA 测序的结果, 可辅助判断孕妇是否怀有 21- 三体综合征胎儿 Z 值 (chrn)=(ur%(chrn)-mean(chrn))/sd(chrn) UR%(chrN):N 号染色体 (N=13,18,21) 能唯一比对到人参考基因组上序列条数占检测样本中能唯一比对到人参考基因组上序列总数的比例
NIPT 的假阳性 NIPT 的假阳性率为 0.1%~0.2% Cheung SW, Leung TY. NEJM 2015,372(17):1675-1676
对于常见的染色体非整倍体, 所有患者不管其风险状态, 均可以选择游离 DNA 检测作为一个筛查策略, 但选择该检测的患者应该了解在所有可选择的筛查和诊断方法中这种筛查方法的益处和局限性 Obstet Gynecol. 2015 Jun 29. [Epub ahead of print] 美国妇产科医师学会 (ACOG) 和美国母胎医学会 (SMGM)2015 年联合发布专家共识
2016 年 7 月 28 日美国医学遗传学与基因组学学会 (ACMG) 最新的一份声明表示, 只要不是显著肥胖, 从 9-10 周妊娠开始, 检测细胞游离 DNA (cfdna) 的无创产前筛查 (NIPS) 适用于所有年龄段孕妇, 以及整个妊娠期的检测, 能够取代常规的 21 18 和 13 三体综合征筛查
PGS 与 PGD: 第三代试管婴儿技术 试管婴儿技术是将卵子与精子分别取出后, 置于试管内使其受精, 受精卵发育为胚胎, 后移植回母体子宫发育成胎儿的技术 试管婴儿技术作为有效的辅助生殖手段成为大多数不孕不育夫妇的重要选择, 目前平均成功率为 20-30% 第一代试管婴儿 (in vitro fertilization, IVF; 体外受精 ) 解决的是因女性因素引致的不孕 第二代试管婴儿 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI 单精子卵细胞浆内注射 ) 解决因男性因素引致的不育问题 第三代试管婴儿 (preimplantation genetic screening/diagnosis, PGS/PGD 胚胎植入前筛查 / 诊断 ) 帮助人类选择生育最健康的后代 第四代试管婴儿 : 针对的是那些虽有排卵功能, 但因为身体条件不好, 或者年龄偏大, 致使卵子的质量不高 活力差的女性 具体方法 : 将其卵细胞的细胞核取出, 移植到一位年轻 身体健康的女性卵子的细胞浆中, 形成一个新的 优质卵细胞, 而它仍旧表达着一位女性的遗传特征, 仍旧以前一位女性为 核心 然后再把这个新 造成 的卵子和其丈夫的精子在试管中结合成受精卵, 重新植入前一位女性子宫内, 这样就生下一个和提供卵细胞浆的 第三者 毫无关系的健康孩子
PGS 与 PGD PGS: 是指在进行 IVF 助孕时, 在胚胎移植之前, 对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测, 挑选正常的胚胎植入子宫, 以期获得正常的妊娠, 提高患者的临床妊娠率, 降低早期流产风险 PGD: 主要用于检查胚胎是否携带有遗传缺陷的基因 它是在试管婴儿技术基础上出现的, 精子卵子在体外结合形成受精卵, 并发育成胚胎后, 要在其植入子宫前进行基因检测, 以便使体外授精的试管婴儿避免一些遗传疾病 目前植入前遗传诊断能诊断一些单基因缺陷引发的疾病, 比如说血友病 地中海贫血症等疾病, 即可通过此类诊断直接发现
保证检测质量的关键环节 检验申请单是合适的 : 对 Who 在 When 开出 What 申请单 标本是正确的和好的 : 采集 运送和保存 实验室环境条件是好的 : 温湿度 可能的干扰的避免 ( 分区 灰尘 电磁 振动等 ) 仪器设备状态是好的 : 维护 定期校准 试剂是好的 : 性能验证 质检 实验室人员是有能力的 : 外部和内部培训, 能力评估 SOP 的可操作性及全员遵循 得到结果的过程是有监控的 : 室内质量控制和室间质量评价 ( 或实验室间比对 ) 针对差错 投诉 失控等分析原因采取措施的质量持续改进 临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗 结果报告解释及临床应用 ( 分析后 ) 涉及实验室人员和临床医生 检测申请单 标本采集 运送和保存 ( 分析前 ) 质量保证 室间质评 ( 分析中 ) 涉及实验室 涉及临床医生标本采集环节和实验室 室内质控 ( 分析中 ) 涉及实验室
无基因 或 无核酸 概念的重要性!!!
实验室质量管理的 灵魂 标准操作程序 (SOP) 是实验室的 最高标准! SOP 是等于试剂盒说明书吗? 源于一些标准文件 ( 如仪器试剂说明书 国际国内标准文件 ) 和实验室实际工作经验积累 因此高于相关标准文件!!! 有可操作性的 SOP 及全员遵循是质量管理的 灵魂!
出现问题 ( 失控 差错 投诉等 ) 处理的 20 字原则 Plan Do Check Action 查出异因 采取措施 保证消除 不再出现 纳入标准 预防! 防止同样的问题出现第二次是质量管理的 精髓! 北京及全国性雾霾的原因 : 工厂废气 汽车尾气 油烟 工地扬尘 烧煤