生物多样性 2006, 14 (6): 488-497 Biodiversity Science doi: 10.1360/biodiv.060041 http: //www.biodiversity-science.net 珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的 AFLP 分析 1 闫志峰 1 张本刚 1* 张昭 2 于俊林 1 ( 中国协和医科大学, 中国医学科学院药用植物研究所, 北京 100094) 2 ( 通化师范学院化学系, 吉林通化 134002) 摘要 : 黄檗 (Phellodendron amurense) 是我国珍贵的药用和用材树种, 现已被列为国家二级保护植物 为了研究其遗传多样性和遗传结构, 以制定有针对性的保护策略, 作者采用 8 对荧光引物, 对来自 10 个野生种群共计 129 个黄檗个体进行了 AFLP 分析 共扩增出 1,704 条谱带, 其中多态带 1,581 条 遗传分化系数 G st 为 0.3420, 即有 34.20% 的遗传变异来自种群间 黄檗物种水平的遗传多样性高于种群水平 : 在物种水平上, 多态位点百分率 PPL =92.77 %, 有效等位基因数 N e =1.4636, Nei s 基因多样性指数 H=0.2316, Shannon 信息指数 I=0.4275; 在种群水平上, PPL =54.20%, N e =1.2487, H=0.1524, I=0.2371 UPGMA 聚类结果表明, 黄檗野生种群可分为四类, 并且来自同一地区的黄檗个体有聚为一类的趋势, 说明其遗传变异可能与生境有关 建议在各种群内大量采样, 实施迁地保护 ; 在长白山 完达山 大兴安岭 小兴安岭 千山以及燕山山脉的云蒙山等地区, 均匀布点划分区域进行就地保护, 保护种群完整性, 促进种群自我更新 关键词 : 珍稀濒危药用植物, Phellodendron amurense, AFLP, 遗传多样性, 濒危种, 保护 Genetic diversity in wild populations of Phellodendron amurense, a rare and endangered medicinal plant, detected by AFLP Zhifeng Yan 1, Bengang Zhang 1, Zhao Zhang 1*, Junlin Yu 2 1 Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100094 2 Department of Chemistry, Tonghua Normal College, Tonghua, Jilin 134002 Abstract: Phellodendron amurense is a rare and endangered medicinal plant in China. We assessed the genetic diversity within and among populations of this species using AFLP. A total of 129 individuals from 10 wild populations were detected by eight pairs of AFLP primers. These primers generated a total of 1,704 bands, of which 1,581 were polymorphic. The results revealed a high level of genetic diversity. At species level, the percentage of polymorphic loci (PPL) was 92.77%, the effective number of alleles per locus (N e ) was 1.4636, Nei s gene diversity (H) was 0.2316, and Shannon s information index (I) was 0.4275, respectively. At population level, the estimates of PPL =54.20%, N e =1.2487, H=0.1524 and I=0.2371. The coefficient of genetic differentiation (G st ) was 0.3420. UPGMA cluster analysis showed that there was a possible correlation between genetic variance and habitat differences. As a conclusion, we propose that conservation of P. amurense should be in their natural habitats, including Mts. Changbaishan, Wandashan, Daxing anling, and Xiaoxing anling, Qianshan and Yanshan. At the same time, the preservation of germplasm resources in botanical gardens should be carried out by sampling more individuals from multiple sites. Key words: rare and endangered medicinal plant, Phellodendron amurense, AFLP, genetic diversity, endangered species, conservation 收稿日期 : 2006-03-01; 接受日期 : 2006-08-30 基金项目 : 国家中医药管理局科学技术研究专项 濒危中药材关黄柏野生资源抚育基础研究 和北京市教委重点学科共建项目 (XK100230448) 濒危药用植物黄檗野生种群自我更新障碍机制研究 * 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: zhangzhao1962@tom.com
第 6 期闫志峰等 : 珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的 AFLP 分析 489 芸香科植物黄檗 (Phellodendron amurense) 系第三纪古热带植物区系的孑遗物种, 是我国珍贵的药用和用材树种 其树皮内皮层可入药, 为常用中药材关黄柏的主要来源 黄檗广泛分布于我国东北大兴安岭东南部 小兴安岭 长白山 完达山 千山及华北燕山山脉以北等地, 由于长期过量采伐, 资源量越来越少, 野生黄檗的生存状况十分严峻 在 中国植物红皮书 第一册中, 黄檗被列为渐危种, 国家二级保护植物 ( 傅立国, 1992) 实地考察发现, 野生黄檗多散生分布, 天然林的黄檗种群实生小苗较少 ( 于俊林等, 2006) 近年来有关黄檗的研究主要集中于植物化学和药理学方面 ( 张煊等, 2003), 在生物学特性 (Zhou et al., 2004) 生态特性( 鲁长虎等, 2004) 及人工栽培方面也有报道, 有关资源保护及可持续利用的工作较少 ( 秦彦杰等, 2006), 迄今对其遗传多样性和遗传结构知之甚少, 以至于无法确定原地保护区域和迁地保护的取样种群进而提出有针对性的保护策略 了解濒危物种的遗传结构和遗传多样性水平, 可以提高对种群动力学 适应和进化机制的认识, 对探讨物种濒危机制 自然保护区的规划 指导迁 地保护及引种栽培以及种群的保护价值评估等有着重要意义 (Petit et al., 1998; Grassi et al., 2005) AFLP(amplified fragment length polymorphisms) (Vos et al., 1995) 是一种高效的显性遗传标记, 结合了 RFLP 的专一性和 RAPD 技术的随机性 高效性, 是新一代的分子标记技术, 广泛用于植物遗传多样性研究 ( 闫志峰等, 2005) 利用 AFLP 技术已分析了濒危植物岷江柏 (Cupressus chengiana)( 姚莉等, 2005) 元宝山冷杉(Abies yuanbaoshanensis)( 王燕等, 2004) 银桦(Grevillea scapigera)(krauss et al., 2002) Hebe speciosa(armstrong & DeLange, 2005) 等的遗传结构 本文采用 AFLP 技术检测了 10 个黄檗野生种群的遗传多样性, 并结合实际调查及以往的研究积累, 提出了黄檗的具体保护策略和措施, 以期为有效的保护实践提供依据 1 材料与方法 1.1 材料根据文献调研以及对中国国家植物标本馆 药用植物研究所标本馆馆藏黄檗标本的考证, 确定了黄檗的 10 个可能野生种群 ( 表 1, 图 1), 并实地采 图 1 黄檗分布区和采样点位置图 ( 种群代号同表 1) Fig. 1 Distribution map and the locations of sampled populations of Phellodendron amurense. The population codes are the same as in Table 1.
490 生物多样性 Biodiversity Science 第 14 卷 表 1 黄檗 10 个野生种群的取样情况 Table 1 The ten natural Phellodendron amurense populations sampled in the study 种群代号 Population code 云蒙山 YM 清原 A 桓仁 B 千山 C 通化 TH 湾沟 WG 抚松 FS 帽儿山 MS 桃山 TS 桦南 HN 采集地点 Collecting site 北京云蒙山 Mt. Yunmeng, Beijing 辽宁省清原县英额门镇 Ying emen Town, Qingyuan County, Liaoning 辽宁省桓仁县老秃顶子国家级自然保护区 Laotudingzi National Nature Reserve, Huanren County, Liaoning 辽宁省仙人台国家森林公园 Xianrentai National Forest Park, Liaoning 吉林省通化市白鸡腰子国家森林公园 Baijiyaozi National Forest Park, Tonghua City, Jilin 吉林省江源县湾沟镇 Wangou Town, Jiangyuan County, Jilin 吉林省抚松县万良镇 Wanliang Town, Fusong County, Jilin 黑龙江省尚志市帽儿山 Mt. Maoershan, Shangzhi City, Heilongjiang 黑龙江省铁力市桃山镇 Taoshan Town, Tieli City, Heilongjiang 黑龙江省桦南县红光林场 Hongguang Forestry Centre, Huanan County, Heilongjiang 生境 Habitat 燕山山脉, 山坡 Hillside of Mt. Yanshan 长白山余脉, 山坡 Hillside of Mt. Changbai 长白山龙岗支脉, 山坡, 路旁 Longgang branch of Mt. Changbai, hillside and roadside 长白山山系千山山脉, 山坡 Hillside of Mt. Qianshan 长白山西南部的老岭山脉, 山坡 Mt. Laoling to the southwest of Mt. Changbai, hillside 长白山脉, 山坡, 路旁 Hillside or roadside of Mt. Changbai 长白山脉, 路旁 Mt. Changbai, roadside 张广才岭低山丘陵地带 Foothill of Mt. Zhangguangcailing 小兴安岭西坡南麓, 路旁 Southern foot of western hillside of Mt. Xiaoxing anling 完达山脉, 低山坡 Low slope of Mt. Wanda 伴生植物 Companioned plants 蒙古栎 糠椴等乔木树种 Quercus mongolica, Tilia mandshurica and other wood species 杨 核桃楸 柞树 水曲柳等 Populus davidiana, Juglans mandshurica, Quercus mongolica, Fraxinus mandshurica 水曲柳和蒙古栎等 Fraxinus mandshurica, Quercus mongolica 油松及阔叶树种 Pinus tabuliformis and dicotyledonous wood species 核桃楸 水曲柳 紫椴等 Juglans mandshurica, Fraxinus mandshurica, Tilia amurensis 椴树 落叶松 白桦树 水曲柳等 Tilia sp., Larix olgensis, Betula platyphylla, Fraxinus mandshurica 核桃楸 柞树 水曲柳 椴树 Juglans mandshurica, Quercus mongolica, Fraxinus mandshurica, Tilia sp. 杨树 白桦 蒙古栎等 Populus davidiana, Betula platyphylla, Quercus mongolica 水曲柳 红松 核桃楸等 Fraxinus mandshurica, Pinus koraiensis, Juglans mandshurica 水曲柳, 柞树 白桦 红松等 Fraxinus mandshurica, Quercus mongolica, Betula platyphylla, Pinus koraiensis 取样数 Sample size 由于数据较多, 经纬度和海拔为所采样点的平均值 Owing to quite a number of data, the longitude, latitude and altitude of the sampling site is mean value, respectively. 经纬度 * Longitude and latitude 8 40 33 18"N 116 40 50"E 10 42 07 4.8"N 125 05 13.3"E 14 41 19 22.7"N 124 54 37.8"E 7 40 59 41.3"N 123 07 50"E 15 41 33 45.6"N 126 05 38"E 15 42 05 50"N 127 00 27"E 15 42 29 55"N 127 17 05"E 15 45 25 35.4"N 127 38 43.5"E 15 46 54 48.6"N 128 25 34.8"E 15 46 09 40.8"N 131 4 52.7"E 海拔 * Altitude (m) 650 441.6 780.8 468.9 854.8 878.2 636 391.7 318.8 341 样 利用 Magellan GPS 仪对取样样本进行定位, 样本间距离原则上超过 100 m, 利用 Mapsend 软件传输 编辑航点信息 采无病虫害的幼嫩叶片以 10 倍 量的变色硅胶 ( 青岛海洋化工有限公司 ) 在 12 h 内快速干燥 1.2 总 DNA 提取
第 6 期闫志峰等 : 珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的 AFLP 分析 491 称取 0.2 g 干燥黄檗嫩叶, 用 CTAB 法 (Doyle & Doyle., 1987; 邹喻苹等, 2001) 提取基因组 DNA, 0.8% 琼脂糖电泳检测 DNA 的纯度 完整性及产量 1.3 AFLP 分析 AFLP 分析参照 Vos 等 (1995), 酶切和连接采用一步法进行, 预扩增反应参考北京鼎国生物技术有限公司 FISH-AFLP 试剂盒说明 利用 2 组 DNA 样品 YM1 YM2 从 64 对 Pst Ⅰ/MseⅠ 引物对中筛选出扩增图谱清晰的 8 对进行选择性扩增反应 ( 表 2) 1.3.1 酶切和连接在 0.5 ml 离心管中加入 ( 反应体系总体积为 20 µl): 4 µl DNA; 2.5 µl 10 buffer; 2.5 µl ATP (10 mmol/l); 1 µl adapter; 2 µl Pst I/Mse I enzyme; 1 µl T4 DNA Ligase; 7 µl AFLP-Water 混匀离心数秒, 37 保温 5 h,8 保温 4 h, 4 过夜 1.3.2 预扩增和选择性扩增预扩增参考 AFLP 试剂盒说明 选择性扩增 ( 反应体系总体积为 25 µl) 体系中含有 : 2 µl 预扩模板 ; 2.5 µl 10 PCR buffer; 0.5 µl dntps(10 mmol); 1 µl Pst I primer (50 ng/µl); 1 µl Mse I primer (50 ng/µl); 0.5 µl Taq 聚合酶 (5 U/µL); 补足 17.5 µl ddh 2 O 按下列参数在 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA) 上进行 PCR 循环 : 94 30 s, 65 30 s, 72 80 s; 以后每轮循环温度递减 0.7, 扩增 12 轮 ; 最后按下列参数扩增 23 轮 : 94 30 s, 55 30 s, 72 80 s 1.3.3 扩增产物的凝胶电泳分析本研究采用荧光标记引物扩增产物在自动测序仪上扫描鉴定, 克服了银染过程中人为因素的影响, 使操作和数据分析全部自动化, 因而高效 灵敏 取 1 μl PCR 产物 +1 μl 内标 (Gene mark 500) 在 377 DNA 自动测序仪 (ABI Prism TM 377 DNA Sequencer) 上于 4% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳 2.4 h, 利用 Run Module: GS Run 36F-2400 软件自动采集电泳胶图 1.4 数据分析利用 GeneScan 3.1 软件将 129 个个体 8 对引物 表 2 AFLP 接头和引物序列 Table 2 The adapters and primers sequence in the AFLP experiment DNA 接头和引物 Adapter and primer 核苷酸序列 Sequence of the nucleotide acid 备注 Remark Pst I 接头 1 Pst I adapter 1 5 -CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3 连接接头 Link adapter Pst I 接头 2 Pst I adapter 2 5 - TGT ACG CAG TCT AC-3 连接接头 Link adapter Mse I 接头 1 Mse I adapter 1 5 -GAC GAT GAG TCC TGA G-3 连接接头 Link adapter Mse I 接头 2 Mse I adapter 2 5 -TAC TCA GGA CTC AT-3 连接接头 Link adapter Pst I 引物 Pst I primer Pst I 预扩引物 5 -GAC TGC GTA CAT GCA G- 3 预扩增 Pre-amplification Pst I primer in pre-amplification P-GAA Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GAA 选择性扩增 Selective amplification P-GAC Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GAC 选择性扩增 Selective amplification P-GAG Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GAG 选择性扩增 Selective amplification P-GAT Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GAT 选择性扩增 Selective amplification P-GTA Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GTA 选择性扩增 Selective amplification P-GTC Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GTC 选择性扩增 Selective amplification P-GTT Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GTT 选择性扩增 Selective amplification P-GTG Primer 5 -GAC TGC GTA CAT GCA GTG 选择性扩增 Selective amplification Mse I 引物 Mse I primer Mse I 预扩增引物 5 > GAT GAG TCC TGA GTA A C-3 预扩增 Pre-amplification Primer in pre-amplification M-CAA FAM 标记 MseI-1: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A 选择性扩增 Selective amplification M-CAC FAM 标记 MseI-2: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C 选择性扩增 Selective amplification M-CAG FAM 标记 MseI-3: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G 选择性扩增 Selective amplification M-CAT FAM 标记 MseI-4: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T 选择性扩增 Selective amplification M-CTA FAM 标记 MseI-5: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A 选择性扩增 Selective amplification M-CTC FAM 标记 MseI-6: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C 选择性扩增 Selective amplification M-CTG FAM 标记 MseI-7: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G 选择性扩增 Selective amplification M-CTT FAM 标记 MseI-8: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T 选择性扩增 Selective amplification
492 生物多样性 Biodiversity Science 第 14 卷 产生的电泳胶图转化为 0 1 数据矩阵, 采用 NTSYSpc Version 2.11f 软件包进行结果分析 (Rohlf, 2000), 根据内标确定片段大小, 计算样品间的 Nei & Li 相似性系数 DICE (Nei & Li, 1979), 并进行聚类分析 利用 POPGENE Version 1.31 (Yeh et al., 1997) 软件计算如下遗传多样性参数 : 多态位点百分率 (PPL) 等位基因平均数(N a ) 有效等位基因数(N e ) Nei s 基因多样性指数 (H), Shannon 信息指数 (I) 以及 Nei s 遗传距离 (D) 和遗传一致度 (I), 并采用 MEGA 3.0 软件 (Kumar et al., 2004) 对遗传距离 (D) 进行非加权算术平均聚类分析 (UPGMA) Nei (1973) 把总基因多样度 (H t ) 分解为种群内基因多样度 (H s ) 和种群间基因多样度 (D st ), 即 : H t =H s +D st, 而种群的基因分化系数 G st =D st /H t =(H t H s )/H t 根据 McDermott 和 McDonald(1993) 的方法计算基因流强度的每代迁移数 N m = 0.5(1 G st )/G st 采用 NTSYSpc 2.11f 软件的 Mantel 检验分析 10 个种群间遗传距离与地理距离的相关性 2 结果 2.1 黄檗个体遗传相似性系数和聚类分析利用 NTSYSpc 2.11 分析软件计算 Nei & Li 相似性系数, 并利用 UPGMA 聚类分析 ( 图 2), 其中, A8 与 A9 的相似性最高, 为 0.8361 在相似系数为 0.5 附 近大致可分为四类 : 云蒙山 清原和桓仁的个体聚在一起, 在更低的相似系数上与桃山与桦南种群聚为 Ⅰ 类 ; 帽儿山与通化地区种群聚为 Ⅱ 类 ; 抚松与湾沟聚为 Ⅲ 类 ; 千山地区种群单独聚为 Ⅳ 类 结果表明 : 实验可把所有抽样个体区分开来, 并且来自同一地区的黄檗个体有聚为一类的趋势 2.2 物种和种群水平的遗传多样性扩增片段长度为 50 500 bp, 129 个野生黄檗个体经过 8 对荧光引物扩增共得到 1,704 条清晰的谱带, 其中多态带 1,581 条, 多态位点百分率为 92.77% Shannon 信息指数 I=0.4275, Nei s 基因多样性指数 H=0.2316, 有效等位基因数 N a =1.9749( 表 3), 表明黄檗在物种水平上具有较高的遗传多样性 多态位点百分率 (PPL) 是应用广泛的多样性指标 在所研究的种群中, 湾沟种群的 PPL 最高, 为 64.08%, 平均多态位点百分率为 54.20% 其排序为: 湾沟 (WG)> 通化 (TH)> 抚松 (FS)> 桃山 (TS)> 帽儿山 (MS)> 桓仁 (B)> 清原 (A)> 桦南 (HN)> 云蒙山 (YM)> 千山 (C) (46.70%) Shannon 信息指数 (I) 分析结果 ( 表 3) 显示, 湾沟种群最高, 为 0.2679, 黄檗种群内的平均 I 为 0.2371 其排序为 : 湾沟 (WG)> 通化 (TH)> 桓仁 (B)> 抚松 (FS)> 清原 (A)> 桃山 (TS)> 云蒙山 (YM)> 帽儿山 (MS)> 桦南 (HN)> 千山 (C) (0.1921) AFLP 分析表明, 黄檗种群水平的观察等位基因数 N a =1.5420, 表 3 黄檗的 10 个种群的遗传多样性水平 Table 3 Genetic variation of the ten natural populations of Phellodendron amurense 种群 Population 样本数 Sample size 多态位点百分率 PPL (%) 观察等位基因数 N a 有效等位基因数 N e Nei s 基因多样性 H Shannon 信息指数 I 云蒙山 YM 8 46.70 1.4670 1.2654 0.1555 0.2347 清原 A 10 49.43 1.4943 1.2602 0.1566 0.2390 桓仁 B 14 54.72 1.5472 1.2760 0.1647 0.2522 抚松 FS 15 60.96 1.6096 1.2454 0.1556 0.2473 湾沟 WG 15 64.08 1.6408 1.2711 0.1699 0.2679 帽儿山 MS 15 55.70 1.5570 1.2347 0.1460 0.2299 通化 TH 15 63.25 1.6325 1.2758 0.1704 0.2666 桃山 TS 15 58.80 1.5880 1.2384 0.1494 0.2369 桦南 HN 15 48.03 1.4803 1.2158 0.1313 0.2042 千山 C 7 40.36 1.4036 1.2039 0.1247 0.1921 种群水平 Population level 54.20 1.5420 1.2487 0.1524 0.2371 物种水平 Species level 129 92.77 1.9749 1.4636 0.2316 0.4275 种群代号同表 1 Population codes are the same as in Table 1
第 6 期闫志峰等 : 珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的 AFLP 分析 493 图 2 黄檗个体相似性系数的 UPGMA 聚类分析图 ( 英文字母所代表的种群代号同表 1) Fig. 2 UPGMA dendrogram of Phellodendron amurense based on Nei & Li similarity coefficient. Population codes are given in Table 1.
494 生物多样性 Biodiversity Science 第 14 卷 有效等位基因数 N e =1.2487 2.3 种群遗传分化 Nei s 基因多样性指数 (H) 是衡量种群遗传分化最常用的指标之一, 为总的遗传变异中种群间变异所占的比例 本研究结果显示 ( 表 3), 通化和湾沟种群具有稍高的 Nei s 基因多样性, 而辽宁千山种群的最低 10 个种群的 Nei s 基因多样性指数分别为通化 (TH)(0.1704)> 湾沟 (WG)> 桓仁 (B)> 清原 (A)> 抚松 (FS)> 云蒙山 (YM)> 桃山 (TS)> 帽儿山 (MS)> 桦南 (HN)> 千山 (C)(0.1247), 平均基因多样性指数为 0.1524 2.4 种群间遗传距离及其 UPGMA 聚类分析遗传距离 (D) 反映了种群间的遗传分化程度 黄檗种群的遗传距离在 0.0101 0.1688 之间, 其中抚松种群与湾沟种群的遗传距离最小, 为 0.0101; 抚松种群与云蒙山种群遗传分化较大, 遗传距离为 0.1688( 表 4) 根据 10 个种群的遗传距离进行 UPGMA 聚类分 表 4 黄檗种群间的地理距离 (km) ( 对角线上方 ) 与遗传距离 (D) ( 对角线下方 ) Table 4 Geographic distance (km)(above diagonal) and genetic distance (D) (below diagonal) between the ten natural populations of Phellodendron amurense 种群 云蒙山 清原 桓仁 抚松 湾沟 帽儿山 通化 桃山 桦南 千山 Population YM A B FS WG MS TH TS HN C 云蒙山 YM **** 749 651 966 921 1,039 865 1,183 1,311 611 清原 A 0.0483 **** 105 238 177 415 116 600 622 245 桓仁 B 0.0461 0.0478 **** 341 279 503 215 691 720 158 抚松 FS 0.1688 0.1385 0.1502 **** 112 219 159 405 384 473 湾沟 WG 0.1594 0.1342 0.1451 0.0101 **** 332 72 512 470 401 帽儿山 MS 0.1495 0.1389 0.1395 0.0825 0.0973 **** 376 190 295 654 通化 TH 0.1319 0.1176 0.1131 0.0806 0.0919 0.0229 **** 558 545 332 桃山 TS 0.1224 0.0914 0.0948 0.0673 0.0769 0.0877 0.0701 **** 263 847 桦南 HN 0.1270 0.1000 0.0922 0.0916 0.0987 0.1108 0.0856 0.0209 **** 864 千山 C 0.1593 0.1483 0.1477 0.0709 0.0689 0.1154 0.1067 0.1084 0.1347 **** 种群代号同表 1 Population codes are the same as in Table 1 图 3 黄檗 10 个种群的 UPGMA 聚类图 ( 种群代号同表 1) Fig. 3 A dendrogram of ten Phellodendron amurense populations based on Nei s genetic distances by UPGMA clustering analysis. Population codes are the same as in Table 1.
第 6 期闫志峰等 : 珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的 AFLP 分析 495 析 ( 图 3), 结果显示, 在遗传距离 0.045 附近明显分为四类 : 云蒙山 桓仁和清原地区种群聚为一类 ; 抚松 湾沟和千山种群聚为一类 ; 帽儿山 通化地区种群聚为一类 ; 桃山与桦南种群聚为一类 这与个体的聚类分析结果相似 经 Mantel 检验, 种群的地理距离与遗传距离之间显示正相关, 但未达到显著性水平 (r=0.299, P=0.975) 3 讨论 3.1 黄檗的遗传多样性水平和遗传结构分析黄檗物种水平的多态位点百分率为 92.77%, 与生境基本相同并同样存在野生种群自我更新障碍的蒙古栎 (Quercus mongolica)(ppl=96.8%) 相当, 显示了较高的遗传多样性 ; 黄檗种群水平的平均多态位点百分率为 54.2%, 低于蒙古栎 (67.2%) 和辽东栎 (Q. liaotungensis) (67.6%) 黄檗的平均 Shannon 信息指数为 0.2371, 平均 Nei s 遗传多样性 (H s )0.1524, 与濒危植物元宝山冷杉的 0.1510 相当 ( 李文英等, 2003; 王燕等, 2004) 由此可见, 其不同种群均保持较高水平的遗传多样性, 并未表现出遗传变异的下降, 具有这一特点的物种还有裂叶沙参 (Adenophora lobophylla) 和 Pinus rzedowskii ( 葛颂和洪德元, 1999; Delgado et al., 1999) 等 经实地调查, 黄檗野生种群较小 据现有文献资料, 由于历史和生物自身的原因, 一些分布很广的物种为躲避冰期 / 间冰期的自然灾害, 在山区形成许多高度散生分布的小种群 (Vogel et al., 1999; 向巧萍, 2001) 黄檗作为第三纪古热带植物区系的孑遗物种, 历史上是否曾为了躲避第四纪冰期温度的剧烈变化而形成散生小种群呢? 这一假设需要古生物学的证据进一步验证 据我们所知, 作为名贵中药材和优质木材, 黄檗长期被大量砍伐, 造成生境的片断化和种群规模变小, 野外已经很少有成片分布的种群, 现存多是在次生林中 相互隔离的小种群使黄檗的遗传变异性减少, 使这些种群具有较高的灭绝风险 (Knaepkens et al., 2004) 种群间和种群内的基因流可以阻止遗传变异的减少和种群分化 利用 AFLP 在内的多种 DNA 标记方法对 Copaifera langsdorfii Myracrodruon urundeuva Cedrela fissilis 等多个树种天然种群的遗传结构进行分析表明, 种群间遗传分化系数为 0.10 0.30 ( 李斌等, 2001) 我们检测到黄檗的遗传分 化系数为 0.3420, 说明黄檗种群间存在较大的遗传分化 种群间的基因流 N m 为 1.0479, 低于异交植物的平均值 3.5( 陈小勇, 1996) 由于黄檗为雌雄异株 虫媒花, 且个体相隔较远, 为昆虫传粉带来不便 ; 种子主要靠重力 动物 风力等传播, 而远距离传播主要靠斑鸫 (Turdus naumanni) 北朱雀 (Carpodacus roseus) 等食种子鸟类 ( 常家传和鲁长虎, 2000; 鲁长虎等, 2004) 近年来, 由于生态环境的破坏, 鸟类和传粉昆虫大量减少, 限制了基因流的强度, 造成黄檗基因流减小, 从而使遗传漂变在种群分化中起很大作用 : 这可能是造成黄檗种群水平遗传变异小的原因 3.2 黄檗的种群保护策略根据黄檗的遗传结构特点和生存现状, 应该加强宣传教育力度, 严禁盗伐黄檗林的行为 ; 加强植物园的迁地保护和种质资源保存, 充分考虑遗传结构进行合理取样, 尽可能选择环境差异大的地段的较多个体进行有针对性的保护, 丰富现有种质圃资源 ( 金燕和卢宝荣, 2003) 在实施就地保护时, 还应考虑黄檗的遗传结构和药材品质, 并结合当地的自然环境和保护设施等情况, 确定重点保护区域, 既重视保护黄檗的高水平遗传多样性种群, 又兼顾低水平地区稀有基因的存在 根据聚类分析结果, 尤其要重视黄檗的就地保护, 严格禁止毁林种参, 保护黄檗的传粉昆虫和传播种子的鸟类 在黄檗的自然分布范围内, 建议优先选择如下不同生态环境的地区 : 长白山 完达山 大兴安岭 小兴安岭 千山以及燕山山脉的云蒙山地区, 均匀布点划分保护区域, 保护野生种群的完整性, 促进自然更新, 逐步恢复重建黄檗天然种群规模 为防止该物种的遗传退化, 防止基因污染, 应积极创造适宜条件促进黄檗种子的原地萌发, 实施就地人工抚育, 恢复种群规模, 建立许多就地保护的异质种群 (Krauss et al., 2004) 关于黄檗的主要分布区域和遗传多样性中心还需要开展黄檗的资源调查工作和扩大取样数量进行深入研究 针对黄檗成年树下无实生苗的现象, 还要开展生理学 生态学 传粉生物学 植物化感等方面的研究工作, 探明其机制 致谢 : 黑龙江中医药大学王振月教授 抚松人参研
496 生物多样性 Biodiversity Science 第 14 卷 究所刘廷慧农艺师 老秃顶子自然保护区朱叶平科长以及东北林业大学秦彦杰硕士等在样品采集上给予了大力帮助, 在此表示衷心感谢 参考文献 Armstrong TJ, DeLange PJ (2005) Conservation genetics of Hebe speciosa (Plantaginaceae) an endangered New Zealand shrub. Botanical Journal of the Linnean Society, 149, 229 239. Chang JC ( 常家传 ), Lu CH ( 鲁长虎 ) (2000) Dusky thrush and Amur Corktree in nature ecosystem. Chinese Journal of Ecology ( 生态学杂志 ), 19(1), 70 71. (in Chinese with English abstract) Chen XY ( 陈小勇 ) (1996) Gene flow of plants and its role in the conservation of endangered plants. Chinese Biodiversity ( 生物多样性 ), 4, 97 102. (in Chinese with English abstract) Delgado P, Pinero D, Chaos A, Perez-Nasser N, Alvarez-Buylla ER (1999) High population differentiation and genetic variation in the endangered Mexican pine Pinus rzedowskii (Pinaceae). American Journal of Botany, 86, 669 676. Doyle JJ, Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19, 11 15. Fu LK( 傅立国 ) (1992) China Plant Red Data Book: Rare and Endangered Plants ( 中国植物红皮书 稀有濒危植物 ). Science Press, Beijing. (in Chinese) Ge S( 葛颂 ), Hong DY( 洪德元 ) (1999) Studies of morphological and allozyme variation of the endangered Adenophora lobophylla and its widespread congener A. potaninii. Acta Genetica Sinica ( 遗传学报 ), 6, 410 417. (in Chinese with English abstract) Grassi F, Cazzaniga E, Minuto L, Peccenini S, Barberis G, Basso B (2005) Evaluation of biodiversity and conservation strategies in Pancratium maritimum L. for the Northern Tyrrhenian Sea. Biodiversity and Conservation, 14, 2159 2169. Jin Y ( 金燕 ), Lu BR ( 卢宝荣 ) (2003) Sampling strategy for genetic diversity. Biodiversity Science ( 生物多样性 ), 11, 155 161. (in Chinese with English abstract) Knaepkens G, Bervoets L, Verheyen E, Eens M (2004) Relationship between population size and genetic diversity in endangered populations of the European bullhead (Cottus gobio): implications for conservation. Biological Conservation, 115, 403 410. Krauss SL, Dixon B, Dixon KW (2002) Rapid genetic decline in a translocated population of the endangered plant Grevillea scapigera. Conservation Biology, 16, 986 994. Kumar S, Tamura K, Nei M (2004) MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, 5, 150 163. Li B ( 李斌 ), Gu WC ( 顾万春 ), Chen XY ( 陈晓阳 ) (2001) The application of AFLP molecular marker in research on biological germplasm resources. World Forestry Research ( 世界林业研究 ), 14(4), 11 17. (in Chinese with English abstract) Li WY ( 李文英 ), Gu WC ( 顾万春 ), Zhou SL ( 周世良 ) (2003) AFLP analysis on genetic diversity of Quercus mongolica populations. Scientia Silvae Sinicae ( 林业科学 ), 39(5), 29 36. (in Chinese with English abstract) Lu CH ( 鲁长虎 ), Chang JC ( 常家传 ), Xu Q ( 许青 ) (2004) Regeneration of Phellodendron amurense and its seed dispersal by frugivorus birds. Chinese Journal of Ecology ( 生态学杂志 ), 23(1), 24 29. (in Chinese with English abstract) McDermott JM, McDonald BA (1993) Gene flow in plant pathosystems. Annual Review of Phytopathology, 31, 353 373. Nei M (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 70, 3321 3323. Nei M, Li WH (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 5269 5273. Petit RJ, Mousadik AE, Pons O (1998) Identifying populations for conservation on the basis of genetic markers. Conservation Biology, 12, 844 855. Qin YJ( 秦彦杰 ), Wang Y( 王洋 ), Yan XF( 阎秀峰 ) (2006) Status and sustainable utilization strategy of Phellodendron amurense resources in China. Chinese Traditional and Herbal Drugs ( 中草药 ), 37, 1104 1107. (in Chinese) Rohlf FJ (2000) NTSYS-pc2.11: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Exeter Publishing Ltd, Setauket, New York. Vogel JC, Rumsey FJ, Schneller J, Barrett JA, Giby M (1999) Where are the glacial refugia in Europe? Evidence from pteridophytes. Biological Journal of the Linnean Society, 66, 23 37. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Friters A, Pot J, Paleman J, Kuiper M, Zabean M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407 4414. Wang Y ( 王燕 ), Tang SQ ( 唐绍清 ), Li XK ( 李先琨 ) (2004) The genetic diversity of the endangered plant Abies yuanbaoshanensis. Biodiversity Science ( 生物多样性 ), 12, 269 273. (in Chinese with English abstract) Xiang QP ( 向巧萍 ) (2001) A preliminary survey on the distribution of rare and endangered plants of Abies in China. Guihaia ( 广西植物 ), 21(2), 113 117. (in Chinese) Yan ZF ( 闫志峰 ), Zhang BG ( 张本刚 ), Zhang Z ( 张昭 ), Xia
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